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INTRODUCCIÓN 
La muerte celular comenzó a considerarse como un fenómeno fisiológico e 
importante dentro del proceso de desarrollo de los organismos poco después del 
descubrimiento, realizado sobre la mitad del siglo XIX, de que los organismos estaban 
compuestos por células. Las primeras observaciones de muerte celular fisiológica 
fueron realizadas en la metamorfosis de anfibios por Vogt en 1842 y posteriormente 
se realizaron estas mismas descripciones en otros tejidos en desarrollo, tanto de 
invertebrados como de vertebrados. 
El concepto de "muerte celular programada" fue acuñado por Lockshin y 
Williams en 1964 y describía la muerte de las células que ocurría en lugares y 
momentos determinados como eventos programados dentro del plan de desarrollo del 
organismo. Años después, en 1972, Kerr, Wyllie y Currie a partir de una recopilación 
de evidencias morfológicas, establecieron las diferencias entre dos tipos de muerte 
celular. La patológica que ocurre, por ejemplo, en el centro de una lesión aguda como 
trauma o isquemia, está caracterizada por la ruptura celular y recibe el nombre de 
necrosis celular, y la fisiológica, que ocurre durante el desarrollo o la hemostasis del 
organismo, que mantiene la integridad de la célula y a la que Kerr y sus colaboradores 
llamaron apoptosis. Según este grupo, la muerte por apoptosis respondía a un 
programa de muerte intracelular que podía ser activado o inhibido por una variedad 
de estímulos, tanto fisiológicos como patológicos. 
En 1982 tuvo lugar un descubrimiento que abrió las puertas al estudio profundo 
de las bases moleculares y genéticas del proceso de apoptosis. Horvitz publicó los 
estudios genéticos realizados sobre el nematodo caenorhabditis elegans en los que se 
describieron los genes encargados del control y la ejecución de la apoptosis en este 
organismo. Gracias a la homología existente entre estos genes en c. elegans y 
organismos superiores, la apoptosis en este nematodo ha sido tomada como referente 
del proceso en todos los sistemas y esto ha podido identificar una parte importante de 
la red de mecanismos que lo controlan.
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DEFINICIÓN 
Se considera a la apoptosis como un mecanismo fisiológico de muerte (inherente 
al desarrollo celular), que se desencadena por diversas señales, las cuales pueden ser 
fisiológicas, o por estimulaciones exógenas ambientales. Estas señales pueden actuar 
sobre receptores de superficie y causar la activación en cascada de proteínas 
citoplasmáticas; ello trae como resultado la activación de un programa genético que 
conduce, generalmente, a la nucleólisis por la acción de las endonucleasas. Este 
mecanismo de muerte celular interviene en importantes fenómenos fisiológicos como: 
embriogénesis, mantenimiento de la homeostasia, renovación tisular y desarrollo y 
funcionamiento del sistema inmunitario. 
Los trastornos en la regulación de la apoptosis por diferentes vías, están 
presentes en la etiopatogenia de diversas enfermedades autoinmunes, 
neurodegenerativas, y también se sugiere que participen en el Síndrome de 
Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). 
Debido a que la apoptosis puede considerarse como un proceso de eliminación de 
células defectuosas, la desregulación de los genes que codifican las proteínas 
relacionadas con la apoptosis, puede ser la causa del desarrollo de diversos tumores.
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MODELO INICIAL: C.ELEGANS 
Dentro del estudio del proceso de apoptosis que se ha venido realizando a lo 
largo de los últimos años, resultó determinante la descripción de los genes implicados 
en la maquinaria de apoptosis del nematodo caenorhabditis elegans. C. elegans 
pertenece a un filo formado por: 
"Gusanos de piel lisa, no segmentados, con un cuerpo alargado, cilíndrico y forma 
afilada en el extremo. Incluye formas libres y parásitas, ambas acuáticas y terrestres" 
Es un organismo de aproximadamente 1mm de longitud, vive en el suelo sobre materia 
vegetal en descomposición, alimentándose de microorganismos. Su vida se prolonga a 
lo largo de 2-3 semanas durante las cuales se reproduce. El estudio de este nematodo 
fue iniciado en los años 60 por Sydney Brenner. 
La ventaja que proporciona c. elegans como sistema experimental es que posee 
959 células somáticas transparentes, que pueden ser estudiadas individualmente 
mediante microscopía, y 17800 genes diferentes que forman su mapa genético 
secuenciado íntegramente. Este organismo, a pesar de su simplicidad, desarrolla los 
procesos que en organismos superiores son motivo de estudio: embriogénesis, 
desarrollo, funcionamiento del sistema nervioso, comportamiento y envejecimiento. C. 
elegans representa el compromiso perfecto entre la simplicidad en su tratamiento y la 
complejidad de las funciones y los mecanismos que posee, regidas por genes que se 
han conservado a lo largo de la evolución hasta los mamíferos. 
La apoptosis juega un importante papel en el desarrollo embrionario de c. 
elegans. A partir de los estudios que Horvitz inició en 1986, se estableció el número y 
la localización de las células que morían por apoptosis durante el desarrollo y 
mediante el análisis de mutantes se describieron los genes implicados en este 
mecanismo. Estos genes se denominaron ced y se enumeraron desde el -1 al -10. Ced- 
3. -4 y -9 regulan la fase ejecutora de la apoptosis y el resto está implicado en los 
procesos de eliminación por fagocitosis de la célula apoptótica. Posteriormente se 
describió el gen EGL-1 que participa también en la regulación de la MCP. El complejo 
ejecutor formado por ced-3, -4 y -9 representa la imagen más simplificada del 
programa apoptótico que se puede encontrar en células de mamíferos. 
Cada una de las proteínas expresadas a partir de ellos son equivalentes a las que, 
en organismos superiores, constituyen los pilares que soportan la red de señalización 
de la apoptosis. CED-3 es una proteasa equivalente a las caspasas de mamíferos, 
proteínas ejecutoras de la apoptosis que desmontan la maquinaria celular degradando 
un grupo seleccionado de proteínas. CED-3 se activa por homodimerización y para 
hacerlo posible, existe otra proteína CED-4 capaz de interaccionar con ella y también 
consigo misma. La unión de CED-3 a CED-4 y la posterior homodimerización de esta,
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traería consigo la activación de CED-3. CED-4 tiene también su homologo en 
mamíferos, Apaf-1, que se une a procaspasa-9 y facilita su activación. La tercera 
proteína de esta maquinaria es CED-9, la pieza reguladora, que se une a CED-4 y la 
inhabilita para mediar la activación de CED-3, al impedir su homodimerización. 
Su interacción con una proteína pro-apoptótica como es EGL-1 en c. elegans, la 
separa de CED-4 dejándola realizar su función activadora de la apoptosis. En mamífero, 
esta proteína es equivalente a toda una familia con miembros tanto pro-apoptóticos 
como anti-apoptóticos que regulan el proceso de muerte celular. Las moléculas 
equivalentes entre los sistemas que se han mencionado anteriormente, presentan tal 
homología de secuencias que muestran que este sistema se ha mantenido totalmente 
conservado a lo largo de la evolución. Los componentes del sistema que parece que 
han sido de adquisición más recientes son los receptores de muertes, ya que ningún 
equivalente de ellos ha sido encontrado aún en c. elegans. 
De esta forma, el estudio del nematodo c. elegans estableció las bases para la 
caracterización, que hoy día aún es incompleta, de la compleja red de procesos que 
culminan con la apoptosis celular y que a continuación s e resumen.
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DIFERENCIAS ENTRE APOPTOSIS Y NECROSIS 
Mientras la apoptosis está caracterizada por una activa participación de la propia 
célula que está falleciendo, incluso hasta el punto de sintetizar de novo (en algunos 
tipos celulares) los efectores de su muerte celular, la necrosis es un proceso pasivo, 
catabólico y degenerativo. La necrosis también recibe otros nombres como muerte 
accidental u oncosis. La necrosis generalmente representa una respuesta celular a una 
lesión y puede ser inducida por una sobredosis de agentes citotóxicos, un choque de 
pH, hipertermia, hipoxia, trauma directo, un choque ácido, etc. Un acontecimiento 
temprano de la necrosis es la pérdida de control de la permeabilidad de la membrana 
plasmática. Como consecuencia de ello se establece un flujo anormal de iones hacia el 
interior celular que va acompañado de la entrada pasiva de agua. 
La entrada de agua provoca que tanto la célula como algunos de sus orgánulos 
membranosos (mitocondria, retículo endoplásmico, etc) se hinchen y finalmente 
estallen. Después la membrana plasmática se rompe y se liberan constituyentes 
citoplásmicos, incluyendo enzimas proteolíticas (Majno G, Wyllie AH ). En la cromatina 
nuclear aparecen áreas de condensación desigual y en núcleo sufre una lenta 
disolución (cariolisis). La necrosis desencadena una reacción inflamatoria en el tejido 
que a menudo produce formación de cicatriz. La degradación del DNA no es tan 
excesiva durante la necrosis como en la apoptosis, y los productos de degradación son 
de tamaño variable que forman bandas discretas en los geles de electroforesis. 
APOPTOSIS NECROSIS 
CAUSAS Falta factores de crecimiento 
Influencia hormonal 
Toxicidad suave 
Anoxia 
Daño físico o químico 
MORFOLOGÍA Célula encogida Célula inflada 
NÚCLEO Condensación 
Segmentación 
Fragmentación del ADN 
Degradación del ADN 
MEMBRANA CELULAR Protuberancias, cambios en 
la distribución de la 
fosfatidilserina 
Lisa, lisis 
MITOCONDRIA Cambios moleculares Inflamiento 
EXPRESIÓN Expresión génica 
Síntesis proteica 
Activación de proteasas 
------
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MORFOLOGÍA 
La apoptosis se considera, morfológica y bioquímicamente, diferente a la muerte 
celular por necrosis osmótica. En la necrosis, un grupo de células, ante estímulos 
externos, pierden la integridad de membrana alterando la regulación de la 
homeóstasis iónica celular y permitiendo un gran edema intracelular y la destrucción 
de organelas; como consecuencia se provoca una intensa respuesta inflamatoria que 
participará, igualmente, en la fagocitosis del detritus celular. 
Los rasgos morfológicos de la apoptosis difieren de los de la necrosis 
observándose mejor con microscopía electrónica. Inicialmente se produce la 
constricción de la membrana, disminuyendo el tamaño celular y agrupando las 
organelas, dándole al citoplasma un aspecto más denso. Los cambios nucleares son los 
rasgos más característicos. La cromatina se condensa en la periferia, por debajo de la 
membrana nuclear, en masas densas bien definidas. 
Posteriormente el núcleo se fragmenta, formándose, al mismo tiempo, vesículas 
citoplasmáticas y los denominados cuerpos de apoptosis. Estos cuerpos apoptóticos se 
componen de citoplasma y 70 organelas muy agrupadas, pudiendo contener también 
fragmentos nucleares, rodeados siempre de membrana. Los cuerpos de apoptosis 
serán fagocitados por las células sanas adyacentes del parénquima o por macrófagos, 
donde se degradaran con rapidez dentro de los lisosomas, gracias a su actividad 
enzimática. Seguidamente las células adyacentes serían capaces de migrar o proliferar 
reemplazando así el espacio ocupado por la célula apoptótica suprimida. 
La apoptosis afecta a células aisladas o racimos celulares pequeños. 
Histológicamente, con tinción de hematoxilina eosina, la célula apoptótica suele 
reconocerse como una masa redondeada u oval de citoplasma, fuertemente 
eosinófilo, con fragmentos de cromatina nuclear densa. La constricción celular y la 
formación de cuerpos apoptóticos tienen un comienzo abrupto con una duración de 
pocos minutos; sin embargo los cuerpos de apoptosis permanecen en el tejido 
aproximadamente 2 horas hasta que sean fagocitados y degradados.
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CARACTERISTICAS 
Una célula que va a sufrir apoptosis activa una cascada de eventos moleculares 
que culminan en su total desintegración. Muchos de estos cambios son característicos 
y parecen ser únicos a la apoptosis por lo que pueden ser utilizados para identificar 
este modo de muerte celular. 
Uno de los eventos más tempranos de la apoptosis es la deshidratación celular. 
La pérdida del agua intracelular conlleva la condensación del citoplasma y cambios en 
la forma y el tamaño celular: Las células que eran redondas originalmente aparecen 
elongadas y, generalmente, más pequeñas. Otro cambio, quizá el más característico de 
la apoptosis, es la condensación de la cromatina nuclear. La condensación comienza en 
la periferia nuclear, y la cromatina condensada a menudo adquiere una forma cóncava 
que se asemeja a una media luna. 
El DNA en la cromatina condensada presenta hipercromasia y se marca 
intensamente con sondas fluorescentes. La envuelta nuclear se desintegra, la laminilla 
sufre degradación proteolítica y, por último, se produce la fragmentación nuclear. 
Algunos fragmentos nucleares, que se tiñen uniformemente con sondas de DNA y que 
parecen gotitas de DNA de diferentes tamaños, están dispersos en el citoplasma. Estos
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fragmentos nucleares junto con los constituyentes del citoplasma (incluyendo 
orgánulos intactos), son empaquetados y envueltos por fragmentos de membrana 
plasmática. Estas estructuras, denominadas cuerpos apoptóticos, son emitidas por las 
células apoptóticas. Cuando la apoptosis sucede in vivo , los cuerpos apoptóticos son 
fagocitados por las células vecinas como fibroblastos o células epiteliales (y no 
necesariamente por macrófagos profesionales) sin desencadenar ninguna reacción 
inflamatoria en el tejido. 
La activación de endonucleasas que cortan preferencialmente en secciones 
internucleosomales es otra característica específica de la apoptosis. Los productos de 
la degradación del DNA son fragmentos nucleosomales u oligonucleosomales que 
generan el característico patrón en escalera en electroforesis de geles de agarosa. 
Como el DNA de las células apoptóticas está parcialmente degradado, la fracción de 
bajo peso molecular puede ser extraída fácilmente. 
Otra característica específica de la apoptosis es la preservación, al menos en la 
fase inicial de la apoptosis, de la integridad estructural y de la mayoría de las funciones 
de la membrana plasmática. También, los orgánulos celulares incluyendo la 
mitocondria y los lisosomas, permanecen preservados durante la apoptosis, aunque el 
potencial transmembrana de la mitocondria está enormemente decrementado. Otras 
características de la apoptosis son la movilización del catión calcio (Ca 2+ ) intracelular 
( McConkey DJ ), la activación de la transglutaminasa que une proteínas citoplásmicas, 
la pérdida de microtúbulos, pérdida de la asimetría de los fosfolípidos de la membrana 
plasmática que permite la exposición de la fosfatidilserina en la cara externa de la 
membrana plasmática, y otros cambios de la membrana plasmática que 
precondicionan a los restos de las células apoptóticas a ser objetivos de las células 
fagocíticas. 
La duración de la apoptosis puede variar, pero generalmente es corta (3-6 horas), 
incluso es más breve que la duración de la mitosis. De esta forma, bajo condiciones de 
homeostasis, cuando la proporción de células muertas está equilibrada por la tasa de 
proliferación celular, el índice mitótico puede exceder del índice apoptótico. 
Más recientemente apareció el término anoikis que es la apoptosis inducida por 
la pérdida de anclaje de la célula a la matriz extracelular o porque las interacciones 
célula-matriz son insuficientes o inapropiadas. Este proceso parece relacionado con las 
integrinas que son glucoproteínas integrales de la membrana plasmática que 
intervienen en la adhesión con las células de la matriz extracelular, en su migración, en 
la organización del citoesqueleto y en la transducción de señales. De hecho, Rytömaa 
et al comprueban que la pérdida de anclaje de determinadas células epiteliales 
provoca una fuerte activación de caspasa-8 y caspasa-3.
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FAMILIAS DE MOLÉCULAS IMPLICADAS EN EL PROCESO DE 
APOPTOSIS 
RECEPTORES DE MUERTE 
Las moléculas relacionadas con el proceso de apoptosis que se han mantenido a 
lo largo de la evolución, desde organismos como el c. elegans hasta los mamíferos, 
llevan a cabo un programa de apoptosis iniciado por señales que provienen del interior 
celular. 
Estas señales responden a eventos que comprometen el buen funcionamiento de 
la célula dentro del entorno donde está situada: pérdida de contacto con las células 
que la rodean, estrés celular o señales contradictorias y simultáneas en cuanto a la 
puesta en marcha o no, de su ciclo de división. Ante esta situación, en que la célula es 
potencialmente peligrosa para el sistema donde se encuentra integrada, se pone en 
marcha la maquinaria de apoptosis y es eliminada. 
Este sistema señalizador no puede sostener el tipo de apoptosis llamado 
"instructivo" en el cual a una célula que no ha sufrido ninguno de los daños 
mencionados anteriormente, se le dirige activamente hacia la apoptosis ya que su 
eliminación es necesaria para llevar a cabo determinado proceso fisiológico. Los 
mamíferos han desarrollado mecanismos para llevar a cabo esta forma de apoptosis 
que es especialmente importante dentro del sistema inmune. 
En la apoptosis "instructiva" tienen un papel fundamental los llamados 
receptores de muerte, situados en la superficie de la célula, y que reciben la señal de 
ligandos de muerte específicos para cada uno de ellos. Los receptores pueden dar la
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señal directamente a las caspasas en pocos segundos disparando así el programa de 
apoptosis. 
Los receptores de muerte pertenecen a la superfamilia del receptor de TNF 
(TNFR) cuyos miembros tienen en común un dominio extracelular rico en cisteína. Otro 
rasgo común a todas estas moléculas señalizadoras de apoptosis es la presencia de una 
secuencia situada en su dominio intracitoplasmático y que serviría para acoplar al 
receptor con el resto de la maquinaría apoptótica. 
Los receptores de muerte mejor caracterizados son los siguientes: 
CD95 (APO-1/Fas) 
Esta proteína fue identificada inicialmente mediante un Ac dirigido contra ella y 
que define un Ag presente en la superficie de células como linfocitos humanos B y T 
activados, algunas líneas tumorales de origen linfoide y otros tipos celulares como son 
los hepatocitos. El Ac contra CD95 se une a las células que lo expresan provocándoles 
apoptosis in vitro. Por otra parte, inyectando in vivo Ac anti-CD95 a ratones nu/nu con 
xenotransplantes de tumores humanos, eliminaban estos por apoptosis de sus células. 
El gen que codifica para la proteína CD95 en humano se encuentra en la 
localización 10q23 (cromosoma 10) y consiste en una serie de 9 exones interrumpidos 
por 8 intrones. El dominio extracelular de la proteína está formado por tres 
subdominios ricos en cisteínas, codificados por los exones 2, 3 y 4, mientras que la 
zona intracitoplasmática, incluida la región reguladora llamada "death domain" 
(dominio de muerte), se encuentra en el exón 9. 
El ligando fisiológico de CD95 se denomina CD95L y es una proteína perteneciente 
a la familia del TNF (tumor necrosis factor). CD95 se expresa de forma bastante 
general en los distintos tejidos. La proteína ha podido ser detectada en células 
epiteliales, fibroblastos, osteoblastos y ciertos tipos de endoteliales, además en ratón, 
el ARNm de la proteína se ha detectado abundantemente en timo, corazón hígado y 
ovario. 
Por otra parte, CD95L se expresa predominantemente en células T y NK 
activadas, así como de forma constitutiva en los tejidos que gozan de "privilegio 
inmune". Este patrón de expresión de ambas moléculas demuestra que deben tener 
implicación en una serie importante de procesos fisiológicos relacionados con el 
sistema inmune.
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Resulta importante a la hora de determinar el papel jugado por algunas 
moléculas, estudiar el efecto que tiene su pérdida de función en ratones "knockout". 
En el caso del par CD95/CD95L, existen ratones que portan las mutaciones 
homocigóticas lpr (lymphoproliferation) o gld (general lymphoproliferation disease), 
que se traducen por una pérdida de función de los genes CD95 y CD95L 
respectivamente. Estos ratones presentan una serie de alteraciones como son 
linfoadenopatías y esplenomegalia por acumulación de células de origen T CD4- CD8-, 
niveles elevados de autoAc y desordenes de carácter autoinmune e inflamatorio. 
En el caso de las moléculas CD95/CD95L, existe también un referente humano de 
la pérdida de su función, ya que se ha descrito en una serie de niños una mutación con 
carácter heterocigótico en el gen que codifica CD95. Esta mutación da lugar a un 
fenotipo similar al de los ratones lpr y gld, incluyendo linfoadenopatías, 
esplenomegalia, hipergammaglobulinemia y, de forma variable, una serie de 
alteraciones autoinmunes. Estos datos, tanto en ratón como en humano, han 
resultado de ayuda a la hora de establecer una serie de procesos fisiológicos en los 
que la implicación de la apoptosis mediada por la pareja de moléculas CD95/CD95L 
está perfectamente demostrada. 
