1. PROYECTO DE LA LICENCIATURA EN QUÍMICA
DETERMINACIÓN DE FUNGICIDAS EN VINO
MEDIANTE EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA Y
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDAACOPLADAA
ESPECTROMETRÍA DE MASAS USANDO UN
ANALIZADOR HÍBRIDO TIPO Q-TOF
JORGE CASADO AGRELO
Santiago de Compostela, Marzo de 2011
FACULTAD DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y
BROMATOLOGÍA

2. NTRODUCCIÓN
• Los Fungicidas Sustancias tóxicas empleadas para impedir el crecimiento de
hongos perjudiciales para plantas, animales y personas.
• Riesgo
• Legislación
Inhibición de enzimas  problemas en aparato reproductor
Tóxicos LC50
Unión Europea: niveles máximos de residuos (MRLs) de
fungicidas en frutas y verduras
Suiza e Italia: niveles máximos de fungicidas en vino
I
• Propiedades grupo básico pKa < 3,4
grupo ácido pKa > 11,4
vino pH ≈ 3,7
Forma neutra
Sólidos a T ambiente (excepto MET  líquido)
Lipofílicos  Log Kow: 2,15 - 5,13
Solubilidad en agua baja

3. • En este proyecto
Fungicidas orgánicos,
algunos de ellos sistémicos:

4. • Métodos de determinación
• Métodos de preparación de muestra
Para extraer fungicidas de muestras de vino o agua se ha empleado en la bibliografía:
► LLE
► SPE
► SPME
► LPME
Para determinar fungicidas en muestras de vino o agua se ha desarrollado en la bibliografía:
► GC
► LC
combinada con detectores de:
► ECD
► NPD
► MS
Q-TOF  m/z exactas  sensibilidad en modo SCAN

5. BJETIVOS
Avanzar en la optimización de metodologías de preparación de muestra mediante extracción en
fase sólida, así como en la determinación de un grupo amplio de fungicidas orgánicos en vino.
1. Optimización del método de determinación por LC-MS/MS.
2. Caracterización del método de determinación.
3. Optimización del proceso de preparación de muestra mediante SPE.
4. Caracterización y validación del método propuesto.
5. Aplicación a muestras de vino comercial para determinar su posible
contaminación con los fungicidas considerados.
Para ello se siguieron los siguientes pasos:
O

6. ESARROLLO
• Optimización de LC-ESI-MS/MS
Parámetros de la ionización (ESI):
Todos los analitos dieron señal en modo
positivo (carácter básico)
► Voltaje del capilar (80-200 V): no
resultó significativo. Se trabajó a
160 V.
► Energía de colisión (10-20 eV):
diferente para cada fungicida.
Modificadores de la fase móvil:
Efecto del pH y de la fuerza iónica en la
ionización y la separación
cromatográfica
► Ácido fórmico (pH)
► Acetato amónico (fuerza iónica)
Se empleó 1 mM de acetato amónico
D
Gradiente cromatográfico:
A: agua con 1 mM de acetato amónico
B: acetonitrilo con 1 mM de acetato amónico
Tiempo /min 0 2 7 15 20 23 24 27 28 34
% A 70 70 50 50 35 25 0 70 70 70
% B 30 30 50 50 65 75 100 30 30 30

7. 5
x10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
Tiempo (
min)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cuentas
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
LC Agilent 1200
Columna cromatográfica Zorbax Eclipse XDB C18
Fase estacionaria C18
Dimensiones 100 mm x 2,1 mm
Tamaño de partícula 3,5 µm
Temperatura del horno 35 °C
Volumen de inyección 15 μL
Flujo 0,2 mL/min
Fase acuosa Agua 1 mM acetato amónico
Fase orgánica Acetonitrilo 1 mM acetato amónico
MS/MS Agilent 6520
Modo de ionización ESI positivo
Voltaje de la aguja 4000 V
Temperatura gas secado (N2) 300 ºC
Flujo gas de secado (N2) 9 L/min
Presión gas nebulización (N2) 40 PSI
Iones referencia m/z 121,0509 y m/z 922,0098
Modo de adquisición Centroide
MET TRI IPR AZO TEB PEN DIN CYP BEN DIF
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
tR 10,31 13,16 14,97 15,53 16,52 17,42 18,78 19,72 21,91 22,59

8. • Caracterización de LC-MS/MS
TRI
y = 516,51x - 7490,2
R2
= 0,9998
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
0 500 1000 1500 2000 2500
Concentración (ng/mL)
Área
Las transiciones más intensas fueron
empleadas para la cuantificación:
► Repetibilidad: RSD < 9,2 % (10 ng/mL)
► Reproducibilidad: RSD < 8,5 % (25 ng/mL)
► LOQ (10 mL): 0,2 – 1,2 ng/mL
► Linealidad: R2 > 0,991
MET
y = 4066,6x + 39954
R2
= 0,999
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
0 200 400 600 800 1000
Concentración (ng/mL)
Área
Fungicida Transición Energía colisión
MET 280,1539 → 220,1328 10
TRI 296,1159 → 70,0407 3
IPR 321,2165 → 119,085 8
AZO 404,1225 → 372,0968 20
TEB 308,1517 → 70,0407 18
PEN 284,0707 → 70,0406 15
DIN 326,0805 → 70,0406 22
CYP 226,1332 → 93,0575 35
BEN 326,1746 → 148,1115 10
DIF 406,0708 → 251,002 20

9. • Optimización de la SPE
Se evaluaron dos adsorbentes poliméricos:
► Oasis HLB: DVB-VP
► Oasis MAX: DVB-VP funcionalizado con amina cuaternaria
Se evaluaron dos disolventes de elución:
► Metanol: extractos coloreados con HLB
► Acetonitrilo: empleado en la fase móvil de LC
Se escogió acetonitrilo por compatibilidad y selectividad
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
MAX
HLB
MAX
HLB
MAX
HLB
MAX
HLB
MAX
HLB
MAX
HLB
MAX
HLB
MAX
HLB
MAX
HLB
MAX
HLB
MET TRI IPR AZO TEB PEN DIN CYP BEN DIF
% F3
% F2
% F1
Pruebas de volumen de
rotura (20 mL):
• MAX: 21,2 % MET en
2º cartucho
• HLB: 0,1 % en 2º
cartucho
Volumen de elución
2 mL

10. 10 – 20 mL de vino
Dilución 1:2 (v/v) con agua milliQ
SPE cartucho Oasis HLB 200 mg
1. Acondicionamiento: 4 mL metanol,
4 mL agua milliQ pH 3,7
2. Paso de muestra: 3 mL/min
3. Lavado: 5 mL agua milliQ
4. Secado: 40 min bajo corriente de N2
5. Elución: 2 mL acetonitrilo
6. Dilución: 1:1 (v/v) con agua milliQ
LC-MS/MS
(inyección 15 μL)

11. Eficacia ESI
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
MET TRI IPR