Estos procesos son: 
Modulación negativa de la respuesta inmune mediante la muerte por apoptosis de las 
células T activadas una vez realizada su función. De esta forma se evita su 
acumulación. También parece estar implicada en la delección de clones autorreactivos 
de linfocitos B. 
Mecanismo efector de citotoxicidad por parte de linfocitos T y células NK. Se ha 
demostrado un papel importante de la apoptosis vía CD95 en la citotoxicidad mediada 
por células T y NK. Este mecanismo ocurre en unión al clásico, mediado por perforina 
/granzima B. 
Existen órganos, como el ojo o testículos; cuya estructura no podría soportar los 
efectos de una respuesta inmune y su proceso inflamatorio asociado. Estos tejidos 
están aislados a estos procesos y se conocen como "sitios de privilegio inmune". Se 
pensaba que este "privilegio" se mantenía evitando la entrada de células activadas en 
ellos. Recientemente, se ha propuesto otro mecanismo de conservación del privilegio 
inmune. Las células activadas pueden entrar en estos tejidos pero, una vez allí, son 
eliminadas por apoptosis vía CD95. Esto se confirmó con el hallazgo de una expresión 
constitutiva de CD95L en el epitelio y endotelio de la cornea y el iris, en las células 
ciliares del ojo, así como en las células de Sertoli en el testículo, y con la observación 
de que, en ratones gld, se produce una inflamación masiva en la retina tras la infección 
con virus de herpes simple a diferencia de los ratones wild-type que no presentan 
apenas células inflamatorias.
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TNFR1 
El receptor 1 de TNF es una proteína de aproximadamente 55 kDa y se expresa 
en la mayoría de los tipos celulares. Esta proteína da nombre a la familia en que está 
integrada, por tanto comparte con CD95 los tres subdominios ricos en cisteínas 
situados en la zona extracelular. El ligando de TNFR1 es TNF, una citoquina producida 
principalmente por macrófagos activados y células T en respuesta a infección. 
A diferencia de la pareja formada por CD95/ CD95L, el par TNFR1/TNF es capaz de 
trasmitir a la célula dos tipos de señales muy distintas entre sí: 
 Por una parte, la unión de TNF a su receptor TNFR1 activa a los factores de 
transcripción NFkB y AP-1 dando lugar a la inducción de genes de carácter 
proinflamatorio e inmunomodulador. 
 Por otra parte, esta unión puede dar lugar también a una señal de apoptosis. La 
señalización de apoptosis por medio de TNFR1 es mucho más limitada que la 
mediada por CD95. En el caso de TNFR1, la unión de su ligando solo señaliza 
apoptosis en algunos tipos celulares y solo cuando la síntesis de proteínas ha 
sido bloqueada. 
De este hecho se deduce que debe existir en las células algún factor que bloquee 
las señales de apoptosis derivadas de TNFR1. La expresión de este factor estará 
probablemente controlada a través de NFkB y JNK/AP-1. 
DR3 
El receptor DR3 (death receptor 3) es muy parecido en cuanto a su secuencia, a 
TNFR1. Cuando se une a su ligando Apo3L, da lugar también a una doble señal que 
puede llevar a la activación de NFkB o a la muerte por apoptosis de la célula. Las 
moléculas que median ambas vías de la señalización son también las mismas que en el 
caso de TNFR. En el único aspecto en que existen diferencias entre ambas rutas de 
señalización es la expresión, tanto de receptores como de ligandos. El mensajero de 
Apo3L se encuentra expresado de forma constitutiva en muchos tejidos, mientras que 
DR3 se encuentra presente principalmente en bazo, timo y sangre periférica y se 
induce por la activación en linfocitos T. De forma inversa, es el receptor de TNF el que 
se encuentra expresado de forma ubicua mientras que el ligando se expresa solo en 
linfocitos y macrófagos activados. Esta diferencia sugiere distintas funciones biológicas 
para ambas vías señalizadoras.
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DR4 y DR5 
DR4 y DR5 son receptores de muerte cuyo ligando llamado TRAIL o Apo2L es el 
que muestra más similitud con CD95L aunque, a diferencia de estas molécula, su ARN 
mensajero se encuentra expresado de forma constitutiva en gran cantidad de tejidos y 
la expresión se eleva en linfocitos T de sangre periférica cuando estos son estimulados. 
La señal a través de Apo2L produce apoptosis en una gran variedad de líneas 
tumorales. Se ha descrito también en una subpoblación de células T maduras, un 
aumento de la apoptosis mediada por Apo2L al tratar estas con IL-2. Esto puede 
sugerir un posible papel de estos receptores en la delección periférica de los linfocitos 
T. 
Otro posible papel de la apoptosis mediada por Apo2L es la eliminación de 
células infectadas por virus. La señal de apoptosis mediada por estos receptores puede 
ser regulada mediante una familia de receptores "decoy" (señuelos), DcRs, que 
protegen a la célula de la apoptosis provocada por la unión de TRAIL. Uno de los 
miembros de esta familia es DcR1 (TRID, TRAIL-R3 ó LIT), una proteína ligada a la 
superficie celular por una unión glicosil fosfatidil-inositol (GFI), que se asemeja a la 
porción extracelular de DR4 pero sin poseer ningún dominio intracitoplasmático. DcR1 
es capaz de unirse a TRAIL y su transfección en células sensibles a esta vía de 
señalización reduce notablemente la apoptosis mediada por esta señal. DcR2 (TRAIL-R4 
ó TRUNDD) es también un receptor homologo a DR4 y DR5 con el dominio 
intracitoplasmático truncado. Se ha demostrado que la transfección con DcR2 inhibe la 
apoptosis mediada por TRAIL de forma no activa, ya que la eliminación de su dominio 
interno no influye en su actividad inhibidora. 
Todos estos datos indican que, tanto DcR1 como DcR2 compiten con DR4 y DR5 
por la unión de TRAIL, dificultando así que la señal de apoptosis sea transmitida a 
través de estos receptores. 
Secreción de microvesículas con marcaje 
exclusivo de APO2L/TRAIL tras 
estimulación de blastos T humanos a 
través de CD59. Inmuno-microscopía 
electrónica de transmisión, muestras 
preparadas por ultracriomicrotomía (de 
Monleón et al., J. Immunol. 167:6736, 
2001)
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GENES REGULADORES DE LA APOPTOSIS 
Las reglas fisiológicas de la señal apoptótica en los mamíferos son cruciales y 
complejas. 
El nemátodo Caenorhabditis Elegans ha sido un buen modelo para estudiar los 
componentes de la muerte celular, ya que lleva a cabo una apoptosis programada 
durante el desarrollo. Además muchos de los componentes de la maquinaria de la 
apoptosis, están conservados en mamíferos. 
En los estudios genéticos del C. Elegans se identificaron tres productos génicos 
esenciales: CED-3 y CED-4 que favorecen la apoptosis, y CED-9 que la inhiben. CED-3 
es una proteína específica de la cascada efectora de la apoptosis. CED-4 es homólogo 
al Apaf-1, factor promotor de la apoptosis en mamíferos, que se uniría a CED-3 y 
promueve su activación. Mientras que el CED-9, en condiciones normales, se uniría a 
CED-4 y CED-3 formando un complejo, que mantiene al CED-3 inactivo. El estímulo 
apoptótico produciría la disociación de dicho complejo, permitiendo la activación del 
CED-3. 
Estos tres productos génicos tienen homología de secuencia y función con 
productos génicos en mamíferos así: las caspasas de las células de mamífero son 
similares a CED-3; Apaf-1 es el único homólogo de CED-4 en mamíferos conocido; y 
algunos productos de genes de la familia de bcl-2 se relacionan con CED-9. 
Aunque los mecanismos bioquímicos y genes implicados en este proceso son en 
gran parte desconocidos, se han identificado numerosos genes que codifican 
productos que influyen en la susceptibilidad celular para entrar en la apoptosis. Entre 
ellos podemos distinguir activadores e inhibidores de la muerte celular programada. 
FAMILIA Bcl 2 – Bax 
Bcl-2 fue el primer miembro encontrado en una familia creciente de genes 
implicados en la regulación de la apoptosis que, a diferencia de otro oncogenes, 
prolonga la supervivencia celular bloqueando específicamente la muerte celular por 
apoptosis. 
El gen bcl-2 (B-cell Lymphoma 2) se identificó hace más de una década, con el 
análisis y descubrimiento de la translocación 14;18 (q32,q21), en el cromosoma 18. 
Esta translocación es la aberración cromosómica más común en los linfoma no 
Hodgkin, alcanzando el 70-80 % en los linfomas foliculares. En este caso la secuencia 
de bcl-2 se yuxtapone al gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig H), en la
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región 14q32. Sin embargo, la translocación no se traduce en una interrupción de la 
región codificante del bcl-2, sino en el gen de la Ig H. 
Consecuentemente, bajo el control del gen promotor de las inmunoglobulinas, se 
produce la sobreexpresión, tanto del ARNm como del producto proteico, de bcl -2 en 
estos linfomas y como consecuencia, una disminución de la muerte de los linfocitos B 
afectados. Esta prolongación de la vida de las células B es un evento crítico en la 
génesis del linfoma folicular. 
Por otro lado, y accidentalmente, se observó que este gen, activado por la 
traslocación 14;18, permitía la supervivencia de células hematopoyéticas citoquin-dependientes, 
en estado quiescente, en ausencia de citoquina263. Este hallazgo se 
verificó en otras líneas celulares en ratones transgénicos, estableciéndose que la 
supervivencia y la proliferación celular estaban directamente relacionados con una 
sobreexpresión de bcl-2. 
Bcl-2 
Es la proteína prototipo de esta familia. Pesa 26 KDa y posee los cuatro dominios 
que la definen (BH1-BH4). Bcl-2 es una proteína integral de membrana y se encuentra 
en la cara citoplasmática de la membrana externa de la mitocondria, el retículo 
endoplásmico y la envuelta nuclear. Es en esas membranas, gracias a que puede 
formar una estructura similar a un poro, donde se desarrolla una de sus posibles 
funciones: modificar el flujo de moléculas o pequeñas proteínas a través de ellas, 
interviniendo en la estabilidad de orgánulos como la mitocondria ante la existencia de 
posibles daños.
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Su sobreexpresión puede evitar o al menos retrasar varias formas de muerte 
celular programada como las inducidas por retirada de factores de crecimiento, 
irradiación g, glucocorticoides y múltiples drogas quimioterápicas. En contraste, 
parece no influir en otros mecanismos de apoptosis como, por ejemplo, la señalización 
vía CD95 en la mayoría de los tipos celulares. 
A la hora de establecer el papel fisiológico realizado por Bcl-2, debe estudiarse el 
fenotipo que presenta el ratón knockout para el gen que lo codifica. El animal se 
desarrolla normalmente pero termina mostrando una exagerada apoptosis de 
linfocitos y melanocitos, así como lesiones neuronales e intestinales y una enfermedad 
renal terminal. Esto lleva a pensar que Bcl-2 no tiene un papel muy importante, o al 
menos tiene un papel redundante, en el desarrollo embrionario pero, ya después, 
interviene en la regulación de la apoptosis en linfocitos, neuronas y el resto de células 
y tejidos mencionados anteriormente. 
Bcl-x 
El gen bcl-x está colocado en una forma larga (L) y en una forma corta (S). La 
proteína producida por la forma larga, Bcl-XL, tiene un 47% de hohmologia con el bcl-2 
y una distribución celular semejante a este, lo que sugiere que ambas proteínas 
funcionan de una manera similar. Por el contrario, el producto derivado de la forma 
corta, Bcl-XS, antagoniza con la inhibición de la muerte celular programada por las dos 
anteriores. 
Bax 
La primera proteína conocida asociada con bcl-2 in vivo fue bax ( bcl-2-associated 
protein x), una proteína de 21 kD con la habilidad de suprimir la capacidad de bcl -2 
para bloquear la apoptosis. 
En algunos tejidos incluyendo mama, estómago, piel, ganglios linfáticos, colon e 
intestino delgado, entre otros, los patrones de expresión de bax y bcl -2 están 
regulados de forma paralela, lo que sugiere que existe un antagonismo activo entre 
ambas proteínas. Por otro lado, también se ha visto que la expresión de bax se localiza, 
especialmente, en áreas cuyas células tienen una alta tasa de apoptosis. Se han 
propuesto varios mecanismos para explicar el papel regulador de sta interacción 
proteína-proteína en el control de la apoptosis: 
 Bax podría funcionar como una molécula inductora de muerte celular, que es 
neutralizada por bcl-2.
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 Bcl-2 podría funcionar como un represor de muerte celular que es neutralizado, 
por competencia, con una molécula inerte de bax. 
 Bcl-2 podría tener una función bioquímica totalmente expuesta a bax. 
En otros tejidos se distribuye paradójicamente. Así, en algunas células de larga 
vida como neuronas del sistema nervioso central, la expresión de bax es alta, mientras 
que en células de corta vida tales como granulocitos y timocitos corticales su expresión 
es nula o escasa, lo que sugiere que , o bien la vía bcl-2/bax no es responsable de la 
regulación de la vida y la muerte en estas células, o bien que otros miembros de la 
familia bcl-2, son expresados en estas células y contribuyen a la regulación de la 
muerte celular. 
Sin embargo, las neuronas están entre las células más sensibles para la inducción 
de muerte celular por pérdida de factores de supervivencia (neurotrofinas), hipoxia, 
hipoglucemia y una variedad de otros insultos. Por tanto, los altos niveles de bax 
encontrados en varios tipos de neuronas del sistema nervioso central, además de 
poder contribuir a su inherente estado de vulnerabilidad, sugieren que bax por sí sólo, 
es insuficiente para poner en marcha la vía de la muerte celular en estas células, e 
implica un antagonismo activo entre bax y presumiblemente otros miembros de la 
familia de proteínas bcl-2 para mantener la supervivencia de esa células de larga vida. 
Bak 
La proteína Bak (Bcl-2 homologous antagonist/Killer) aumenta la tasa de 
apoptosis inducida por deprivación de factores de crecimiento de fibroblastos, 
neuronas y células linfoides murinas, lo que sugiere que funciona principalmente como 
un promotor de apoptosis. 
Bak se expresa ampliamente en epitelios complejos incluyendo nasofaringe, 
esófagos, colón y vejiga, en los cuales tiene un papel pro-apoptótico. 
Mcl-1 
El gen Mcl-1 (Mieloid cell leukemia-1), descubierto en células de la leucemia 
mieloblástica, funciona de manera similar a bcl-2 bloqueando la apoptosis en células 
hematopoyéticas mas diferenciadas. Este gen codifica una proteína de 37 KD que tiene 
una homología significativa con bcl-2, pero al contrario que esta su expresión es mayor 
en las células más diferenciadas de epidermis, intestino, colón, próstata, nasofaringe y
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vía aérea superior. Esto sugiere que ambos desempeñan funciones diferentes en la 
regulación in vivo de la apoptosis. 
MECANISMOS DE ACCIÓN 
Los miembros de la familia pro y anti-apoptótica pueden formar dímeros; si las 
parejas son idénticas se denomina homodímeros, y si son diferentes heterodimeros. 
Algunos de los miembros de la familia forman homodímeros (bcl-2, bax, bcl-xL y bcl-xS), 
y otros, como el bcl-2, pueden formar heterodímeros con bax, bcl-x S, A1 y Bad. A 
su vez bax puede heterodimerizar con bcl-2, bcl-xL, Mcl-1 y A1 y bcl-xL puede 
heterodimerizar con bax, bad y bcl-xL. A pesar de que algunas células usan 
preferentemente uno de los miembros de la familia como factor de supervivencia, la 
mayoría de las células eucariotas presentan una tremenda redundancia en la expresión 
de los miembros de la familia de bcl-2. Por ejemplo, cuando bax aparece como un 
homodímero aumenta la sensibilidad de las células ante el estímulo apoptótico, sin 
embargo, si forma heterodímeros con proteínas antiapoptóticas, actúa protegiendo a 
la célula de la apoptosis. 
Por otro lado bad puede formar heterodímeros con las moléculas 
antiapoptóticas, permitiendo al bax aumentar su función proapoptótica. Se ha 
establecido que los dominios BH1, BH2, y BH3 ejercen una fuerte influencia en la 
formación de homo o heterodímeros. Para la actividad proapoptótica, la formación de 
heterodímeros es esencial en el grupo de dominio BH3 que actúan a través de 
ligandos, pero no para el grupo Mtd ya que esas tienen un impacto citotóxico 
independiente dañando las organelas directamente. Incluso ante la presencia de 
inhibidores de caspasas, las proteínas bax o bax-like conducen a la muerte celular, por 
permeabilidad mitocondrial formando canales iónicos en su membrana.
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Los estímulos mitógenos hacía myc activan tanto el crecimiento celular como la apoptosis, pero esta 
última está regulada por la disponibilidad de los factores anti-apoptóticos como el bcl-2. 
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GEN c-myc 
El gen c-myc es un elemento importante en el control de la proliferación celular. 
La sobreexpresión de c-myc puede inducir bien proliferación o bien apoptosis, y la 
decisión celular entre esas dos respuestas está determinada por otras señales tales 
como la presencia de factores de crecimiento u otros estímulos de supervivencia como 
el bcl-2. Por lo tanto, el efecto de cmyc, como el de p53, está en función del tipo 
celular y de estímulos específicos y no es necesario para todas las formas de apoptosis. 
GEN DE SUPRESOR TUMORAL p53 
P53 es un regulador fundamental en el normal crecimiento y la homeostasis de 
células y tejidos. El gen p53 fue identificado y descrito, por primera vez, en 1979, en las 
células transformadas por el virus SV40, formando un complejo con el antígeno T, el 
producto proteico de dicho virus. Dado que dicho antígeno es necesario para 
mantener el fenotipo transformado, se sugirió que esta interacción era importante 
para la transformación y por ello, inicialmente se pensó que pertenecía a los 
oncogenes y actuaba como acelerador del ciclo celular. Diez años más tarde, se mostró 
que todos los clones obtenidos eran formas mutantes de p53 y se planteó que este 
fuera un gen supresor tumoral que regularía el ciclo celular. 
Esta hipótesis se reforzó al evidenciarse que la expresión de clones de p53 sano 
suprimía la transformación de células en cultivo activadas por oncogenes, el 
crecimiento de células en cultivo y el potencial tumorogénico de células en animales. 
Por ello, y por el hecho de la frecuente delección de la zona del gen en varios tumores, 
se llegó a la conclusión de que p53 era efectivamente un gen supresor tumoral. No 
obstante puede comportarse como un oncogén en algunas formas mutantes.
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EL GEN p53 Y SU PROTEÍNA 
Se localiza en el brazo corto del cromosoma 17 (17 p13), esta constituido por 11 
exones dentro de un dominio cromosómico de 20 kb. En condiciones normales actúa 
como “guardián del genoma” previniendo la proliferación de células que presenten un 
DNA dañado. Esta función es realizada por la proteína p53 normal (“wild type”) que 
recibe ese nombre por ser una fosfoproteína nuclear de 53 Kda, constituida por 393 
aminoácidos. Contiene tres dominios, con diferentes funciones. 
La región N-terminal principalmente controla la transactivación transcripcional, 
mientras que la región carboxi-terminal controla la oligomerización, modulando la 
unión de los tetrámeros al DNA. La mutación a este nivel puede trasladar la 
localización de la proteína del núcleo al citoplasma. Además, dentro de la región C-terminal, 
existe otra zona adicional que regula el cambio de la forma latente a la forma 
activa de la proteína, para la unión con secuencias específicas. Por último, el dominio 
central es la región por la que se une la proteína como tetrámero, a la secuencias 
dianas de los genes en el DNA. Esta zona está muy conservada entre las especies y, es 
donde se encuentran la mayoría de las mutaciones en tumores humanos. Dichas 
mutaciones interfieren con el plegamiento tridimensional de la proteína y por lo tanto, 
con la interacción en el DNA, evitando así la activación transcripcional de los genes 
“downstream”. 
Es una fosfoproteína constituida por 393 aminoácidos distribuidos en 11 exones, el primero no codificante. El 
dominio central hidrofóbico es el que se une como tetrámero al DNA dañado. La región N-terminal 
principalmente controla la transactivación transcripcional, mientras que la región carboxi-terminal controla 
la oligomerización, modulando la unión de los tetrámeros al DNA.
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ACTIVACIÓN Y FUNCIÓN 
La proteína p53 intracelular se determina, principalmente, por la cantidad de 
proteína que se degrada, más que por el exceso de formación de la misma. La 
degradación es un proceso proteolítico ATP-dependiente, mediado por ubiquitina, y la 
proteína MDM-2 (Murine doublé minute) que estimula el proceso de unión entre esta 
y el extremo carboxi-terminal de la p53. 
El oncogen MDM2, codifica una proteína de 90 kD que forma un complejo estable 
con p53, inhibiendo su unión secuencia-específica al ADN. Por ello, la sobreexpresión 
de MDM2 inhibe la capacidad de p53 para estimular la expresión de determinados 
genes dianas importantes en su función como supresor tumoral. 
Estudios recientes, han confirmado la existencia de, al menos, tres mecanismos 
independientes que activen a la proteína p53. 
 La primera vía se produce por daño en el DNA, como el causado por radiación 
ionizante. Este daño es captado por las proteínas reguladoras (de “checkpoint”) 
que retrasan el progreso del ciclo celular, hasta que el daño no es reparado. 
Estas enzimas protein-quinasas están representadas por la ATM (por 
encontrarse mutada en la ataxia telangiectasia), la cual es estimulada por 
roturas en la doble cadena, ChK1, ChK2 y la proteín-quinasa DNA-dependiente 
y ejercen su función fosforilando la p53 a los sitios amino-terminal que están 
cerca de los sitios de unión de las proteínas MDM-2, permitiendo la 
estabilización de la p53. 
 La segunda vía se lleva a cabo por señales de crecimiento aberrantes, como las 
producidas por la expresión de oncogenes como Ras o Myc, en ausencia de 
daño de DNA. Estos oncogenes estimulan la transcripción del gen p14ARF, o la 
estabilización de la proteína p14ARF, que, a su vez, se une a la MDM-2 
inhibiendo su función. 
 La última ruta es inducida por múltiples fármacos quimioterápicos, luz 
ultravioleta e inhibidores de la protein-quinasa, y se caracteriza por estar 
involucrada la proteína ATR (Proteína relacionada con ataxia-telangiectasia) y 
caseín-quinasa II. 
Las tres vías actúan inhibiendo la degradación de la proteína p53, es decir 
estabilizándola a altas concentraciones, aumentando su actividad transcripcional 
dramáticamente. Esto hace que la p53 ejerza su función en los sitios de unión en el 
DNA dañado, como un tetrámero, que estimula la expresión de los genes adyacentes, 
con el fin de reparar el daño genómico
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Mediante estímulos enzimáticos se modifica los niveles de MDM 2 activo y, en consecuencia, aumentan los 
niveles de la proteína p53 activada. 
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MECANISMO DE ACCIÓN 
Se han identificado múltiples genes que son controlados directamente por la p53, y 
han sido clasificados en cuatro categorías. 
Muchos de estos genes están involucrados en la prevención del desarrollo de tumores, como los inhibidores 
de la progresión del ciclo celular, o del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, así como los que favorecen la 
apoptosis.
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a) Genes involucrados en la inhibición del ciclo celular: La proteína p53 se une a 
secuencias específicas del DNA inhibiendo la transcripción de genes 
reguladores del ciclo celular. Estos ejercen un control negativo paralizando el 
ciclo celular en G1 y bloqueando la entrada en fase S, que es donde se sintetiza 
el DNA. Uno de estos genes el p21 (WAF 1/ CIP1), codifica un potente inhibidor 
de quinasas dependientes de ciclina (CDKs), que junto con otras proteínas 
ciclinas responsable de la inactivación de la proteína Rb durante las fases G1 y 
G2 del ciclo celular. Otra proteína involucrada en el control del ciclo es GADD45 
(growth arrest DNA damage) la cual también se une al PCNA. 
Por otro lado, en células epiteliales p53 estimula la expresión de la proteína 14- 
3-3, la cual secuestra la ciclina B1- complejo CDK1 fuera del núcleo y por lo 
tanto, mantiene el bloqueo en la fase G2. Se ha visto que la inhibición de esta 
proteína hace que las células humanas epiteliales crezcan indefinidamente en 
cultivo; esta inmortalidad puede ser la llave para diferenciar células tumorales 
de las normales. Con esta interrupción del ciclo, se permite a los mecanismos 
reparadores celulares actuar antes de la replicación de ADN. 
b) Apoptosis: La proteína p53 no es necesaria para todas las formas de apoptosis, 
pero ejerce un efecto crucial en la inducción de la apoptosis que se produce en 
respuesta al daño de ADN. Si el daño es extenso e irreparable, entonces, la p53 
activa los mecanismos de apoptosis, como mecanismo de defensa, para 
proteger la propagación y proliferación de células que han sufrido la mutación. 
La transcripción del gen bax es activada directamente por sitios de unión de la 
p53 en la región de regulación. Recientemente, se ha descubierto que los genes 
NOXA y P53AIP1 también son activados directamente por la p53, y que al igual 
que bax , expresan sus proteínas a nivel mitocondrial teniendo una acción 
inductora de la apoptosis. Otros mediadores de la apoptosis inducida por p53 
incluyen proteínas similares a los receptores de apoptosis, TNF y Fas como 
recientemente, se ha descubierto la PIDD. La p53 puede, también, actuar 
directamente sobre la mitocondria produciendo un exceso de tóxicos con 
potencial redox, sin inducir la translocación de bax. 
c) Estabilidad genómica: La inactivación de los genes de reparación produce 
inestabilidad genómica. La proteína p53 desempeña un papel clave para 
compensar dicho efecto regulando la expresión de genes implicados en los 
mecanismos de reparación y recombinación. P53 controla también la inducción 
de genes como el de la ribonucleótido reductasa (RNR), implicada en las 
respuestas celulares a daño en el DNA. RNR cataliza la síntesis de 
desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTPs) requeridos para el metabolismo del 
DNA. El enzima es citosólica, produciendo dNTPs que penetran en el núcleo
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para la síntesis de DNA. Recientemente se ha identificado el gen p53R2, 
mutado en una serie de tumores de colón, que regula una subunidad de la RNR. 
Tanaka y Cols. han demostrado que las células que no producen p53R2 son más 
sensibles a la muerte por agentes que dañan el DNA. 
d) Inhibición de la angiogénesis: La p53 normal estimula la expresión de genes 
que previenen la formación de nuevos vasos, que es un paso crítico y precoz en 
el desarrollo de los tumores primarios. Se ha visto que la pérdida de función de 
p53 resulta en una disminución de la expresión de trombospondina (la cual es 
una poderosa inhibidora de angiogénesis) 
MUTACIÓN 
El gen p53 parece tener una función pivote en la carcinogénesis humana, ya que 
se encuentra mutado en más del 50 % de los tumores. La inactivación de p53 puede 
ocurrir a través de varios mecanismos, incluido la pérdida de alelos, delecciones, 
inserciones o mutaciones puntuales, la mayoría de las cuales, responden a una 
sustitución de una base en la secuencia codificante de p53 que, cambia un aminoácido 
en el dominio central produciendo un cambio conformacional y de estabilización de la 
proteína translocada. Aunque la presencia de un alelo aberrante puede ser suficiente 
para comprometer la función de supresor tumoral, la pérdida de dicha función ocurre 
normalmente por la pérdida completa de uno de los alelos del gen, resultado de una 
delección cromosómica, en combinación con una mutación puntual sin sentido del 
otro alelo. El polimorfismo más frecuentemente encontrado en las neoplasias 
humanas se localiza en el codón 72 y resulta de una sustitución entre la prolina y la 
arginina. 
Sin embargo, los tumores pueden tener diferentes patrones de cambios de bases 
en el DNA dependiendo si los cambios genómicos ocurren espontáneamente, o bien 
por carcinógenos exógenos. Por ejemplo, en los tumores de piel, los rayos ultravioletas 
producen la sustitución de bases CC por TT. En tumores sólidos, los cambios de DNA 
son espontáneos en su mayoría, observándose mutaciones de C a T en los nucleótidos 
5-meCpG, asociando hidrólisis de grupos amino en 5-metil citosina produciendo 
timidina. Esto produce un cambio en el código genético por sustitución de citosina: 
guanina a Timina: Adenina. El resultado de esa mutación es la síntesis de una proteína 
con cambios en su conformación, una vida media más prolongada y una función 
alterada en el crecimiento celular.
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Asimismo, la inactivación del gen puede producirse porque la proteína transcrita 
es silenciada por formaciones complejas, bien por interacción con productos víricos, 
como el antígeno T SV40, la proteína adenovirus E1b o la proteína E6 del HPV de alto 
riesgo, o por interacción con otras proteínas celulares como MDM2 (murine double 
minute 2). De cualquier modo la inactivación de p53 conduce a una reducción en los 
niveles de p21/WAF 1, a la fosforilación del producto genético del retinoblastoma (rb) 
y a la progresión de G1 a la fase S del ciclo celular. 
MIEMBROS DE LA SUBFAMILIA BH3 
Esta subfamilia está compuesta solo por miembros proapoptóticos que, excepto 
por el dominio BH3, no muestran homología con Bcl-2. Para ejercer su actividad, estas 
proteínas pueden formar heterodímeros con miembros antiapoptóticos de la familia. 
Para ello, el dominio BH3 de los miembros de este grupo puede introducirse en el 
hueco hidrofóbico formado por la asociación de las regiones BH1, BH2 y BH3 de los 
miembros antiapoptóticos. Un ejemplo de la acción de esta familia de proteína es la 
ejercen dos de sus miembros Bid y Bik sobre la mitocondria, donde inducen la 
liberación de citocromo c y posterior apoptosis. 
PROTEINAS DE LA FAMILIA DE LAS CASPASAS 
Dentro de la maquinaria que lleva a cabo el programa de apoptosis, los 
miembros ejecutores son una serie de proteasas englobadas bajo el nombre de 
caspasas. Este sistema ejecutor se ha mantenido a lo largo de la evolución y, tras su 
descripción en c. elegans, se encontró el equivalente en mamíferos gracias a la 
homología que presentaban ambas moléculas. Esta primera proteasa encontrada en 
mamífero se denominó ICE (interleukin-1b-converting enzime) o caspasa-1 (cisteína-aspartasa- 
1) y es precisamente uno de los pocos miembros de la familia al que no se le 
ha podido hallar relación directa con el proceso de apoptosis, sino más bien con el de 
la inflamación. 
La familia de las caspasas en humanos está formada hasta el momento por 11 
miembros descritos, y todos ellos tienen en común que se encuentran en forma de 
zimógeno o proenzima con una estructura bien definida: 
a) El dominio N-terminal es muy variable tanto en su secuencia como en su 
longitud y tiene funciones de regulación y activación
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b) La región catalítica está formada por dos dominios, uno grande ("20 KDa) y otro 
pequeño ("10 KDa), que darán lugar a las dos subunidades del enzima una vez 
activada. 
Las caspasas se dividen en dos grupos según la longitud de su región reguladora 
N-terminal o prodominio. 
 Las caspasas con prodominio largo como son la -1,-2, -4, -5, -8, y -10 parecen 
estar involucradas en funciones de regulación de la activación de la cascada. 
Ejemplos bien conocidos de este grupo son las procaspasas -8 y -10 que 
contienen en sus largos prodominios repeticiones de una secuencia de 
interacción proteína-proteína llamada dominio efector de muerte o DED 
(death effector domain) y las procaspasas -1, -2, -4, -5 y -9, que contienen 
dominios de reclutamiento de caspasas o CARDs (caspase recruitment 
domains). La presencia en su estructura de estas secuencias unido a su 
localización cercana a la membrana plasmática hacen posible su reclutamiento 
hacia el complejo formado en torno a receptores de superficie señalizadores de 
apoptosis como CD95 y TNF, activándose allí y dando lugar al comienzo de la 
cascada de proteólisis. Por esta situación dentro del proceso se las conoce 
como caspasas iniciadoras. 
 El otro grupo está compuesto por las caspasas con prodominio corto como son 
las caspasas -3, -6 y -7. Estas parecen estar situadas "downstream" en la 
cadena y se ha demostrado in vitro que son activadas por alguna de las 
caspasas iniciadoras. Los estudios realizados sugieren que estas caspasas 
llamadas efectoras son las que actúan al final de la cascada sobre los 
componentes celulares, proteolizándolos. 
Debido a la gran importancia que tienen las caspasas en la apoptosis, es razonable 
comprender como las caspasas son activadas. Las caspasas son sintetizadas como 
zimógenos enzimáticamente inertes que deben ser cortados proteolíticamente para 
ser activos. En todos los casos estudiados, la enzima madura es un heterotetrámero 
que contiene dos p20/p10 heterodímeros y dos centros activos. Existen tres 
mecanismos generales de activación de caspasas: 
A) Activación por otra caspasa: Como su nombre indica, las caspasas son proteasas 
que cortan después de un residuo de ácido aspártico. Un punto de corte de Asp separa 
el prodominio de p20 y uno o dos separan p20 de p10. Esto sugiere la posibilidad de 
activación autocatalítica. Efectivamente, un modo simple de activar una procaspasa es 
exponerla a otra previamente activada. Esta estrategia de activación denominada
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cascada de caspasas es muy utilizada por las células para la activación de las tres 
caspasas que tienen un prodominio corto: caspasa-3, -6 y -7. Estas tres caspasas se 
denominan caspasas efectoras y son más abundantes y activas que sus primas con un 
prodominio más largo. 
La cascada de caspasas es un método útil para amplificar e integrar las señales 
proapoptóticass, pero no pueden explicar cómo se activó la primera caspasa. Existen al 
menos dos aproximaciones que explican dicha activación. 
B) Activación inducida por proximidad: La caspasa-8 es la caspasa iniciadora clave en 
la vía de los receptores de muerte. Después de la unión del ligando, los receptores de 
muerte como CD95 (Apo-1/Fas) se agregan y forman un complejo de señalización de 
membrana. Estos complejos reclutan, a través de sus proteínas adaptadoras, varias 
moléculas de procaspasa-8 con lo que se aumenta la concentración local de zimógeno. 
En estas condiciones, la baja e intrínseca actividad proteasa de la procaspasa-8 es 
suficiente para permitir que varias moléculas de proenzima se corten mutuamente y se 
activen unas a otras.
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C) Asociación con una subunidad reguladora: El mecanismo de activación más 
complejo es el utilizado por la caspasa-9. Al contrario que en otras caspasas, el 
procesamiento proteolítico de la procaspasa-9 tiene un efecto mínimo en su 
activación. El requerimiento clave para la activación de la caspasa-9 es su asociación 
con un cofactor de proteínas, Apaf-1. También es necesario el citocromo c liberado por 
la mitocondria. El citocromo c y Apaf-1 se asocian en un proceso ATP dependiente. La 
oligomerización de Apaf-1 recluta procaspasas-9 formando el apoptosoma . La 
activación de la caspasa-9 es debida a un cambio conformacional, no a proteolisis. 
En resumen, las caspasas efectoras se activan proteolíticamente por otras 
caspasas mientras que las caspasas iniciadoras son activadas por interacciones 
reguladas proteína-proteína. 
Cada caspasa con prodominio largo contiene en su prodominio un módulo de 
interacción proteína-proteína que permite la unión y asociación con sus reguladores. 
Las caspasas -8 y -10 contienen un dominio efector de muerte (death-effector domain, 
DED ) mientras que las caspasas -2 y -9 contienen un dominio de reclutamiento y 
activación de caspasas (caspase activation and recruitment domain, CARD ). Estos dos 
dominios comparten tienen secuencias distintas, pero se pliegan en una disposición 
espacial similar que consiste en seis hélices a antiparalelas (Hofmann K, 1999). El 
mismo plegamiento lo encontramos en el dominio de muerte (death domain, DD ), 
una tercera proteína de interacción presente en varios reguladores iniciales de la 
apoptosis como CD95 y la molécula adaptadora FADD. Parece que DD, DED y CARD 
derivan de un dominio ancestral común.
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SUSTRATOS DE CASPASAS 
La activación de las caspasas no resulta en la degradación indiscriminada de 
proteínas celulares. Por el contrario, las caspasas cortan selectivamente un conjunto 
restricto de proteínas, normalmente en una o varias posiciones de la secuencia 
primaria (siempre después de un residuo de Asp). En la mayoría de los casos, el corte 
mediado por las caspasas resulta en la inactivación de la proteína, pero las caspasas 
pueden también activar proteínas, bien directamente mediante el corte de un dominio 
de regulación negativa o bien indirectamente mediante degradación de una subunidad 
inhibidora. 
La caspasa más prevalente en la célula es la caspasa-3 que es la última 
responsable de la mayoría de los efectos apoptóticos junto con la caspasa-6 y -7. Por 
ejemplo, la fragmentación del DNA de peso molecular alto y bajo es debida a la acción 
de la caspasa-3 sobre un complejo DNasa activado por caspasa (CAD), una nucleasa, y 
iCAD, su inhibidor (Enari M, 1998; Liu X, 1997). En células no apoptóticas, CAD aparece 
formando un complejo inactivo con iCAD. Durante la apoptosis, la caspasa-3 degrada el 
inhibidor, permitiendo a la nucleasa degradar la cromatina. La formación de pequeñas 
vesículas en la membrana plasmática y su plegamiento es debido al corte y activación 
de la gelsolina (Kothakota, 1997), de la kinasa-2 activada por p21 (Lee N, 1997) y sobre 
todo a través de la degradación de la fodrina (Martin SJ, 1995) que disocia la 
membrana plasmática del citoesqueleto. La externalización de la fosfatidilserina 
(phosphatidylserine, PS) en los estadios iniciales de la apoptosis es dependiente de 
caspasas aunque el mecanismo preciso no ha sido todavía elucidado (Martin SJ, 1996). 
Además de los sustratos descritos existen cerca de otros 100 y posiblemente 
haya más (Earnshaw WC, 1999; Nicholson DW, 1999). ¿Por qué hay tantos sustratos?. 
Quizá la apoptosis es mucho más compleja de los que nosotros actualmente creemos. 
También es posible que alguno de estos sustratos descritos no sea relevante, sino 
simplemente un espectador inocente cogido en el acto. 
INHIBIDORES DE CASPASAS 
Las células también contienen inhibidores naturales de las caspasas. Estas 
proteínas inhibidoras de la apoptosis (inhibitors of apoptosis proteins, IAPs ) fueron 
primero identificadas en baculovirus y después se encontraron en células humanas. 
Existen al menos cinco diferentes en mamíferos: XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis), 
c-IAP1, c-IAP2, IAP neuronal y survivina. Todos ellos poseen una actividad 
antiapoptótica in vitro (Roy N, 1997; Deveraux QL, 1997, 1998; Ambrosini G, 1997). El 
espectro de estímulos apoptóticos que son bloqueados por las IAPs de mamíferos es
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amplio e incluye ligandos y transductores de la familia de receptores del factor de 
necrosis tumoral (tumor necrosis factor, TNF), miembros proapoptóticos de la familia 
de Bcl-2, el Citocromo c y agentes quimioterapeuticos (Deveraux QL, 1999). XIAP tiene 
una amplia y enorme capacidad antiapoptótica. XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 son inhibidores 
directos de caspasas. Todos ellos se unen e inhiben a las caspasas -3 y -7 activas y 
también a la procaspasa-9, pero no a las caspasas-1, -6, -8 ni -10. 
La unión y la inhibición de las caspasas por las IAPs es mediada por los dominios 
repetidos IAP de baculovirus (baculovirus IAP repeat, BIR) presentes dentro de las IAPs. 
BIR es un motivo conservado de unos 70 aminoácidos que está repetido en tándem y 
que está presente en las IAPs de todos los mamíferos. Otra región dentro de las IAPs es 
el dominio RING, que actúa como una ligasa de ubiquitina promoviendo la degradación 
de la propia IAP (Yang Y, 2000) y, presumiblemente, cualquier caspasa unida ella. Cerca 
del dominio RING, tanto en c-IAP1 como en c-IAP2, existe un dominio CARD que 
sugiere que estas IAPs podrían regular directa o indirectamente el procesamiento de 
las caspasas a través de interacciones por el dominio CARD. De esta manera, las IAPs 
frenan la apoptosis uniéndose, inhibiendo y quizá degradando caspasas. 
VIAS DE INDUCCIÓN DE APOPTOSIS 
VÍA INTRÍNSECA O MITOCONDRIAL 
La mitocondria no es sólo la productora de energía de la célula, es también un 
arsenal. La mitocondria secuestra un potente cóctel de proteínas proapoptóticas. La 
más prominente entre ellas es el citocromo c, el humilde transportador de electrones. 
Varios trabajos han revelado que el citocromo c es todo lo contrario a inocuo y que 
además de su implicación en la fosforilación oxidativa mitocondrial, es uno de los 
componentes requeridos para la activación de la caspasa-9 en el citosol. 
No se conoce exactamente cómo el citocromo c atraviesa la membrana externa, 
pero está claro que la familia de Bcl-2 está íntimamente implicada en la regulación de 
este proceso. El nombre de la familia se debe al primer miembro, que fue aislado como 
un gen implicado en el linfoma de células B (de ahí el nombre bcl, B-cell lymphoma) 
que es homólogo del represor de la apoptosis ced-9 de C. elegans . Esta familia consta 
de 19 miembros que se ha clasificado en tres grupos basándose en similitudes 
estructurales y funcionales. Cada miembro posee al menos uno de los cuatro motivos 
conservados denominados dominios de homología con Bcl-2 (Bcl-2 homology 
domains, BH ): BH1-BH4. Los miembros del grupo I, como Bcl-2 y Bcl-X L , poseen 
actividad antiapoptótica y se caracterizan por tener los cuatro dominios BH (BH1-BH4).
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Además poseen una cola hidrofóbica en el C-terminal que localiza la proteína en 
la membrana externa de la mitocondria. El grupo II consta de miembros de la familia 
de Bcl-2 con actividad proapoptótica, como por ejemplo Bax y Bak. Tienen estructura 
similar a las del grupo I pero carecen del dominio BH4. Estudios de estructura y función 
sugieren que la actividad anti y proapoptótica está determinada por una región 
relativamente larga que incluye dos hélices a que participan en la inserción a la 
membrana. Los miembros del grupo III también tienen actividad proapoptótica. Todos 
ellos se caracterizan por la presencia de un único dominio BH3, además pueden o no 
tener región transmembrana. Los miembros más caracterís ticos son Bid, Bad, Bim, Bik. 
La función clave de los miembros de la familia de Bcl-2 es regular la liberación de 
factores proapoptóticos, en particular el citocromo c, desde el compartimento 
intermembranal de la mitocondria hasta el citosol. ¿Cómo controlan los miembros de 
la familia de Bcl-2 la muerte celular? Parece ser que se pasan la mayoría del tiempo 
simplemente intentando bloquear el siguiente movimiento del otro. Algunos 
miembros de la familia pueden homodimerizar pero, lo que es más importante, 
pueden formarse heterodímeros de miembros pro y antiapoptóticos . 
En una primera aproximación, la heterodimerización puede simplemente resultar 
en una neutralización mutua de las proteínas pro y antiapoptóticas unidas. Por tanto, 
el problema consiste sólo en comparar los niveles totales de miembros pro y 
antiapoptóticos de la familia: células con más proteínas pro muerte son más sensibles 
a la apoptosis; células con exceso de miembros de la familia protectora serán 
normalmente resistentes.
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Recientemente se ha identificado un inhibidor de las IAPs de mamíferos, 
denominado Smac (second mitochondria-derived activator of caspases) o DIABLO ( 
direct IAP-binding protein with low pI ). Smac/DIABLO se une a los miembros de la 
familia de las IAPs y neutraliza su actividad antiapoptótica. Curiosamente, 
Smac/DIABLO es una proteína mitocondrial normal pero su liberación al citosol celular 
induce apoptosis, presumiblemente siguiendo la misma ruta de salida que el citocromo 
c. Por tanto, si una célula está comprometida a sufrir apoptosis y libera el contenido 
mitocondrial al citosol, entonces Smac/DIABLO secuestra las proteínas IAPs y se 
asegura que estas proteínas no intenten parar el programa en curso. 
La vía mitocondrial se ejecuta en respuesta a intromisiones externas y a daño en 
el DNA. Las distintas vías de respuesta convergen en la mitocondria, a menudo a través 
de la activación de miembros proapoptóticos de la familia de Bcl -2. Excepto Bcl-2, que 
está la mayoría del tiempo anclado a membranas intracelulares, algunos miembros de 
los grupos II y III, incluyendo Bax, Bad, Bim y Bid, pueden localizarse tanto en el citosol 
como en orgánulos. La forma citosólica de estas proteínas es un reservorio inactivo 
pero preparado para la batalla. Las señales proapoptóticas redirigen estas proteínas a 
la mitocondria donde tendrá lugar la lucha por el destino de la célula. La activación de 
miembros proapoptóticos puede producirse a través de proteolisis, defosforilación y 
probablemente otros mecanismos. 
Los miembros pro y antiapoptóticos de la familia de Bcl -2 se encuentran en la 
superficie de la mitocondria donde regulan la salida del citocromo c por un mecanismo 
todavía debatido. Si los miembros proapoptóticos ganan, una gran cantidad de 
moléculas son liberadas desde la mitocondria. La principal de estas moléculas liberadas 
es el citocromo c, que se asocia con Apaf-1 y después con la procaspasa-9 (y 
posiblemente otras proteínas) para formar el apoptosoma. Las proteínas de choque 
térmico (heat-shock proteins, HSP) actúan en múltiples pasos regulando la apoptosis. 
El apoptosoma hidroliza la procaspasa-3 a caspasa-3 que se encarga de ejecutar la 
apoptosis generando distintos subprogramas cuya suma resultará en el 
desmantelamiento ordenado y en la muerte de la célula.
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VIA EXTRINSECA O DE LOS RECEPTORES DE MUERTE 
Los receptores de muerte de la familia del receptor de TNF (TNFR) incluyen 
TNFR1, Fas (CD95), DR3/WSL y los receptores del ligando inductor de apoptosis 
relacionado con el TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)/Apo-2L (TRAIL-R1/ 
DR4, TRAIL-R2/DR5). Los miembros de esta familia están caracterizados por 
presentar de dos a cinco copias de un dominio extracelular rico en cisteína. Los 
receptores de muerte también poseen un dominio intracelular en el C-terminal del 
receptor denominado dominio de muerte (death domain, DD ). Cuando un ligando se 
une a estos receptores se puede producir la muerte por apoptosis de la célula que los 
posee. 
El miembro de los receptores de muerte más estudiado y relevante en 
Inmunología es el CD95 o Fas. La oligomerización, más probablemente la trimerización, 
del CD95 tras la unión de su ligando, FasL, es requerida para la transducción de la señal 
apoptótica. Un complejo de proteínas se asocia con el CD95 activado. Este complejo 
de señalización inductor de muerte (death-inducing signalling complex, DISC ) se 
forma en el segundo de los receptores trimerizados. Primero, el adaptador FADD (Fas-associated 
death domain) o Mort1 se une a través de su dominio de muerte al dominio 
de muerte del CD95. FADD también presenta el denominado dominio efector de 
muerte (death-effector domain, DED ), y, de nuevo por interacciones homólogas,
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recluta en el DISC la procaspasa-8 (o FLICE) que contiene un DED. Después, la 
procaspasa-8 es activada proteolíticamente y la caspasa-8 activa es liberada del DISC al 
citoplasma formando un heterotetrámero de dos subunidades pequeñas y dos grandes 
(Muzio M, 1996). La caspasa-8 activa rompe varias proteínas de la célula incluyendo la 
procaspasa-3, que resulta en su activación y en la finalización de la muerte celular. 
La inhibición de esta ruta es realizada por proteínas que contienen dos DED y que 
se unen al complejo CD95-FADD. Esto inhibe el reclutamiento y la activación de la 
caspasa-8, antiguamente conocida como FLICE, de ahí el nombre de proteínas 
inhibidoras de FLICE (FLICE-inhibitory proteins, FLIP ) (Thome M, 1997; Hu S, 1997; 
Bertin J, 1997; Yeh WC,2000). 
La vía de los receptores de muerte y la vía mitocondrial convergen a nivel de la 
activación de la caspasa-3. El solapamiento y la integración de las dos vías se debe a 
Bid, un miembro proapoptótico de la familia de Bcl-2. La caspasa-8 media la ruptura de 
Bid incrementando enormemente su actividad proapoptótica que resulta en su 
translocación a la mitocondria donde promueve la liberación del citocromo c. Hay que 
tener en cuenta que en la mayoría de las condiciones, este solapamiento es mínimo, y 
las dos vías operan de manera independiente (Gross A, 1999; Yin XM, 1999).
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Mediante esta ruta de inducción de apoptosis se activa la caspasa-8 que activa otras 
caspasas que darán, en última instancia, el fenotipo apoptótico que nosotros 
detectamos mediante diferentes metodologías. 
INTERRELACION ENTRE LAS VIAS 
La vía de los receptores de muerte y la vía mitocondrial convergen a nivel de la 
activación de la caspasa-3. El solapamiento y la integración de las dos vías se debe a 
Bid, un miembro proapoptótico de la familia de Bcl-2. La caspasa-8 media la ruptura de 
Bid incrementando enormemente su actividad proapoptótica que resulta en su 
translocación a la mitocondria donde promueve la liberación del citocromo c. Hay que 
tener en cuenta que en la mayoría de las condiciones, este solapamiento es mínimo, y 
las dos vías operan de manera independiente (Gross A, 1999; Yin XM, 1999).
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FUNCIONES DE LA APOPTOSIS 
ELIMINACIÓN DE TEJIDOS DAÑADOS O INFECTADOS 
La apoptosis puede ocurrir, por ejemplo, cuando una célula se halla dañada y no 
tiene posibilidades de ser reparada, o cuando ha sido infectada por un virus. La 
"decisión" de iniciar la apoptosis puede provenir de la célula misma, del tejido 
circundante o de una reacción proveniente del sistema inmune. Cuando la capacidad 
de una célula para realizar la apoptosis se encuentra dañada (por ejemplo, debido a 
una mutación), o si el inicio de la apoptosis ha sido bloqueado (por un virus), la célula 
dañada puede continuar dividiéndose sin mayor restricción, resultando en un tumor 
que puede ser de carácter canceroso. Por ejemplo, como parte del "secuestro" del 
sistema genético de la célula llevado a cabo por los virus del papiloma humano (VPH), 
un gen denominado E6 se expresa originando un producto que degrada la proteína 
p53, vital para la ruta apoptótica. 
También condiciones de stress como la falta de alimentos, así como el daño del 
ADN provocado por tóxicos o radiación, pueden inducir a la célula a comenzar un 
proceso apoptótico. Una ejemplo sería la apoptosis mediada por la enzima nuclear, 
poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1), crucial en el mantenimiento de la integridad 
genómica. Un activación masiva de dicha enzima puede vaciar la célula de nucleótidos 
ricos en energía, provocando una cadena de transducción de señales del núcleo a la 
mitocondria que iniciaría la apoptosis. 
célula maligna (cáncer de mama)
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DESARROLLO EMBRIONARIO 
Durante el desarrollo embrionario la apoptosis regula el crecimiento celular y 
tisular, desde la desaparición de las membranas interdigitales para el desarrollo 
normal de los dedos hasta la apoptosis en el ojo para la correcta formación del 
cristalino y los párpados pasando por multitud de procesos en estudio. 
En los animales que pasan por distintos estadíos la apoptosis que regula el 
desarrollo controla además el paso de un estadio de crecimiento al siguiente (larva, 
ninfa, juvenil, adulto, etc.). En el caso de las ranas la apoptosis controla, durante la 
metamorfosis, la desaparición de la aleta caudal de los renacuajos. 
ESCULTURA DE DISTINTAS ESTRUCTURAS 
El ejemplo más claro de esto es la eliminación de las membranas interdigitales 
para la formación de los dedos en vertebrados superiores. Otro proceso de 
formación de estructuras en que está involucrada la apoptosis es en el vaciado de 
cuerpos sólidos para crear una luz. Por ejemplo, la formación de la cavidad 
preamniotica en el embrión de ratón por la muerte de células ectodermales de su 
interior (526, Coucovanis 1995). 
ELIMINACIÓN DE ESTRUCTURAS 
En el proceso de desarrollo a veces se forman estructuras que después es 
necesario suprimir. La razón es que pueden ser restos vestigiales de alguna 
estructura necesaria para una especie ancestral pero a la que la evolución ha hecho 
perder la utilidad. También pueden ser formaciones requeridas para determinados 
estadios del desarrollo y que después ya no son de utilidad. Por último, también 
pueden ser estructuras necesarias para un sexo pero no para el otro. Ejemplos de 
este objetivo de la apoptosis durante el desarrollo son los tubos pronefríticos, 
necesarios en peces y larvas anfibias pero que han dejado de serlo en mamíferos y 
por eso son eliminados. También los ductos de Müllerian, que forman el útero y los 
oviductos en hembras de mamíferos pero que en machos son eliminados por 
apoptosis. 
HOMEOSTASIS 
En un organismo adulto, la cantidad de células que componen un órgano o tejido 
debe permanecer constante, dentro de ciertos límites. Las células de la sangre y de 
piel, por ejemplo, son constantemente renovadas por sus respectivas células 
progenitoras. Por lo tanto, esta proliferación de nuevas células tiene que ser
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compensada por la muerte de otras células. A este proceso se le conoce como 
homeostasis, aunque algunos autores e investigadores han sugerido homeocinesis 
como un término más preciso y elocuente. 
La homeostasis se logra cuando la relación entre la mitosis y la muerte celular se 
encuentra en equilibrio. Si este equilibrio se rompe, pueden ocurrir dos cosas: 
 Las células se dividen más rápido de lo que mueren, desarrollando un tumor. 
 Las células se dividen más lentamente de lo que mueren, produciéndose un 
grave trastorno de pérdida celular. 
Ambos estados pueden ser fatales o potencialmente dañinos. 
REGULACIÓN DEL SISTEMA INMUNITARIO 
SELECCIÓN NEGATIVA EN TIMO 
Este proceso que se lleva a cabo en el timo como etapa final de la maduración 
de los linfocitos T, tiene como objeto la eliminación, por apoptosis, de los clones de 
timocitos que hayan generado un receptor del linfocito T hacia el antígeno (TCR, de 
T cell receptor) con especificidad hacia un Ag propio. De esta forma se hace posible 
la autotolerancia en los organismos, es decir, la incapacidad de responder a un Ag 
propio y por lo tanto, de desencadenar procesos autoinmunes. En el timo tiene 
lugar la adquisición de tolerancia central hacia todos los Ag que puedan ser 
presentados por sus células, fundamentalmente proteínas ubicuas de membrana y 
suero. 
Se diferencia de la tolerancia periférica adquirida en otras etapas de la 
ontogenia hacia Ag propio que solo pueden ser presentados en los tejidos 
periféricos. La selección de los clones T autorreactivos se lleva a cabo en la etapa de 
doble positividad de los timocitos (CD4+, CD8+). Estos se unen con alta afinidad al 
MHC que contiene péptidos propios y que es presentado por células presentadoras 
de Ag (APC) del timo. Esta unión de alta afinidad dispara en el timocito el programa 
de muerte por apoptosis. Se conoce poco acerca de los mecanismos moleculares 
que dirigen este proceso, pero parece ser muy importante en él, la presencia de las 
dos moléculas CD4 y CD8. Este proceso de selección negativa, junto al de 
eliminación de timocitos con reagrupamientos incorrectos en su TCR, parece ser 
responsable de la muerte del 95% de linfocitos T durante los procesos de 
maduración en timo
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PATOLOGIAS VINCULADAS CON LA APOPTOSIS 
La apoptosis es una función biológica de gran relevancia en la patogenia de varias 
enfermedades estudiadas hasta el momento. Podemos destacar el cáncer, 
malformaciones, trastornos metabólicos, neuropatías, lesiones miocárdicas y 
trastornos del sistema inmunitario. 
ENFERMEDADES ASOCIADAS A INHIBICIÓN DE APOPTOSIS 
1. Cáncer: linfoma no Hodgkin folicular (Bcl-2 +), carcinoma (p53 +), tumores 
hormono-dependientes 
2. Enfermedades autoinmunitarias: lupus eritematoso sistémico, 
glomerulonefritis autoinmunitaria 
3. Infecciones virales: Herpes virus, Poxvirus, Adenovirus 
ENFERMEDADES ASOCIADAS A AUMENTO DE APOPTOSIS 
1. Sida 
2. Enfermedades neurodegenerativas: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de 
Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración 
cerebelosa 
3. Síndromes mielodisplásicos (MDS): anemia aplástica 
4. Daño isquémico: infarto de miocardio, apoplejía, daño por reperfusión, daño 
hepático por alcoholismo.
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LA APOPTOSIS EN EL SISTEMA CARDIOVASCULAR 
En el sistema cardiovascular la apoptosis puede ser parte del proceso de 
renovación, pero por defecto de mitosis o exceso de muerte celular, puede cons tituir 
un proceso patológico. 
En el ventrículo derecho ocurre una remodelación fisiológica después del 
nacimiento cuando ya éste ventrículo no tiene que cumplir con la función 
hemodinámica intrauterina. Una cantidad importante de células de ese ventrículo 
mueren de manera programada después del nacimiento. Esto suele durar apenas unos 
días, pero en ciertas condiciones se prolonga indefinidamente y ocurre la denominada 
miocardiopatía de Uhl, caracterizada por una dilatación extrema del ventrículo 
derecho con la consecutiva insuficiencia ventricular derecha. 
Otra enfermedad relacionada con la enfermedad de Uhl, en la que también se ha 
demostrado apoptosis, es la displasia arritmogénica del ventrículo derecho, en la que 
la infiltración fibrótica que sustituye al miocito apoptótico, crea el sustrato para 
arritmias potencialmente letales. 
Otra entidad en donde se ha demostrado muerte celular programada es la 
miocardiopatía dilatada, principalmente en su forma idiopática. En ella se ha 
demostrado que aproximadamente el 0,2 por ciento de las células tenían 
características apoptóticas. Esta cantidad aparenta ser poco influyente en la función 
del corazón, pero si se toma en cuenta que la muerte celular ocurre en cuestión de 
horas y si se trata de un proceso ininterrumpido sin replicación celular compensadora, 
alrededor del 50 por ciento de la masa ventricular se perdería en un año. 
La apoptosis parece también jugar un papel importante en la formación 
anatómica de los nodos sinusal y auriculoventricular. En efecto, una buena cantidad de 
pequeñas células P redondas u ovoides presentes en el nodo sinusal en el nacimiento 
va desapareciendo poco a poco por un proceso exclusivamente apoptótico, sin que 
medie el menor signo inflamatorio. Algo semejante ocurre en el nodo 
auriculoventricular. Las conexiones auriculoventriculares son eliminadas en la 
remodelación posnatal. La persistencia de algunas de estas conexiones podría ser el 
origen de algunos fascículos accesorios como aquellos que se encuentran en el 
síndrome de Wolf Parkinson White y en el bloqueo auriculoventricular acompañado de 
arritmias ventriculares. James ha demostrado muerte celular exagerada sin 
inflamación previa en el nodo sinusal de pacientes con síndrome de QT largo que 
tienen síncope y arritmias potencialmente letales.
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En la remodelación que ocurre en el tejido aparentemente sano después de un 
infarto del miocardio hay una reexpresión del programa fetal genético, con disfunción 
progresiva. Esta situación puede ser causada por la muerte programada de tejido 
viable y de hecho, se ha demostrado que en el tejido sano contiguo a la necrosis 
posinfarto hay células apoptóticas. 
Se han dado evidencias en tejido aislado, así como en modelos experimentales, 
que puede ocurrir apoptosis en respuesta a la isquemia-reperfusión, al infarto del 
miocardio, a la estimulación eléctrica rápida del miocardio, al estiramiento mecánico y 
a la sobrecarga debida a la constricción aórtica. También se ha visto que 
constantemente ocurre apoptosis miocárdica en órganos diana de ratas hipertensas. 
Un buen número de factores presentes en el corazón insuficiente, por ejemplo: las 
citoquinas inflamatorias, las especies de oxígeno reactivo, el óxido nítrico, la hipoxia, la 
reperfusión, los factores de crecimiento, y el estiramiento del tejido, estimulan la 
apoptosis en una variedad de células, entre ellas, las del miocardio. 
Una situación interesante y novedosa en donde se ha invocado la apoptosis es el 
llamado precondicionamiento isquémico que es aquella condición en la que un 
síndrome isquémico agudo protege de episodios de isquemia subsiguientes. Se ha 
demostrado en el corazón de rata in vivo sometido a episodios de isquemia transitoria, 
que las células apoptóticas disminuyen en relación con aquellos animales donde no se 
ha provocado precondicionamiento. 
El endotelio vascular, donde se originan una serie de hormonas paracrinas 
moduladoras de la vasoconstricción o vasodilatación producida por el músculo liso, 
está renovándose constantemente por apoptosis y replicación. En ocasiones, como en 
la hipertensión arterial, hay exceso de apoptosis endotelial que a su vez favorece la 
migración y el crecimiento del músculo liso arterial, lo que a su vez remodela el vaso y 
favorece la formación de ateromas. En la hipertensión pulmonar se ha visto que una 
enzima denominada Tenascina-C causa crecimiento de la capa muscular media y 
remodelación del vaso. Este proceso se acompaña de muerte celular programada. 
Todos estos hallazgos motivan cuestionamientos tales como: ¿Los 
procedimientos de detección son suficientemente sensibles y específicos? ¿la 
apoptosis es un fenómeno primario o secundario? ¿Cuál es el estímulo que inicia el 
proceso apoptótico en el corazón? ¿Acaso desde el nacimiento las células llevan un 
código genético que al ser estimulado por un factor interno o externo inicia un proces o 
de auto aniquilamiento o suicidio? 
En este final del siglo y en el umbral de próximo estas preguntas probablemente sean 
contestadas y surjan nuevos cuestionamientos. También es probable que la apoptosis 
pueda impedirse o al menos controlarse mediante terapia génica.
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  • 1. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página1 INTRODUCCIÓN La muerte celular comenzó a considerarse como un fenómeno fisiológico e importante dentro del proceso de desarrollo de los organismos poco después del descubrimiento, realizado sobre la mitad del siglo XIX, de que los organismos estaban compuestos por células. Las primeras observaciones de muerte celular fisiológica fueron realizadas en la metamorfosis de anfibios por Vogt en 1842 y posteriormente se realizaron estas mismas descripciones en otros tejidos en desarrollo, tanto de invertebrados como de vertebrados. El concepto de "muerte celular programada" fue acuñado por Lockshin y Williams en 1964 y describía la muerte de las células que ocurría en lugares y momentos determinados como eventos programados dentro del plan de desarrollo del organismo. Años después, en 1972, Kerr, Wyllie y Currie a partir de una recopilación de evidencias morfológicas, establecieron las diferencias entre dos tipos de muerte celular. La patológica que ocurre, por ejemplo, en el centro de una lesión aguda como trauma o isquemia, está caracterizada por la ruptura celular y recibe el nombre de necrosis celular, y la fisiológica, que ocurre durante el desarrollo o la hemostasis del organismo, que mantiene la integridad de la célula y a la que Kerr y sus colaboradores llamaron apoptosis. Según este grupo, la muerte por apoptosis respondía a un programa de muerte intracelular que podía ser activado o inhibido por una variedad de estímulos, tanto fisiológicos como patológicos. En 1982 tuvo lugar un descubrimiento que abrió las puertas al estudio profundo de las bases moleculares y genéticas del proceso de apoptosis. Horvitz publicó los estudios genéticos realizados sobre el nematodo caenorhabditis elegans en los que se describieron los genes encargados del control y la ejecución de la apoptosis en este organismo. Gracias a la homología existente entre estos genes en c. elegans y organismos superiores, la apoptosis en este nematodo ha sido tomada como referente del proceso en todos los sistemas y esto ha podido identificar una parte importante de la red de mecanismos que lo controlan.
  • 2. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página2 DEFINICIÓN Se considera a la apoptosis como un mecanismo fisiológico de muerte (inherente al desarrollo celular), que se desencadena por diversas señales, las cuales pueden ser fisiológicas, o por estimulaciones exógenas ambientales. Estas señales pueden actuar sobre receptores de superficie y causar la activación en cascada de proteínas citoplasmáticas; ello trae como resultado la activación de un programa genético que conduce, generalmente, a la nucleólisis por la acción de las endonucleasas. Este mecanismo de muerte celular interviene en importantes fenómenos fisiológicos como: embriogénesis, mantenimiento de la homeostasia, renovación tisular y desarrollo y funcionamiento del sistema inmunitario. Los trastornos en la regulación de la apoptosis por diferentes vías, están presentes en la etiopatogenia de diversas enfermedades autoinmunes, neurodegenerativas, y también se sugiere que participen en el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Debido a que la apoptosis puede considerarse como un proceso de eliminación de células defectuosas, la desregulación de los genes que codifican las proteínas relacionadas con la apoptosis, puede ser la causa del desarrollo de diversos tumores.
  • 3. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página3 MODELO INICIAL: C.ELEGANS Dentro del estudio del proceso de apoptosis que se ha venido realizando a lo largo de los últimos años, resultó determinante la descripción de los genes implicados en la maquinaria de apoptosis del nematodo caenorhabditis elegans. C. elegans pertenece a un filo formado por: "Gusanos de piel lisa, no segmentados, con un cuerpo alargado, cilíndrico y forma afilada en el extremo. Incluye formas libres y parásitas, ambas acuáticas y terrestres" Es un organismo de aproximadamente 1mm de longitud, vive en el suelo sobre materia vegetal en descomposición, alimentándose de microorganismos. Su vida se prolonga a lo largo de 2-3 semanas durante las cuales se reproduce. El estudio de este nematodo fue iniciado en los años 60 por Sydney Brenner. La ventaja que proporciona c. elegans como sistema experimental es que posee 959 células somáticas transparentes, que pueden ser estudiadas individualmente mediante microscopía, y 17800 genes diferentes que forman su mapa genético secuenciado íntegramente. Este organismo, a pesar de su simplicidad, desarrolla los procesos que en organismos superiores son motivo de estudio: embriogénesis, desarrollo, funcionamiento del sistema nervioso, comportamiento y envejecimiento. C. elegans representa el compromiso perfecto entre la simplicidad en su tratamiento y la complejidad de las funciones y los mecanismos que posee, regidas por genes que se han conservado a lo largo de la evolución hasta los mamíferos. La apoptosis juega un importante papel en el desarrollo embrionario de c. elegans. A partir de los estudios que Horvitz inició en 1986, se estableció el número y la localización de las células que morían por apoptosis durante el desarrollo y mediante el análisis de mutantes se describieron los genes implicados en este mecanismo. Estos genes se denominaron ced y se enumeraron desde el -1 al -10. Ced- 3. -4 y -9 regulan la fase ejecutora de la apoptosis y el resto está implicado en los procesos de eliminación por fagocitosis de la célula apoptótica. Posteriormente se describió el gen EGL-1 que participa también en la regulación de la MCP. El complejo ejecutor formado por ced-3, -4 y -9 representa la imagen más simplificada del programa apoptótico que se puede encontrar en células de mamíferos. Cada una de las proteínas expresadas a partir de ellos son equivalentes a las que, en organismos superiores, constituyen los pilares que soportan la red de señalización de la apoptosis. CED-3 es una proteasa equivalente a las caspasas de mamíferos, proteínas ejecutoras de la apoptosis que desmontan la maquinaria celular degradando un grupo seleccionado de proteínas. CED-3 se activa por homodimerización y para hacerlo posible, existe otra proteína CED-4 capaz de interaccionar con ella y también consigo misma. La unión de CED-3 a CED-4 y la posterior homodimerización de esta,
  • 4. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página4 traería consigo la activación de CED-3. CED-4 tiene también su homologo en mamíferos, Apaf-1, que se une a procaspasa-9 y facilita su activación. La tercera proteína de esta maquinaria es CED-9, la pieza reguladora, que se une a CED-4 y la inhabilita para mediar la activación de CED-3, al impedir su homodimerización. Su interacción con una proteína pro-apoptótica como es EGL-1 en c. elegans, la separa de CED-4 dejándola realizar su función activadora de la apoptosis. En mamífero, esta proteína es equivalente a toda una familia con miembros tanto pro-apoptóticos como anti-apoptóticos que regulan el proceso de muerte celular. Las moléculas equivalentes entre los sistemas que se han mencionado anteriormente, presentan tal homología de secuencias que muestran que este sistema se ha mantenido totalmente conservado a lo largo de la evolución. Los componentes del sistema que parece que han sido de adquisición más recientes son los receptores de muertes, ya que ningún equivalente de ellos ha sido encontrado aún en c. elegans. De esta forma, el estudio del nematodo c. elegans estableció las bases para la caracterización, que hoy día aún es incompleta, de la compleja red de procesos que culminan con la apoptosis celular y que a continuación s e resumen.
  • 5. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página5 DIFERENCIAS ENTRE APOPTOSIS Y NECROSIS Mientras la apoptosis está caracterizada por una activa participación de la propia célula que está falleciendo, incluso hasta el punto de sintetizar de novo (en algunos tipos celulares) los efectores de su muerte celular, la necrosis es un proceso pasivo, catabólico y degenerativo. La necrosis también recibe otros nombres como muerte accidental u oncosis. La necrosis generalmente representa una respuesta celular a una lesión y puede ser inducida por una sobredosis de agentes citotóxicos, un choque de pH, hipertermia, hipoxia, trauma directo, un choque ácido, etc. Un acontecimiento temprano de la necrosis es la pérdida de control de la permeabilidad de la membrana plasmática. Como consecuencia de ello se establece un flujo anormal de iones hacia el interior celular que va acompañado de la entrada pasiva de agua. La entrada de agua provoca que tanto la célula como algunos de sus orgánulos membranosos (mitocondria, retículo endoplásmico, etc) se hinchen y finalmente estallen. Después la membrana plasmática se rompe y se liberan constituyentes citoplásmicos, incluyendo enzimas proteolíticas (Majno G, Wyllie AH ). En la cromatina nuclear aparecen áreas de condensación desigual y en núcleo sufre una lenta disolución (cariolisis). La necrosis desencadena una reacción inflamatoria en el tejido que a menudo produce formación de cicatriz. La degradación del DNA no es tan excesiva durante la necrosis como en la apoptosis, y los productos de degradación son de tamaño variable que forman bandas discretas en los geles de electroforesis. APOPTOSIS NECROSIS CAUSAS Falta factores de crecimiento Influencia hormonal Toxicidad suave Anoxia Daño físico o químico MORFOLOGÍA Célula encogida Célula inflada NÚCLEO Condensación Segmentación Fragmentación del ADN Degradación del ADN MEMBRANA CELULAR Protuberancias, cambios en la distribución de la fosfatidilserina Lisa, lisis MITOCONDRIA Cambios moleculares Inflamiento EXPRESIÓN Expresión génica Síntesis proteica Activación de proteasas ------
  • 6. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página6 MORFOLOGÍA La apoptosis se considera, morfológica y bioquímicamente, diferente a la muerte celular por necrosis osmótica. En la necrosis, un grupo de células, ante estímulos externos, pierden la integridad de membrana alterando la regulación de la homeóstasis iónica celular y permitiendo un gran edema intracelular y la destrucción de organelas; como consecuencia se provoca una intensa respuesta inflamatoria que participará, igualmente, en la fagocitosis del detritus celular. Los rasgos morfológicos de la apoptosis difieren de los de la necrosis observándose mejor con microscopía electrónica. Inicialmente se produce la constricción de la membrana, disminuyendo el tamaño celular y agrupando las organelas, dándole al citoplasma un aspecto más denso. Los cambios nucleares son los rasgos más característicos. La cromatina se condensa en la periferia, por debajo de la membrana nuclear, en masas densas bien definidas. Posteriormente el núcleo se fragmenta, formándose, al mismo tiempo, vesículas citoplasmáticas y los denominados cuerpos de apoptosis. Estos cuerpos apoptóticos se componen de citoplasma y 70 organelas muy agrupadas, pudiendo contener también fragmentos nucleares, rodeados siempre de membrana. Los cuerpos de apoptosis serán fagocitados por las células sanas adyacentes del parénquima o por macrófagos, donde se degradaran con rapidez dentro de los lisosomas, gracias a su actividad enzimática. Seguidamente las células adyacentes serían capaces de migrar o proliferar reemplazando así el espacio ocupado por la célula apoptótica suprimida. La apoptosis afecta a células aisladas o racimos celulares pequeños. Histológicamente, con tinción de hematoxilina eosina, la célula apoptótica suele reconocerse como una masa redondeada u oval de citoplasma, fuertemente eosinófilo, con fragmentos de cromatina nuclear densa. La constricción celular y la formación de cuerpos apoptóticos tienen un comienzo abrupto con una duración de pocos minutos; sin embargo los cuerpos de apoptosis permanecen en el tejido aproximadamente 2 horas hasta que sean fagocitados y degradados.
  • 7. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página7 CARACTERISTICAS Una célula que va a sufrir apoptosis activa una cascada de eventos moleculares que culminan en su total desintegración. Muchos de estos cambios son característicos y parecen ser únicos a la apoptosis por lo que pueden ser utilizados para identificar este modo de muerte celular. Uno de los eventos más tempranos de la apoptosis es la deshidratación celular. La pérdida del agua intracelular conlleva la condensación del citoplasma y cambios en la forma y el tamaño celular: Las células que eran redondas originalmente aparecen elongadas y, generalmente, más pequeñas. Otro cambio, quizá el más característico de la apoptosis, es la condensación de la cromatina nuclear. La condensación comienza en la periferia nuclear, y la cromatina condensada a menudo adquiere una forma cóncava que se asemeja a una media luna. El DNA en la cromatina condensada presenta hipercromasia y se marca intensamente con sondas fluorescentes. La envuelta nuclear se desintegra, la laminilla sufre degradación proteolítica y, por último, se produce la fragmentación nuclear. Algunos fragmentos nucleares, que se tiñen uniformemente con sondas de DNA y que parecen gotitas de DNA de diferentes tamaños, están dispersos en el citoplasma. Estos
  • 8. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página8 fragmentos nucleares junto con los constituyentes del citoplasma (incluyendo orgánulos intactos), son empaquetados y envueltos por fragmentos de membrana plasmática. Estas estructuras, denominadas cuerpos apoptóticos, son emitidas por las células apoptóticas. Cuando la apoptosis sucede in vivo , los cuerpos apoptóticos son fagocitados por las células vecinas como fibroblastos o células epiteliales (y no necesariamente por macrófagos profesionales) sin desencadenar ninguna reacción inflamatoria en el tejido. La activación de endonucleasas que cortan preferencialmente en secciones internucleosomales es otra característica específica de la apoptosis. Los productos de la degradación del DNA son fragmentos nucleosomales u oligonucleosomales que generan el característico patrón en escalera en electroforesis de geles de agarosa. Como el DNA de las células apoptóticas está parcialmente degradado, la fracción de bajo peso molecular puede ser extraída fácilmente. Otra característica específica de la apoptosis es la preservación, al menos en la fase inicial de la apoptosis, de la integridad estructural y de la mayoría de las funciones de la membrana plasmática. También, los orgánulos celulares incluyendo la mitocondria y los lisosomas, permanecen preservados durante la apoptosis, aunque el potencial transmembrana de la mitocondria está enormemente decrementado. Otras características de la apoptosis son la movilización del catión calcio (Ca 2+ ) intracelular ( McConkey DJ ), la activación de la transglutaminasa que une proteínas citoplásmicas, la pérdida de microtúbulos, pérdida de la asimetría de los fosfolípidos de la membrana plasmática que permite la exposición de la fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmática, y otros cambios de la membrana plasmática que precondicionan a los restos de las células apoptóticas a ser objetivos de las células fagocíticas. La duración de la apoptosis puede variar, pero generalmente es corta (3-6 horas), incluso es más breve que la duración de la mitosis. De esta forma, bajo condiciones de homeostasis, cuando la proporción de células muertas está equilibrada por la tasa de proliferación celular, el índice mitótico puede exceder del índice apoptótico. Más recientemente apareció el término anoikis que es la apoptosis inducida por la pérdida de anclaje de la célula a la matriz extracelular o porque las interacciones célula-matriz son insuficientes o inapropiadas. Este proceso parece relacionado con las integrinas que son glucoproteínas integrales de la membrana plasmática que intervienen en la adhesión con las células de la matriz extracelular, en su migración, en la organización del citoesqueleto y en la transducción de señales. De hecho, Rytömaa et al comprueban que la pérdida de anclaje de determinadas células epiteliales provoca una fuerte activación de caspasa-8 y caspasa-3.
  • 9. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página9 FAMILIAS DE MOLÉCULAS IMPLICADAS EN EL PROCESO DE APOPTOSIS RECEPTORES DE MUERTE Las moléculas relacionadas con el proceso de apoptosis que se han mantenido a lo largo de la evolución, desde organismos como el c. elegans hasta los mamíferos, llevan a cabo un programa de apoptosis iniciado por señales que provienen del interior celular. Estas señales responden a eventos que comprometen el buen funcionamiento de la célula dentro del entorno donde está situada: pérdida de contacto con las células que la rodean, estrés celular o señales contradictorias y simultáneas en cuanto a la puesta en marcha o no, de su ciclo de división. Ante esta situación, en que la célula es potencialmente peligrosa para el sistema donde se encuentra integrada, se pone en marcha la maquinaria de apoptosis y es eliminada. Este sistema señalizador no puede sostener el tipo de apoptosis llamado "instructivo" en el cual a una célula que no ha sufrido ninguno de los daños mencionados anteriormente, se le dirige activamente hacia la apoptosis ya que su eliminación es necesaria para llevar a cabo determinado proceso fisiológico. Los mamíferos han desarrollado mecanismos para llevar a cabo esta forma de apoptosis que es especialmente importante dentro del sistema inmune. En la apoptosis "instructiva" tienen un papel fundamental los llamados receptores de muerte, situados en la superficie de la célula, y que reciben la señal de ligandos de muerte específicos para cada uno de ellos. Los receptores pueden dar la
  • 10. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página10 señal directamente a las caspasas en pocos segundos disparando así el programa de apoptosis. Los receptores de muerte pertenecen a la superfamilia del receptor de TNF (TNFR) cuyos miembros tienen en común un dominio extracelular rico en cisteína. Otro rasgo común a todas estas moléculas señalizadoras de apoptosis es la presencia de una secuencia situada en su dominio intracitoplasmático y que serviría para acoplar al receptor con el resto de la maquinaría apoptótica. Los receptores de muerte mejor caracterizados son los siguientes: CD95 (APO-1/Fas) Esta proteína fue identificada inicialmente mediante un Ac dirigido contra ella y que define un Ag presente en la superficie de células como linfocitos humanos B y T activados, algunas líneas tumorales de origen linfoide y otros tipos celulares como son los hepatocitos. El Ac contra CD95 se une a las células que lo expresan provocándoles apoptosis in vitro. Por otra parte, inyectando in vivo Ac anti-CD95 a ratones nu/nu con xenotransplantes de tumores humanos, eliminaban estos por apoptosis de sus células. El gen que codifica para la proteína CD95 en humano se encuentra en la localización 10q23 (cromosoma 10) y consiste en una serie de 9 exones interrumpidos por 8 intrones. El dominio extracelular de la proteína está formado por tres subdominios ricos en cisteínas, codificados por los exones 2, 3 y 4, mientras que la zona intracitoplasmática, incluida la región reguladora llamada "death domain" (dominio de muerte), se encuentra en el exón 9. El ligando fisiológico de CD95 se denomina CD95L y es una proteína perteneciente a la familia del TNF (tumor necrosis factor). CD95 se expresa de forma bastante general en los distintos tejidos. La proteína ha podido ser detectada en células epiteliales, fibroblastos, osteoblastos y ciertos tipos de endoteliales, además en ratón, el ARNm de la proteína se ha detectado abundantemente en timo, corazón hígado y ovario. Por otra parte, CD95L se expresa predominantemente en células T y NK activadas, así como de forma constitutiva en los tejidos que gozan de "privilegio inmune". Este patrón de expresión de ambas moléculas demuestra que deben tener implicación en una serie importante de procesos fisiológicos relacionados con el sistema inmune.
  • 11. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página11 Resulta importante a la hora de determinar el papel jugado por algunas moléculas, estudiar el efecto que tiene su pérdida de función en ratones "knockout". En el caso del par CD95/CD95L, existen ratones que portan las mutaciones homocigóticas lpr (lymphoproliferation) o gld (general lymphoproliferation disease), que se traducen por una pérdida de función de los genes CD95 y CD95L respectivamente. Estos ratones presentan una serie de alteraciones como son linfoadenopatías y esplenomegalia por acumulación de células de origen T CD4- CD8-, niveles elevados de autoAc y desordenes de carácter autoinmune e inflamatorio. En el caso de las moléculas CD95/CD95L, existe también un referente humano de la pérdida de su función, ya que se ha descrito en una serie de niños una mutación con carácter heterocigótico en el gen que codifica CD95. Esta mutación da lugar a un fenotipo similar al de los ratones lpr y gld, incluyendo linfoadenopatías, esplenomegalia, hipergammaglobulinemia y, de forma variable, una serie de alteraciones autoinmunes. Estos datos, tanto en ratón como en humano, han resultado de ayuda a la hora de establecer una serie de procesos fisiológicos en los que la implicación de la apoptosis mediada por la pareja de moléculas CD95/CD95L está perfectamente demostrada. Estos procesos son: Modulación negativa de la respuesta inmune mediante la muerte por apoptosis de las células T activadas una vez realizada su función. De esta forma se evita su acumulación. También parece estar implicada en la delección de clones autorreactivos de linfocitos B. Mecanismo efector de citotoxicidad por parte de linfocitos T y células NK. Se ha demostrado un papel importante de la apoptosis vía CD95 en la citotoxicidad mediada por células T y NK. Este mecanismo ocurre en unión al clásico, mediado por perforina /granzima B. Existen órganos, como el ojo o testículos; cuya estructura no podría soportar los efectos de una respuesta inmune y su proceso inflamatorio asociado. Estos tejidos están aislados a estos procesos y se conocen como "sitios de privilegio inmune". Se pensaba que este "privilegio" se mantenía evitando la entrada de células activadas en ellos. Recientemente, se ha propuesto otro mecanismo de conservación del privilegio inmune. Las células activadas pueden entrar en estos tejidos pero, una vez allí, son eliminadas por apoptosis vía CD95. Esto se confirmó con el hallazgo de una expresión constitutiva de CD95L en el epitelio y endotelio de la cornea y el iris, en las células ciliares del ojo, así como en las células de Sertoli en el testículo, y con la observación de que, en ratones gld, se produce una inflamación masiva en la retina tras la infección con virus de herpes simple a diferencia de los ratones wild-type que no presentan apenas células inflamatorias.
  • 12. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página12 TNFR1 El receptor 1 de TNF es una proteína de aproximadamente 55 kDa y se expresa en la mayoría de los tipos celulares. Esta proteína da nombre a la familia en que está integrada, por tanto comparte con CD95 los tres subdominios ricos en cisteínas situados en la zona extracelular. El ligando de TNFR1 es TNF, una citoquina producida principalmente por macrófagos activados y células T en respuesta a infección. A diferencia de la pareja formada por CD95/ CD95L, el par TNFR1/TNF es capaz de trasmitir a la célula dos tipos de señales muy distintas entre sí:  Por una parte, la unión de TNF a su receptor TNFR1 activa a los factores de transcripción NFkB y AP-1 dando lugar a la inducción de genes de carácter proinflamatorio e inmunomodulador.  Por otra parte, esta unión puede dar lugar también a una señal de apoptosis. La señalización de apoptosis por medio de TNFR1 es mucho más limitada que la mediada por CD95. En el caso de TNFR1, la unión de su ligando solo señaliza apoptosis en algunos tipos celulares y solo cuando la síntesis de proteínas ha sido bloqueada. De este hecho se deduce que debe existir en las células algún factor que bloquee las señales de apoptosis derivadas de TNFR1. La expresión de este factor estará probablemente controlada a través de NFkB y JNK/AP-1. DR3 El receptor DR3 (death receptor 3) es muy parecido en cuanto a su secuencia, a TNFR1. Cuando se une a su ligando Apo3L, da lugar también a una doble señal que puede llevar a la activación de NFkB o a la muerte por apoptosis de la célula. Las moléculas que median ambas vías de la señalización son también las mismas que en el caso de TNFR. En el único aspecto en que existen diferencias entre ambas rutas de señalización es la expresión, tanto de receptores como de ligandos. El mensajero de Apo3L se encuentra expresado de forma constitutiva en muchos tejidos, mientras que DR3 se encuentra presente principalmente en bazo, timo y sangre periférica y se induce por la activación en linfocitos T. De forma inversa, es el receptor de TNF el que se encuentra expresado de forma ubicua mientras que el ligando se expresa solo en linfocitos y macrófagos activados. Esta diferencia sugiere distintas funciones biológicas para ambas vías señalizadoras.
  • 13. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página13 DR4 y DR5 DR4 y DR5 son receptores de muerte cuyo ligando llamado TRAIL o Apo2L es el que muestra más similitud con CD95L aunque, a diferencia de estas molécula, su ARN mensajero se encuentra expresado de forma constitutiva en gran cantidad de tejidos y la expresión se eleva en linfocitos T de sangre periférica cuando estos son estimulados. La señal a través de Apo2L produce apoptosis en una gran variedad de líneas tumorales. Se ha descrito también en una subpoblación de células T maduras, un aumento de la apoptosis mediada por Apo2L al tratar estas con IL-2. Esto puede sugerir un posible papel de estos receptores en la delección periférica de los linfocitos T. Otro posible papel de la apoptosis mediada por Apo2L es la eliminación de células infectadas por virus. La señal de apoptosis mediada por estos receptores puede ser regulada mediante una familia de receptores "decoy" (señuelos), DcRs, que protegen a la célula de la apoptosis provocada por la unión de TRAIL. Uno de los miembros de esta familia es DcR1 (TRID, TRAIL-R3 ó LIT), una proteína ligada a la superficie celular por una unión glicosil fosfatidil-inositol (GFI), que se asemeja a la porción extracelular de DR4 pero sin poseer ningún dominio intracitoplasmático. DcR1 es capaz de unirse a TRAIL y su transfección en células sensibles a esta vía de señalización reduce notablemente la apoptosis mediada por esta señal. DcR2 (TRAIL-R4 ó TRUNDD) es también un receptor homologo a DR4 y DR5 con el dominio intracitoplasmático truncado. Se ha demostrado que la transfección con DcR2 inhibe la apoptosis mediada por TRAIL de forma no activa, ya que la eliminación de su dominio interno no influye en su actividad inhibidora. Todos estos datos indican que, tanto DcR1 como DcR2 compiten con DR4 y DR5 por la unión de TRAIL, dificultando así que la señal de apoptosis sea transmitida a través de estos receptores. Secreción de microvesículas con marcaje exclusivo de APO2L/TRAIL tras estimulación de blastos T humanos a través de CD59. Inmuno-microscopía electrónica de transmisión, muestras preparadas por ultracriomicrotomía (de Monleón et al., J. Immunol. 167:6736, 2001)
  • 14. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página14 GENES REGULADORES DE LA APOPTOSIS Las reglas fisiológicas de la señal apoptótica en los mamíferos son cruciales y complejas. El nemátodo Caenorhabditis Elegans ha sido un buen modelo para estudiar los componentes de la muerte celular, ya que lleva a cabo una apoptosis programada durante el desarrollo. Además muchos de los componentes de la maquinaria de la apoptosis, están conservados en mamíferos. En los estudios genéticos del C. Elegans se identificaron tres productos génicos esenciales: CED-3 y CED-4 que favorecen la apoptosis, y CED-9 que la inhiben. CED-3 es una proteína específica de la cascada efectora de la apoptosis. CED-4 es homólogo al Apaf-1, factor promotor de la apoptosis en mamíferos, que se uniría a CED-3 y promueve su activación. Mientras que el CED-9, en condiciones normales, se uniría a CED-4 y CED-3 formando un complejo, que mantiene al CED-3 inactivo. El estímulo apoptótico produciría la disociación de dicho complejo, permitiendo la activación del CED-3. Estos tres productos génicos tienen homología de secuencia y función con productos génicos en mamíferos así: las caspasas de las células de mamífero son similares a CED-3; Apaf-1 es el único homólogo de CED-4 en mamíferos conocido; y algunos productos de genes de la familia de bcl-2 se relacionan con CED-9. Aunque los mecanismos bioquímicos y genes implicados en este proceso son en gran parte desconocidos, se han identificado numerosos genes que codifican productos que influyen en la susceptibilidad celular para entrar en la apoptosis. Entre ellos podemos distinguir activadores e inhibidores de la muerte celular programada. FAMILIA Bcl 2 – Bax Bcl-2 fue el primer miembro encontrado en una familia creciente de genes implicados en la regulación de la apoptosis que, a diferencia de otro oncogenes, prolonga la supervivencia celular bloqueando específicamente la muerte celular por apoptosis. El gen bcl-2 (B-cell Lymphoma 2) se identificó hace más de una década, con el análisis y descubrimiento de la translocación 14;18 (q32,q21), en el cromosoma 18. Esta translocación es la aberración cromosómica más común en los linfoma no Hodgkin, alcanzando el 70-80 % en los linfomas foliculares. En este caso la secuencia de bcl-2 se yuxtapone al gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig H), en la
  • 15. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página15 región 14q32. Sin embargo, la translocación no se traduce en una interrupción de la región codificante del bcl-2, sino en el gen de la Ig H. Consecuentemente, bajo el control del gen promotor de las inmunoglobulinas, se produce la sobreexpresión, tanto del ARNm como del producto proteico, de bcl -2 en estos linfomas y como consecuencia, una disminución de la muerte de los linfocitos B afectados. Esta prolongación de la vida de las células B es un evento crítico en la génesis del linfoma folicular. Por otro lado, y accidentalmente, se observó que este gen, activado por la traslocación 14;18, permitía la supervivencia de células hematopoyéticas citoquin-dependientes, en estado quiescente, en ausencia de citoquina263. Este hallazgo se verificó en otras líneas celulares en ratones transgénicos, estableciéndose que la supervivencia y la proliferación celular estaban directamente relacionados con una sobreexpresión de bcl-2. Bcl-2 Es la proteína prototipo de esta familia. Pesa 26 KDa y posee los cuatro dominios que la definen (BH1-BH4). Bcl-2 es una proteína integral de membrana y se encuentra en la cara citoplasmática de la membrana externa de la mitocondria, el retículo endoplásmico y la envuelta nuclear. Es en esas membranas, gracias a que puede formar una estructura similar a un poro, donde se desarrolla una de sus posibles funciones: modificar el flujo de moléculas o pequeñas proteínas a través de ellas, interviniendo en la estabilidad de orgánulos como la mitocondria ante la existencia de posibles daños.
  • 16. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página16 Su sobreexpresión puede evitar o al menos retrasar varias formas de muerte celular programada como las inducidas por retirada de factores de crecimiento, irradiación g, glucocorticoides y múltiples drogas quimioterápicas. En contraste, parece no influir en otros mecanismos de apoptosis como, por ejemplo, la señalización vía CD95 en la mayoría de los tipos celulares. A la hora de establecer el papel fisiológico realizado por Bcl-2, debe estudiarse el fenotipo que presenta el ratón knockout para el gen que lo codifica. El animal se desarrolla normalmente pero termina mostrando una exagerada apoptosis de linfocitos y melanocitos, así como lesiones neuronales e intestinales y una enfermedad renal terminal. Esto lleva a pensar que Bcl-2 no tiene un papel muy importante, o al menos tiene un papel redundante, en el desarrollo embrionario pero, ya después, interviene en la regulación de la apoptosis en linfocitos, neuronas y el resto de células y tejidos mencionados anteriormente. Bcl-x El gen bcl-x está colocado en una forma larga (L) y en una forma corta (S). La proteína producida por la forma larga, Bcl-XL, tiene un 47% de hohmologia con el bcl-2 y una distribución celular semejante a este, lo que sugiere que ambas proteínas funcionan de una manera similar. Por el contrario, el producto derivado de la forma corta, Bcl-XS, antagoniza con la inhibición de la muerte celular programada por las dos anteriores. Bax La primera proteína conocida asociada con bcl-2 in vivo fue bax ( bcl-2-associated protein x), una proteína de 21 kD con la habilidad de suprimir la capacidad de bcl -2 para bloquear la apoptosis. En algunos tejidos incluyendo mama, estómago, piel, ganglios linfáticos, colon e intestino delgado, entre otros, los patrones de expresión de bax y bcl -2 están regulados de forma paralela, lo que sugiere que existe un antagonismo activo entre ambas proteínas. Por otro lado, también se ha visto que la expresión de bax se localiza, especialmente, en áreas cuyas células tienen una alta tasa de apoptosis. Se han propuesto varios mecanismos para explicar el papel regulador de sta interacción proteína-proteína en el control de la apoptosis:  Bax podría funcionar como una molécula inductora de muerte celular, que es neutralizada por bcl-2.
  • 17. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página17  Bcl-2 podría funcionar como un represor de muerte celular que es neutralizado, por competencia, con una molécula inerte de bax.  Bcl-2 podría tener una función bioquímica totalmente expuesta a bax. En otros tejidos se distribuye paradójicamente. Así, en algunas células de larga vida como neuronas del sistema nervioso central, la expresión de bax es alta, mientras que en células de corta vida tales como granulocitos y timocitos corticales su expresión es nula o escasa, lo que sugiere que , o bien la vía bcl-2/bax no es responsable de la regulación de la vida y la muerte en estas células, o bien que otros miembros de la familia bcl-2, son expresados en estas células y contribuyen a la regulación de la muerte celular. Sin embargo, las neuronas están entre las células más sensibles para la inducción de muerte celular por pérdida de factores de supervivencia (neurotrofinas), hipoxia, hipoglucemia y una variedad de otros insultos. Por tanto, los altos niveles de bax encontrados en varios tipos de neuronas del sistema nervioso central, además de poder contribuir a su inherente estado de vulnerabilidad, sugieren que bax por sí sólo, es insuficiente para poner en marcha la vía de la muerte celular en estas células, e implica un antagonismo activo entre bax y presumiblemente otros miembros de la familia de proteínas bcl-2 para mantener la supervivencia de esa células de larga vida. Bak La proteína Bak (Bcl-2 homologous antagonist/Killer) aumenta la tasa de apoptosis inducida por deprivación de factores de crecimiento de fibroblastos, neuronas y células linfoides murinas, lo que sugiere que funciona principalmente como un promotor de apoptosis. Bak se expresa ampliamente en epitelios complejos incluyendo nasofaringe, esófagos, colón y vejiga, en los cuales tiene un papel pro-apoptótico. Mcl-1 El gen Mcl-1 (Mieloid cell leukemia-1), descubierto en células de la leucemia mieloblástica, funciona de manera similar a bcl-2 bloqueando la apoptosis en células hematopoyéticas mas diferenciadas. Este gen codifica una proteína de 37 KD que tiene una homología significativa con bcl-2, pero al contrario que esta su expresión es mayor en las células más diferenciadas de epidermis, intestino, colón, próstata, nasofaringe y
  • 18. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página18 vía aérea superior. Esto sugiere que ambos desempeñan funciones diferentes en la regulación in vivo de la apoptosis. MECANISMOS DE ACCIÓN Los miembros de la familia pro y anti-apoptótica pueden formar dímeros; si las parejas son idénticas se denomina homodímeros, y si son diferentes heterodimeros. Algunos de los miembros de la familia forman homodímeros (bcl-2, bax, bcl-xL y bcl-xS), y otros, como el bcl-2, pueden formar heterodímeros con bax, bcl-x S, A1 y Bad. A su vez bax puede heterodimerizar con bcl-2, bcl-xL, Mcl-1 y A1 y bcl-xL puede heterodimerizar con bax, bad y bcl-xL. A pesar de que algunas células usan preferentemente uno de los miembros de la familia como factor de supervivencia, la mayoría de las células eucariotas presentan una tremenda redundancia en la expresión de los miembros de la familia de bcl-2. Por ejemplo, cuando bax aparece como un homodímero aumenta la sensibilidad de las células ante el estímulo apoptótico, sin embargo, si forma heterodímeros con proteínas antiapoptóticas, actúa protegiendo a la célula de la apoptosis. Por otro lado bad puede formar heterodímeros con las moléculas antiapoptóticas, permitiendo al bax aumentar su función proapoptótica. Se ha establecido que los dominios BH1, BH2, y BH3 ejercen una fuerte influencia en la formación de homo o heterodímeros. Para la actividad proapoptótica, la formación de heterodímeros es esencial en el grupo de dominio BH3 que actúan a través de ligandos, pero no para el grupo Mtd ya que esas tienen un impacto citotóxico independiente dañando las organelas directamente. Incluso ante la presencia de inhibidores de caspasas, las proteínas bax o bax-like conducen a la muerte celular, por permeabilidad mitocondrial formando canales iónicos en su membrana.
  • 19. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Los estímulos mitógenos hacía myc activan tanto el crecimiento celular como la apoptosis, pero esta última está regulada por la disponibilidad de los factores anti-apoptóticos como el bcl-2. Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página19 GEN c-myc El gen c-myc es un elemento importante en el control de la proliferación celular. La sobreexpresión de c-myc puede inducir bien proliferación o bien apoptosis, y la decisión celular entre esas dos respuestas está determinada por otras señales tales como la presencia de factores de crecimiento u otros estímulos de supervivencia como el bcl-2. Por lo tanto, el efecto de cmyc, como el de p53, está en función del tipo celular y de estímulos específicos y no es necesario para todas las formas de apoptosis. GEN DE SUPRESOR TUMORAL p53 P53 es un regulador fundamental en el normal crecimiento y la homeostasis de células y tejidos. El gen p53 fue identificado y descrito, por primera vez, en 1979, en las células transformadas por el virus SV40, formando un complejo con el antígeno T, el producto proteico de dicho virus. Dado que dicho antígeno es necesario para mantener el fenotipo transformado, se sugirió que esta interacción era importante para la transformación y por ello, inicialmente se pensó que pertenecía a los oncogenes y actuaba como acelerador del ciclo celular. Diez años más tarde, se mostró que todos los clones obtenidos eran formas mutantes de p53 y se planteó que este fuera un gen supresor tumoral que regularía el ciclo celular. Esta hipótesis se reforzó al evidenciarse que la expresión de clones de p53 sano suprimía la transformación de células en cultivo activadas por oncogenes, el crecimiento de células en cultivo y el potencial tumorogénico de células en animales. Por ello, y por el hecho de la frecuente delección de la zona del gen en varios tumores, se llegó a la conclusión de que p53 era efectivamente un gen supresor tumoral. No obstante puede comportarse como un oncogén en algunas formas mutantes.
  • 20. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página20 EL GEN p53 Y SU PROTEÍNA Se localiza en el brazo corto del cromosoma 17 (17 p13), esta constituido por 11 exones dentro de un dominio cromosómico de 20 kb. En condiciones normales actúa como “guardián del genoma” previniendo la proliferación de células que presenten un DNA dañado. Esta función es realizada por la proteína p53 normal (“wild type”) que recibe ese nombre por ser una fosfoproteína nuclear de 53 Kda, constituida por 393 aminoácidos. Contiene tres dominios, con diferentes funciones. La región N-terminal principalmente controla la transactivación transcripcional, mientras que la región carboxi-terminal controla la oligomerización, modulando la unión de los tetrámeros al DNA. La mutación a este nivel puede trasladar la localización de la proteína del núcleo al citoplasma. Además, dentro de la región C-terminal, existe otra zona adicional que regula el cambio de la forma latente a la forma activa de la proteína, para la unión con secuencias específicas. Por último, el dominio central es la región por la que se une la proteína como tetrámero, a la secuencias dianas de los genes en el DNA. Esta zona está muy conservada entre las especies y, es donde se encuentran la mayoría de las mutaciones en tumores humanos. Dichas mutaciones interfieren con el plegamiento tridimensional de la proteína y por lo tanto, con la interacción en el DNA, evitando así la activación transcripcional de los genes “downstream”. Es una fosfoproteína constituida por 393 aminoácidos distribuidos en 11 exones, el primero no codificante. El dominio central hidrofóbico es el que se une como tetrámero al DNA dañado. La región N-terminal principalmente controla la transactivación transcripcional, mientras que la región carboxi-terminal controla la oligomerización, modulando la unión de los tetrámeros al DNA.
  • 21. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página21 ACTIVACIÓN Y FUNCIÓN La proteína p53 intracelular se determina, principalmente, por la cantidad de proteína que se degrada, más que por el exceso de formación de la misma. La degradación es un proceso proteolítico ATP-dependiente, mediado por ubiquitina, y la proteína MDM-2 (Murine doublé minute) que estimula el proceso de unión entre esta y el extremo carboxi-terminal de la p53. El oncogen MDM2, codifica una proteína de 90 kD que forma un complejo estable con p53, inhibiendo su unión secuencia-específica al ADN. Por ello, la sobreexpresión de MDM2 inhibe la capacidad de p53 para estimular la expresión de determinados genes dianas importantes en su función como supresor tumoral. Estudios recientes, han confirmado la existencia de, al menos, tres mecanismos independientes que activen a la proteína p53.  La primera vía se produce por daño en el DNA, como el causado por radiación ionizante. Este daño es captado por las proteínas reguladoras (de “checkpoint”) que retrasan el progreso del ciclo celular, hasta que el daño no es reparado. Estas enzimas protein-quinasas están representadas por la ATM (por encontrarse mutada en la ataxia telangiectasia), la cual es estimulada por roturas en la doble cadena, ChK1, ChK2 y la proteín-quinasa DNA-dependiente y ejercen su función fosforilando la p53 a los sitios amino-terminal que están cerca de los sitios de unión de las proteínas MDM-2, permitiendo la estabilización de la p53.  La segunda vía se lleva a cabo por señales de crecimiento aberrantes, como las producidas por la expresión de oncogenes como Ras o Myc, en ausencia de daño de DNA. Estos oncogenes estimulan la transcripción del gen p14ARF, o la estabilización de la proteína p14ARF, que, a su vez, se une a la MDM-2 inhibiendo su función.  La última ruta es inducida por múltiples fármacos quimioterápicos, luz ultravioleta e inhibidores de la protein-quinasa, y se caracteriza por estar involucrada la proteína ATR (Proteína relacionada con ataxia-telangiectasia) y caseín-quinasa II. Las tres vías actúan inhibiendo la degradación de la proteína p53, es decir estabilizándola a altas concentraciones, aumentando su actividad transcripcional dramáticamente. Esto hace que la p53 ejerza su función en los sitios de unión en el DNA dañado, como un tetrámero, que estimula la expresión de los genes adyacentes, con el fin de reparar el daño genómico
  • 22. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Mediante estímulos enzimáticos se modifica los niveles de MDM 2 activo y, en consecuencia, aumentan los niveles de la proteína p53 activada. Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página22 MECANISMO DE ACCIÓN Se han identificado múltiples genes que son controlados directamente por la p53, y han sido clasificados en cuatro categorías. Muchos de estos genes están involucrados en la prevención del desarrollo de tumores, como los inhibidores de la progresión del ciclo celular, o del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, así como los que favorecen la apoptosis.
  • 23. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página23 a) Genes involucrados en la inhibición del ciclo celular: La proteína p53 se une a secuencias específicas del DNA inhibiendo la transcripción de genes reguladores del ciclo celular. Estos ejercen un control negativo paralizando el ciclo celular en G1 y bloqueando la entrada en fase S, que es donde se sintetiza el DNA. Uno de estos genes el p21 (WAF 1/ CIP1), codifica un potente inhibidor de quinasas dependientes de ciclina (CDKs), que junto con otras proteínas ciclinas responsable de la inactivación de la proteína Rb durante las fases G1 y G2 del ciclo celular. Otra proteína involucrada en el control del ciclo es GADD45 (growth arrest DNA damage) la cual también se une al PCNA. Por otro lado, en células epiteliales p53 estimula la expresión de la proteína 14- 3-3, la cual secuestra la ciclina B1- complejo CDK1 fuera del núcleo y por lo tanto, mantiene el bloqueo en la fase G2. Se ha visto que la inhibición de esta proteína hace que las células humanas epiteliales crezcan indefinidamente en cultivo; esta inmortalidad puede ser la llave para diferenciar células tumorales de las normales. Con esta interrupción del ciclo, se permite a los mecanismos reparadores celulares actuar antes de la replicación de ADN. b) Apoptosis: La proteína p53 no es necesaria para todas las formas de apoptosis, pero ejerce un efecto crucial en la inducción de la apoptosis que se produce en respuesta al daño de ADN. Si el daño es extenso e irreparable, entonces, la p53 activa los mecanismos de apoptosis, como mecanismo de defensa, para proteger la propagación y proliferación de células que han sufrido la mutación. La transcripción del gen bax es activada directamente por sitios de unión de la p53 en la región de regulación. Recientemente, se ha descubierto que los genes NOXA y P53AIP1 también son activados directamente por la p53, y que al igual que bax , expresan sus proteínas a nivel mitocondrial teniendo una acción inductora de la apoptosis. Otros mediadores de la apoptosis inducida por p53 incluyen proteínas similares a los receptores de apoptosis, TNF y Fas como recientemente, se ha descubierto la PIDD. La p53 puede, también, actuar directamente sobre la mitocondria produciendo un exceso de tóxicos con potencial redox, sin inducir la translocación de bax. c) Estabilidad genómica: La inactivación de los genes de reparación produce inestabilidad genómica. La proteína p53 desempeña un papel clave para compensar dicho efecto regulando la expresión de genes implicados en los mecanismos de reparación y recombinación. P53 controla también la inducción de genes como el de la ribonucleótido reductasa (RNR), implicada en las respuestas celulares a daño en el DNA. RNR cataliza la síntesis de desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTPs) requeridos para el metabolismo del DNA. El enzima es citosólica, produciendo dNTPs que penetran en el núcleo
  • 24. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página24 para la síntesis de DNA. Recientemente se ha identificado el gen p53R2, mutado en una serie de tumores de colón, que regula una subunidad de la RNR. Tanaka y Cols. han demostrado que las células que no producen p53R2 son más sensibles a la muerte por agentes que dañan el DNA. d) Inhibición de la angiogénesis: La p53 normal estimula la expresión de genes que previenen la formación de nuevos vasos, que es un paso crítico y precoz en el desarrollo de los tumores primarios. Se ha visto que la pérdida de función de p53 resulta en una disminución de la expresión de trombospondina (la cual es una poderosa inhibidora de angiogénesis) MUTACIÓN El gen p53 parece tener una función pivote en la carcinogénesis humana, ya que se encuentra mutado en más del 50 % de los tumores. La inactivación de p53 puede ocurrir a través de varios mecanismos, incluido la pérdida de alelos, delecciones, inserciones o mutaciones puntuales, la mayoría de las cuales, responden a una sustitución de una base en la secuencia codificante de p53 que, cambia un aminoácido en el dominio central produciendo un cambio conformacional y de estabilización de la proteína translocada. Aunque la presencia de un alelo aberrante puede ser suficiente para comprometer la función de supresor tumoral, la pérdida de dicha función ocurre normalmente por la pérdida completa de uno de los alelos del gen, resultado de una delección cromosómica, en combinación con una mutación puntual sin sentido del otro alelo. El polimorfismo más frecuentemente encontrado en las neoplasias humanas se localiza en el codón 72 y resulta de una sustitución entre la prolina y la arginina. Sin embargo, los tumores pueden tener diferentes patrones de cambios de bases en el DNA dependiendo si los cambios genómicos ocurren espontáneamente, o bien por carcinógenos exógenos. Por ejemplo, en los tumores de piel, los rayos ultravioletas producen la sustitución de bases CC por TT. En tumores sólidos, los cambios de DNA son espontáneos en su mayoría, observándose mutaciones de C a T en los nucleótidos 5-meCpG, asociando hidrólisis de grupos amino en 5-metil citosina produciendo timidina. Esto produce un cambio en el código genético por sustitución de citosina: guanina a Timina: Adenina. El resultado de esa mutación es la síntesis de una proteína con cambios en su conformación, una vida media más prolongada y una función alterada en el crecimiento celular.
  • 25. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página25 Asimismo, la inactivación del gen puede producirse porque la proteína transcrita es silenciada por formaciones complejas, bien por interacción con productos víricos, como el antígeno T SV40, la proteína adenovirus E1b o la proteína E6 del HPV de alto riesgo, o por interacción con otras proteínas celulares como MDM2 (murine double minute 2). De cualquier modo la inactivación de p53 conduce a una reducción en los niveles de p21/WAF 1, a la fosforilación del producto genético del retinoblastoma (rb) y a la progresión de G1 a la fase S del ciclo celular. MIEMBROS DE LA SUBFAMILIA BH3 Esta subfamilia está compuesta solo por miembros proapoptóticos que, excepto por el dominio BH3, no muestran homología con Bcl-2. Para ejercer su actividad, estas proteínas pueden formar heterodímeros con miembros antiapoptóticos de la familia. Para ello, el dominio BH3 de los miembros de este grupo puede introducirse en el hueco hidrofóbico formado por la asociación de las regiones BH1, BH2 y BH3 de los miembros antiapoptóticos. Un ejemplo de la acción de esta familia de proteína es la ejercen dos de sus miembros Bid y Bik sobre la mitocondria, donde inducen la liberación de citocromo c y posterior apoptosis. PROTEINAS DE LA FAMILIA DE LAS CASPASAS Dentro de la maquinaria que lleva a cabo el programa de apoptosis, los miembros ejecutores son una serie de proteasas englobadas bajo el nombre de caspasas. Este sistema ejecutor se ha mantenido a lo largo de la evolución y, tras su descripción en c. elegans, se encontró el equivalente en mamíferos gracias a la homología que presentaban ambas moléculas. Esta primera proteasa encontrada en mamífero se denominó ICE (interleukin-1b-converting enzime) o caspasa-1 (cisteína-aspartasa- 1) y es precisamente uno de los pocos miembros de la familia al que no se le ha podido hallar relación directa con el proceso de apoptosis, sino más bien con el de la inflamación. La familia de las caspasas en humanos está formada hasta el momento por 11 miembros descritos, y todos ellos tienen en común que se encuentran en forma de zimógeno o proenzima con una estructura bien definida: a) El dominio N-terminal es muy variable tanto en su secuencia como en su longitud y tiene funciones de regulación y activación
  • 26. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página26 b) La región catalítica está formada por dos dominios, uno grande ("20 KDa) y otro pequeño ("10 KDa), que darán lugar a las dos subunidades del enzima una vez activada. Las caspasas se dividen en dos grupos según la longitud de su región reguladora N-terminal o prodominio.  Las caspasas con prodominio largo como son la -1,-2, -4, -5, -8, y -10 parecen estar involucradas en funciones de regulación de la activación de la cascada. Ejemplos bien conocidos de este grupo son las procaspasas -8 y -10 que contienen en sus largos prodominios repeticiones de una secuencia de interacción proteína-proteína llamada dominio efector de muerte o DED (death effector domain) y las procaspasas -1, -2, -4, -5 y -9, que contienen dominios de reclutamiento de caspasas o CARDs (caspase recruitment domains). La presencia en su estructura de estas secuencias unido a su localización cercana a la membrana plasmática hacen posible su reclutamiento hacia el complejo formado en torno a receptores de superficie señalizadores de apoptosis como CD95 y TNF, activándose allí y dando lugar al comienzo de la cascada de proteólisis. Por esta situación dentro del proceso se las conoce como caspasas iniciadoras.  El otro grupo está compuesto por las caspasas con prodominio corto como son las caspasas -3, -6 y -7. Estas parecen estar situadas "downstream" en la cadena y se ha demostrado in vitro que son activadas por alguna de las caspasas iniciadoras. Los estudios realizados sugieren que estas caspasas llamadas efectoras son las que actúan al final de la cascada sobre los componentes celulares, proteolizándolos. Debido a la gran importancia que tienen las caspasas en la apoptosis, es razonable comprender como las caspasas son activadas. Las caspasas son sintetizadas como zimógenos enzimáticamente inertes que deben ser cortados proteolíticamente para ser activos. En todos los casos estudiados, la enzima madura es un heterotetrámero que contiene dos p20/p10 heterodímeros y dos centros activos. Existen tres mecanismos generales de activación de caspasas: A) Activación por otra caspasa: Como su nombre indica, las caspasas son proteasas que cortan después de un residuo de ácido aspártico. Un punto de corte de Asp separa el prodominio de p20 y uno o dos separan p20 de p10. Esto sugiere la posibilidad de activación autocatalítica. Efectivamente, un modo simple de activar una procaspasa es exponerla a otra previamente activada. Esta estrategia de activación denominada
  • 27. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página27 cascada de caspasas es muy utilizada por las células para la activación de las tres caspasas que tienen un prodominio corto: caspasa-3, -6 y -7. Estas tres caspasas se denominan caspasas efectoras y son más abundantes y activas que sus primas con un prodominio más largo. La cascada de caspasas es un método útil para amplificar e integrar las señales proapoptóticass, pero no pueden explicar cómo se activó la primera caspasa. Existen al menos dos aproximaciones que explican dicha activación. B) Activación inducida por proximidad: La caspasa-8 es la caspasa iniciadora clave en la vía de los receptores de muerte. Después de la unión del ligando, los receptores de muerte como CD95 (Apo-1/Fas) se agregan y forman un complejo de señalización de membrana. Estos complejos reclutan, a través de sus proteínas adaptadoras, varias moléculas de procaspasa-8 con lo que se aumenta la concentración local de zimógeno. En estas condiciones, la baja e intrínseca actividad proteasa de la procaspasa-8 es suficiente para permitir que varias moléculas de proenzima se corten mutuamente y se activen unas a otras.
  • 28. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página28 C) Asociación con una subunidad reguladora: El mecanismo de activación más complejo es el utilizado por la caspasa-9. Al contrario que en otras caspasas, el procesamiento proteolítico de la procaspasa-9 tiene un efecto mínimo en su activación. El requerimiento clave para la activación de la caspasa-9 es su asociación con un cofactor de proteínas, Apaf-1. También es necesario el citocromo c liberado por la mitocondria. El citocromo c y Apaf-1 se asocian en un proceso ATP dependiente. La oligomerización de Apaf-1 recluta procaspasas-9 formando el apoptosoma . La activación de la caspasa-9 es debida a un cambio conformacional, no a proteolisis. En resumen, las caspasas efectoras se activan proteolíticamente por otras caspasas mientras que las caspasas iniciadoras son activadas por interacciones reguladas proteína-proteína. Cada caspasa con prodominio largo contiene en su prodominio un módulo de interacción proteína-proteína que permite la unión y asociación con sus reguladores. Las caspasas -8 y -10 contienen un dominio efector de muerte (death-effector domain, DED ) mientras que las caspasas -2 y -9 contienen un dominio de reclutamiento y activación de caspasas (caspase activation and recruitment domain, CARD ). Estos dos dominios comparten tienen secuencias distintas, pero se pliegan en una disposición espacial similar que consiste en seis hélices a antiparalelas (Hofmann K, 1999). El mismo plegamiento lo encontramos en el dominio de muerte (death domain, DD ), una tercera proteína de interacción presente en varios reguladores iniciales de la apoptosis como CD95 y la molécula adaptadora FADD. Parece que DD, DED y CARD derivan de un dominio ancestral común.
  • 29. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página29 SUSTRATOS DE CASPASAS La activación de las caspasas no resulta en la degradación indiscriminada de proteínas celulares. Por el contrario, las caspasas cortan selectivamente un conjunto restricto de proteínas, normalmente en una o varias posiciones de la secuencia primaria (siempre después de un residuo de Asp). En la mayoría de los casos, el corte mediado por las caspasas resulta en la inactivación de la proteína, pero las caspasas pueden también activar proteínas, bien directamente mediante el corte de un dominio de regulación negativa o bien indirectamente mediante degradación de una subunidad inhibidora. La caspasa más prevalente en la célula es la caspasa-3 que es la última responsable de la mayoría de los efectos apoptóticos junto con la caspasa-6 y -7. Por ejemplo, la fragmentación del DNA de peso molecular alto y bajo es debida a la acción de la caspasa-3 sobre un complejo DNasa activado por caspasa (CAD), una nucleasa, y iCAD, su inhibidor (Enari M, 1998; Liu X, 1997). En células no apoptóticas, CAD aparece formando un complejo inactivo con iCAD. Durante la apoptosis, la caspasa-3 degrada el inhibidor, permitiendo a la nucleasa degradar la cromatina. La formación de pequeñas vesículas en la membrana plasmática y su plegamiento es debido al corte y activación de la gelsolina (Kothakota, 1997), de la kinasa-2 activada por p21 (Lee N, 1997) y sobre todo a través de la degradación de la fodrina (Martin SJ, 1995) que disocia la membrana plasmática del citoesqueleto. La externalización de la fosfatidilserina (phosphatidylserine, PS) en los estadios iniciales de la apoptosis es dependiente de caspasas aunque el mecanismo preciso no ha sido todavía elucidado (Martin SJ, 1996). Además de los sustratos descritos existen cerca de otros 100 y posiblemente haya más (Earnshaw WC, 1999; Nicholson DW, 1999). ¿Por qué hay tantos sustratos?. Quizá la apoptosis es mucho más compleja de los que nosotros actualmente creemos. También es posible que alguno de estos sustratos descritos no sea relevante, sino simplemente un espectador inocente cogido en el acto. INHIBIDORES DE CASPASAS Las células también contienen inhibidores naturales de las caspasas. Estas proteínas inhibidoras de la apoptosis (inhibitors of apoptosis proteins, IAPs ) fueron primero identificadas en baculovirus y después se encontraron en células humanas. Existen al menos cinco diferentes en mamíferos: XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis), c-IAP1, c-IAP2, IAP neuronal y survivina. Todos ellos poseen una actividad antiapoptótica in vitro (Roy N, 1997; Deveraux QL, 1997, 1998; Ambrosini G, 1997). El espectro de estímulos apoptóticos que son bloqueados por las IAPs de mamíferos es
  • 30. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página30 amplio e incluye ligandos y transductores de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (tumor necrosis factor, TNF), miembros proapoptóticos de la familia de Bcl-2, el Citocromo c y agentes quimioterapeuticos (Deveraux QL, 1999). XIAP tiene una amplia y enorme capacidad antiapoptótica. XIAP, c-IAP1 y c-IAP2 son inhibidores directos de caspasas. Todos ellos se unen e inhiben a las caspasas -3 y -7 activas y también a la procaspasa-9, pero no a las caspasas-1, -6, -8 ni -10. La unión y la inhibición de las caspasas por las IAPs es mediada por los dominios repetidos IAP de baculovirus (baculovirus IAP repeat, BIR) presentes dentro de las IAPs. BIR es un motivo conservado de unos 70 aminoácidos que está repetido en tándem y que está presente en las IAPs de todos los mamíferos. Otra región dentro de las IAPs es el dominio RING, que actúa como una ligasa de ubiquitina promoviendo la degradación de la propia IAP (Yang Y, 2000) y, presumiblemente, cualquier caspasa unida ella. Cerca del dominio RING, tanto en c-IAP1 como en c-IAP2, existe un dominio CARD que sugiere que estas IAPs podrían regular directa o indirectamente el procesamiento de las caspasas a través de interacciones por el dominio CARD. De esta manera, las IAPs frenan la apoptosis uniéndose, inhibiendo y quizá degradando caspasas. VIAS DE INDUCCIÓN DE APOPTOSIS VÍA INTRÍNSECA O MITOCONDRIAL La mitocondria no es sólo la productora de energía de la célula, es también un arsenal. La mitocondria secuestra un potente cóctel de proteínas proapoptóticas. La más prominente entre ellas es el citocromo c, el humilde transportador de electrones. Varios trabajos han revelado que el citocromo c es todo lo contrario a inocuo y que además de su implicación en la fosforilación oxidativa mitocondrial, es uno de los componentes requeridos para la activación de la caspasa-9 en el citosol. No se conoce exactamente cómo el citocromo c atraviesa la membrana externa, pero está claro que la familia de Bcl-2 está íntimamente implicada en la regulación de este proceso. El nombre de la familia se debe al primer miembro, que fue aislado como un gen implicado en el linfoma de células B (de ahí el nombre bcl, B-cell lymphoma) que es homólogo del represor de la apoptosis ced-9 de C. elegans . Esta familia consta de 19 miembros que se ha clasificado en tres grupos basándose en similitudes estructurales y funcionales. Cada miembro posee al menos uno de los cuatro motivos conservados denominados dominios de homología con Bcl-2 (Bcl-2 homology domains, BH ): BH1-BH4. Los miembros del grupo I, como Bcl-2 y Bcl-X L , poseen actividad antiapoptótica y se caracterizan por tener los cuatro dominios BH (BH1-BH4).
  • 31. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página31 Además poseen una cola hidrofóbica en el C-terminal que localiza la proteína en la membrana externa de la mitocondria. El grupo II consta de miembros de la familia de Bcl-2 con actividad proapoptótica, como por ejemplo Bax y Bak. Tienen estructura similar a las del grupo I pero carecen del dominio BH4. Estudios de estructura y función sugieren que la actividad anti y proapoptótica está determinada por una región relativamente larga que incluye dos hélices a que participan en la inserción a la membrana. Los miembros del grupo III también tienen actividad proapoptótica. Todos ellos se caracterizan por la presencia de un único dominio BH3, además pueden o no tener región transmembrana. Los miembros más caracterís ticos son Bid, Bad, Bim, Bik. La función clave de los miembros de la familia de Bcl-2 es regular la liberación de factores proapoptóticos, en particular el citocromo c, desde el compartimento intermembranal de la mitocondria hasta el citosol. ¿Cómo controlan los miembros de la familia de Bcl-2 la muerte celular? Parece ser que se pasan la mayoría del tiempo simplemente intentando bloquear el siguiente movimiento del otro. Algunos miembros de la familia pueden homodimerizar pero, lo que es más importante, pueden formarse heterodímeros de miembros pro y antiapoptóticos . En una primera aproximación, la heterodimerización puede simplemente resultar en una neutralización mutua de las proteínas pro y antiapoptóticas unidas. Por tanto, el problema consiste sólo en comparar los niveles totales de miembros pro y antiapoptóticos de la familia: células con más proteínas pro muerte son más sensibles a la apoptosis; células con exceso de miembros de la familia protectora serán normalmente resistentes.
  • 32. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página32 Recientemente se ha identificado un inhibidor de las IAPs de mamíferos, denominado Smac (second mitochondria-derived activator of caspases) o DIABLO ( direct IAP-binding protein with low pI ). Smac/DIABLO se une a los miembros de la familia de las IAPs y neutraliza su actividad antiapoptótica. Curiosamente, Smac/DIABLO es una proteína mitocondrial normal pero su liberación al citosol celular induce apoptosis, presumiblemente siguiendo la misma ruta de salida que el citocromo c. Por tanto, si una célula está comprometida a sufrir apoptosis y libera el contenido mitocondrial al citosol, entonces Smac/DIABLO secuestra las proteínas IAPs y se asegura que estas proteínas no intenten parar el programa en curso. La vía mitocondrial se ejecuta en respuesta a intromisiones externas y a daño en el DNA. Las distintas vías de respuesta convergen en la mitocondria, a menudo a través de la activación de miembros proapoptóticos de la familia de Bcl -2. Excepto Bcl-2, que está la mayoría del tiempo anclado a membranas intracelulares, algunos miembros de los grupos II y III, incluyendo Bax, Bad, Bim y Bid, pueden localizarse tanto en el citosol como en orgánulos. La forma citosólica de estas proteínas es un reservorio inactivo pero preparado para la batalla. Las señales proapoptóticas redirigen estas proteínas a la mitocondria donde tendrá lugar la lucha por el destino de la célula. La activación de miembros proapoptóticos puede producirse a través de proteolisis, defosforilación y probablemente otros mecanismos. Los miembros pro y antiapoptóticos de la familia de Bcl -2 se encuentran en la superficie de la mitocondria donde regulan la salida del citocromo c por un mecanismo todavía debatido. Si los miembros proapoptóticos ganan, una gran cantidad de moléculas son liberadas desde la mitocondria. La principal de estas moléculas liberadas es el citocromo c, que se asocia con Apaf-1 y después con la procaspasa-9 (y posiblemente otras proteínas) para formar el apoptosoma. Las proteínas de choque térmico (heat-shock proteins, HSP) actúan en múltiples pasos regulando la apoptosis. El apoptosoma hidroliza la procaspasa-3 a caspasa-3 que se encarga de ejecutar la apoptosis generando distintos subprogramas cuya suma resultará en el desmantelamiento ordenado y en la muerte de la célula.
  • 33. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página33 VIA EXTRINSECA O DE LOS RECEPTORES DE MUERTE Los receptores de muerte de la familia del receptor de TNF (TNFR) incluyen TNFR1, Fas (CD95), DR3/WSL y los receptores del ligando inductor de apoptosis relacionado con el TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)/Apo-2L (TRAIL-R1/ DR4, TRAIL-R2/DR5). Los miembros de esta familia están caracterizados por presentar de dos a cinco copias de un dominio extracelular rico en cisteína. Los receptores de muerte también poseen un dominio intracelular en el C-terminal del receptor denominado dominio de muerte (death domain, DD ). Cuando un ligando se une a estos receptores se puede producir la muerte por apoptosis de la célula que los posee. El miembro de los receptores de muerte más estudiado y relevante en Inmunología es el CD95 o Fas. La oligomerización, más probablemente la trimerización, del CD95 tras la unión de su ligando, FasL, es requerida para la transducción de la señal apoptótica. Un complejo de proteínas se asocia con el CD95 activado. Este complejo de señalización inductor de muerte (death-inducing signalling complex, DISC ) se forma en el segundo de los receptores trimerizados. Primero, el adaptador FADD (Fas-associated death domain) o Mort1 se une a través de su dominio de muerte al dominio de muerte del CD95. FADD también presenta el denominado dominio efector de muerte (death-effector domain, DED ), y, de nuevo por interacciones homólogas,
  • 34. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página34 recluta en el DISC la procaspasa-8 (o FLICE) que contiene un DED. Después, la procaspasa-8 es activada proteolíticamente y la caspasa-8 activa es liberada del DISC al citoplasma formando un heterotetrámero de dos subunidades pequeñas y dos grandes (Muzio M, 1996). La caspasa-8 activa rompe varias proteínas de la célula incluyendo la procaspasa-3, que resulta en su activación y en la finalización de la muerte celular. La inhibición de esta ruta es realizada por proteínas que contienen dos DED y que se unen al complejo CD95-FADD. Esto inhibe el reclutamiento y la activación de la caspasa-8, antiguamente conocida como FLICE, de ahí el nombre de proteínas inhibidoras de FLICE (FLICE-inhibitory proteins, FLIP ) (Thome M, 1997; Hu S, 1997; Bertin J, 1997; Yeh WC,2000). La vía de los receptores de muerte y la vía mitocondrial convergen a nivel de la activación de la caspasa-3. El solapamiento y la integración de las dos vías se debe a Bid, un miembro proapoptótico de la familia de Bcl-2. La caspasa-8 media la ruptura de Bid incrementando enormemente su actividad proapoptótica que resulta en su translocación a la mitocondria donde promueve la liberación del citocromo c. Hay que tener en cuenta que en la mayoría de las condiciones, este solapamiento es mínimo, y las dos vías operan de manera independiente (Gross A, 1999; Yin XM, 1999).
  • 35. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página35 Mediante esta ruta de inducción de apoptosis se activa la caspasa-8 que activa otras caspasas que darán, en última instancia, el fenotipo apoptótico que nosotros detectamos mediante diferentes metodologías. INTERRELACION ENTRE LAS VIAS La vía de los receptores de muerte y la vía mitocondrial convergen a nivel de la activación de la caspasa-3. El solapamiento y la integración de las dos vías se debe a Bid, un miembro proapoptótico de la familia de Bcl-2. La caspasa-8 media la ruptura de Bid incrementando enormemente su actividad proapoptótica que resulta en su translocación a la mitocondria donde promueve la liberación del citocromo c. Hay que tener en cuenta que en la mayoría de las condiciones, este solapamiento es mínimo, y las dos vías operan de manera independiente (Gross A, 1999; Yin XM, 1999).
  • 36. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página36
  • 37. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página37 FUNCIONES DE LA APOPTOSIS ELIMINACIÓN DE TEJIDOS DAÑADOS O INFECTADOS La apoptosis puede ocurrir, por ejemplo, cuando una célula se halla dañada y no tiene posibilidades de ser reparada, o cuando ha sido infectada por un virus. La "decisión" de iniciar la apoptosis puede provenir de la célula misma, del tejido circundante o de una reacción proveniente del sistema inmune. Cuando la capacidad de una célula para realizar la apoptosis se encuentra dañada (por ejemplo, debido a una mutación), o si el inicio de la apoptosis ha sido bloqueado (por un virus), la célula dañada puede continuar dividiéndose sin mayor restricción, resultando en un tumor que puede ser de carácter canceroso. Por ejemplo, como parte del "secuestro" del sistema genético de la célula llevado a cabo por los virus del papiloma humano (VPH), un gen denominado E6 se expresa originando un producto que degrada la proteína p53, vital para la ruta apoptótica. También condiciones de stress como la falta de alimentos, así como el daño del ADN provocado por tóxicos o radiación, pueden inducir a la célula a comenzar un proceso apoptótico. Una ejemplo sería la apoptosis mediada por la enzima nuclear, poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1), crucial en el mantenimiento de la integridad genómica. Un activación masiva de dicha enzima puede vaciar la célula de nucleótidos ricos en energía, provocando una cadena de transducción de señales del núcleo a la mitocondria que iniciaría la apoptosis. célula maligna (cáncer de mama)
  • 38. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página38 DESARROLLO EMBRIONARIO Durante el desarrollo embrionario la apoptosis regula el crecimiento celular y tisular, desde la desaparición de las membranas interdigitales para el desarrollo normal de los dedos hasta la apoptosis en el ojo para la correcta formación del cristalino y los párpados pasando por multitud de procesos en estudio. En los animales que pasan por distintos estadíos la apoptosis que regula el desarrollo controla además el paso de un estadio de crecimiento al siguiente (larva, ninfa, juvenil, adulto, etc.). En el caso de las ranas la apoptosis controla, durante la metamorfosis, la desaparición de la aleta caudal de los renacuajos. ESCULTURA DE DISTINTAS ESTRUCTURAS El ejemplo más claro de esto es la eliminación de las membranas interdigitales para la formación de los dedos en vertebrados superiores. Otro proceso de formación de estructuras en que está involucrada la apoptosis es en el vaciado de cuerpos sólidos para crear una luz. Por ejemplo, la formación de la cavidad preamniotica en el embrión de ratón por la muerte de células ectodermales de su interior (526, Coucovanis 1995). ELIMINACIÓN DE ESTRUCTURAS En el proceso de desarrollo a veces se forman estructuras que después es necesario suprimir. La razón es que pueden ser restos vestigiales de alguna estructura necesaria para una especie ancestral pero a la que la evolución ha hecho perder la utilidad. También pueden ser formaciones requeridas para determinados estadios del desarrollo y que después ya no son de utilidad. Por último, también pueden ser estructuras necesarias para un sexo pero no para el otro. Ejemplos de este objetivo de la apoptosis durante el desarrollo son los tubos pronefríticos, necesarios en peces y larvas anfibias pero que han dejado de serlo en mamíferos y por eso son eliminados. También los ductos de Müllerian, que forman el útero y los oviductos en hembras de mamíferos pero que en machos son eliminados por apoptosis. HOMEOSTASIS En un organismo adulto, la cantidad de células que componen un órgano o tejido debe permanecer constante, dentro de ciertos límites. Las células de la sangre y de piel, por ejemplo, son constantemente renovadas por sus respectivas células progenitoras. Por lo tanto, esta proliferación de nuevas células tiene que ser
  • 39. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página39 compensada por la muerte de otras células. A este proceso se le conoce como homeostasis, aunque algunos autores e investigadores han sugerido homeocinesis como un término más preciso y elocuente. La homeostasis se logra cuando la relación entre la mitosis y la muerte celular se encuentra en equilibrio. Si este equilibrio se rompe, pueden ocurrir dos cosas:  Las células se dividen más rápido de lo que mueren, desarrollando un tumor.  Las células se dividen más lentamente de lo que mueren, produciéndose un grave trastorno de pérdida celular. Ambos estados pueden ser fatales o potencialmente dañinos. REGULACIÓN DEL SISTEMA INMUNITARIO SELECCIÓN NEGATIVA EN TIMO Este proceso que se lleva a cabo en el timo como etapa final de la maduración de los linfocitos T, tiene como objeto la eliminación, por apoptosis, de los clones de timocitos que hayan generado un receptor del linfocito T hacia el antígeno (TCR, de T cell receptor) con especificidad hacia un Ag propio. De esta forma se hace posible la autotolerancia en los organismos, es decir, la incapacidad de responder a un Ag propio y por lo tanto, de desencadenar procesos autoinmunes. En el timo tiene lugar la adquisición de tolerancia central hacia todos los Ag que puedan ser presentados por sus células, fundamentalmente proteínas ubicuas de membrana y suero. Se diferencia de la tolerancia periférica adquirida en otras etapas de la ontogenia hacia Ag propio que solo pueden ser presentados en los tejidos periféricos. La selección de los clones T autorreactivos se lleva a cabo en la etapa de doble positividad de los timocitos (CD4+, CD8+). Estos se unen con alta afinidad al MHC que contiene péptidos propios y que es presentado por células presentadoras de Ag (APC) del timo. Esta unión de alta afinidad dispara en el timocito el programa de muerte por apoptosis. Se conoce poco acerca de los mecanismos moleculares que dirigen este proceso, pero parece ser muy importante en él, la presencia de las dos moléculas CD4 y CD8. Este proceso de selección negativa, junto al de eliminación de timocitos con reagrupamientos incorrectos en su TCR, parece ser responsable de la muerte del 95% de linfocitos T durante los procesos de maduración en timo
  • 40. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página40 PATOLOGIAS VINCULADAS CON LA APOPTOSIS La apoptosis es una función biológica de gran relevancia en la patogenia de varias enfermedades estudiadas hasta el momento. Podemos destacar el cáncer, malformaciones, trastornos metabólicos, neuropatías, lesiones miocárdicas y trastornos del sistema inmunitario. ENFERMEDADES ASOCIADAS A INHIBICIÓN DE APOPTOSIS 1. Cáncer: linfoma no Hodgkin folicular (Bcl-2 +), carcinoma (p53 +), tumores hormono-dependientes 2. Enfermedades autoinmunitarias: lupus eritematoso sistémico, glomerulonefritis autoinmunitaria 3. Infecciones virales: Herpes virus, Poxvirus, Adenovirus ENFERMEDADES ASOCIADAS A AUMENTO DE APOPTOSIS 1. Sida 2. Enfermedades neurodegenerativas: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelosa 3. Síndromes mielodisplásicos (MDS): anemia aplástica 4. Daño isquémico: infarto de miocardio, apoplejía, daño por reperfusión, daño hepático por alcoholismo.
  • 41. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página41 LA APOPTOSIS EN EL SISTEMA CARDIOVASCULAR En el sistema cardiovascular la apoptosis puede ser parte del proceso de renovación, pero por defecto de mitosis o exceso de muerte celular, puede cons tituir un proceso patológico. En el ventrículo derecho ocurre una remodelación fisiológica después del nacimiento cuando ya éste ventrículo no tiene que cumplir con la función hemodinámica intrauterina. Una cantidad importante de células de ese ventrículo mueren de manera programada después del nacimiento. Esto suele durar apenas unos días, pero en ciertas condiciones se prolonga indefinidamente y ocurre la denominada miocardiopatía de Uhl, caracterizada por una dilatación extrema del ventrículo derecho con la consecutiva insuficiencia ventricular derecha. Otra enfermedad relacionada con la enfermedad de Uhl, en la que también se ha demostrado apoptosis, es la displasia arritmogénica del ventrículo derecho, en la que la infiltración fibrótica que sustituye al miocito apoptótico, crea el sustrato para arritmias potencialmente letales. Otra entidad en donde se ha demostrado muerte celular programada es la miocardiopatía dilatada, principalmente en su forma idiopática. En ella se ha demostrado que aproximadamente el 0,2 por ciento de las células tenían características apoptóticas. Esta cantidad aparenta ser poco influyente en la función del corazón, pero si se toma en cuenta que la muerte celular ocurre en cuestión de horas y si se trata de un proceso ininterrumpido sin replicación celular compensadora, alrededor del 50 por ciento de la masa ventricular se perdería en un año. La apoptosis parece también jugar un papel importante en la formación anatómica de los nodos sinusal y auriculoventricular. En efecto, una buena cantidad de pequeñas células P redondas u ovoides presentes en el nodo sinusal en el nacimiento va desapareciendo poco a poco por un proceso exclusivamente apoptótico, sin que medie el menor signo inflamatorio. Algo semejante ocurre en el nodo auriculoventricular. Las conexiones auriculoventriculares son eliminadas en la remodelación posnatal. La persistencia de algunas de estas conexiones podría ser el origen de algunos fascículos accesorios como aquellos que se encuentran en el síndrome de Wolf Parkinson White y en el bloqueo auriculoventricular acompañado de arritmias ventriculares. James ha demostrado muerte celular exagerada sin inflamación previa en el nodo sinusal de pacientes con síndrome de QT largo que tienen síncope y arritmias potencialmente letales.
  • 42. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página42 En la remodelación que ocurre en el tejido aparentemente sano después de un infarto del miocardio hay una reexpresión del programa fetal genético, con disfunción progresiva. Esta situación puede ser causada por la muerte programada de tejido viable y de hecho, se ha demostrado que en el tejido sano contiguo a la necrosis posinfarto hay células apoptóticas. Se han dado evidencias en tejido aislado, así como en modelos experimentales, que puede ocurrir apoptosis en respuesta a la isquemia-reperfusión, al infarto del miocardio, a la estimulación eléctrica rápida del miocardio, al estiramiento mecánico y a la sobrecarga debida a la constricción aórtica. También se ha visto que constantemente ocurre apoptosis miocárdica en órganos diana de ratas hipertensas. Un buen número de factores presentes en el corazón insuficiente, por ejemplo: las citoquinas inflamatorias, las especies de oxígeno reactivo, el óxido nítrico, la hipoxia, la reperfusión, los factores de crecimiento, y el estiramiento del tejido, estimulan la apoptosis en una variedad de células, entre ellas, las del miocardio. Una situación interesante y novedosa en donde se ha invocado la apoptosis es el llamado precondicionamiento isquémico que es aquella condición en la que un síndrome isquémico agudo protege de episodios de isquemia subsiguientes. Se ha demostrado en el corazón de rata in vivo sometido a episodios de isquemia transitoria, que las células apoptóticas disminuyen en relación con aquellos animales donde no se ha provocado precondicionamiento. El endotelio vascular, donde se originan una serie de hormonas paracrinas moduladoras de la vasoconstricción o vasodilatación producida por el músculo liso, está renovándose constantemente por apoptosis y replicación. En ocasiones, como en la hipertensión arterial, hay exceso de apoptosis endotelial que a su vez favorece la migración y el crecimiento del músculo liso arterial, lo que a su vez remodela el vaso y favorece la formación de ateromas. En la hipertensión pulmonar se ha visto que una enzima denominada Tenascina-C causa crecimiento de la capa muscular media y remodelación del vaso. Este proceso se acompaña de muerte celular programada. Todos estos hallazgos motivan cuestionamientos tales como: ¿Los procedimientos de detección son suficientemente sensibles y específicos? ¿la apoptosis es un fenómeno primario o secundario? ¿Cuál es el estímulo que inicia el proceso apoptótico en el corazón? ¿Acaso desde el nacimiento las células llevan un código genético que al ser estimulado por un factor interno o externo inicia un proces o de auto aniquilamiento o suicidio? En este final del siglo y en el umbral de próximo estas preguntas probablemente sean contestadas y surjan nuevos cuestionamientos. También es probable que la apoptosis pueda impedirse o al menos controlarse mediante terapia génica.
  • 43. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página43 BIBLIOGRAFÍA 1. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenom with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26:239-57. 2. Walker NI, Harmon BV, Gob GC, Kerr JFR. Patterns of cell death. Arch Exp Pathol 1988;13:18-54. 3. Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 1995;267:1445-9. 4. Williams GT, Smith CA. Molecular regulation of apoptosis: genetic controls on cell death. Cell 1993;74:777-9. 5. Vaux DL, Strasser A. The molecular biology of apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:2239-44. 6. James TN, St Martin E, Willis PW, Lohr TO. Apoptosis as a possible cause of gradual development of complete heart block and fatal arrthythmias asociated with absence of the AV node, sinus node, and internodal pathways. Circulation 1996;93:1424-38. 7. Colucci WS, Braunwald E, Pathophysiology of heart failure. En: Barunwald E de. Heart disease. 5 ed. Philadelphia: W.B. Saunders,1997,394-420. 8. Geng Y-J, Libby P. Evidence for apoptosis in advanced human atheroma. Colocalization with interleukin-1b-converting enzyme. Am J Pathol 1995;147:251-66. 9. Dzau VJ, Gibbons GH, Mann M, Braun-Dullaeus R. Future horizons in cardiovascular molecular therapeutics. Am J Cardiol 1997;80(9A):331-91. 10. Alnemri, E.S., Livingston, D.J., Nicholson, D.W., Salvesen, G., Thornberry, N.A., Wong, W.W. & Yuan, J. (1996). Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell 87, 171. 11. Ashkenazi, A. & Dixit, V.M. (1998). Death receptors: signalling and modulation. Science 281, 1305-1308. 12. Bamji, S.X., Majdan, M., Pozniak, D., Belliveau, DJ., Aloyz, R., Khon, J., Causing, C.G. & Miller, F.D. (1998). The p75 neurotrophin receptor mediates neuronal apoptosis and is essential for naturally occurring sympathetic neuron death. J. Cell Biol. 140, 911-923. 13. Bergeron, L., Perez, G.I., Mcdonald, G., Shi, L., Sun ,Y., Jurisicova, A., Varmuza, S., Latham, K.E.,, Flaws, J.A., Salter, J.C.M., Hara, H., Moskowitz, M.A., Li, E., Greenberg, A., Tilly, J.L. & Yuan, J. (1998). Defects in regulation of apoptosis in caspase-2 deficient mice. Genes Dev. 12, 1304-1314. 14. Carter, B.D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B., Offenhauser, N., Bohm-Matthaei, R., Baeuerle, P.A. & Barde, Y.A. (1996). Selective activation of NF- B by nerve growth factor through the neurotrophin receptor p75. Science 272, 542-545. 15. Chao, D.T. & Korsmeyer, S.J. (1998). Bcl-2 family: regulators of cell death. Annu. Revv Immunol. 16, 395-419.
  • 44. Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Apoptosis Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Página44 16. Nicholson, D.W. & Thornberry, N.A. (1997). Caspases: killer proteases. Trends Biochem. Sci. 22, 299-306. 17. Núñez, G. & del Peso, L. (1998). Linking extracellular survival signals and the apoptotic machinery. Curr. Op. Neurobiol. 8, 613-618. 18. Parrizas, M., Saltiel, A.R. & LeRoith, D. (1997). Insuline-like growth factor 1 inhibits apoptosis using the phosphatidylinositol 3’-kinase and mitogen-activated protein kinase pathways. J. Biol. Chem. 272, 154-161. 19. Parsadanian, A.S., Cheng, Y., Keller.Peck C.R., Holtzman, D.M. ans Snider, W.D. (1998). Bcl-XL is an antiapoptotic regulator for postnatal CNS neurons. J. Neurosci. 18, 1009-1019. 20. Tanaka, M., Sawada, M., Miura, M. & Marunouchi, T. (1998). Insulin-like growth factor-I analogue prevents apoptosis mediated through an interleukin- 1 -like protease of cerebellar external granular later neurons: developmental stage-specific mechanism of neuronal cell death. Neuroscience 84, 89-100. 21. Thornberry, N.A. & Lazebnik, Y. (1998) Caspases: enemies within. Science 281, 1312-1316. 22. Xue, D. & Horvitz, H.R. (1995). Inhibition of the Caenorhabditis elegans cell-death protease CED-3 by a CED-3 cleavage site in baculovirus p35 protein. Nature 377, 248-351. 23. Wyllie AH, Kerr JFR, Curri AR. Cell death: The significance of apoptosis. Int Rev Cytol 1980;68:251. 24. Cory S. Regulation of lymphocyte survived by the Bcl-2 gene family. Ann Rev, Immunol 1995;13:513-43. 25. _____ . Fascinating death factor. Nature 1994:367(6461):317-8. 26. Silvestri F, Ribatti D, Nico B, Silvestri N, Romito A, Dammacco F. Apoptosis or programmata cell death: regulatory and pathophysiological mechanisms (editorial). Ann Ital Med Int 1995;10(1):7-13. 27. Wyllie AH, Morris RG, Smith AL, Dunlop D. Chromatin Cleavage in apoptosis: association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis. J Pathol 1984;142:67.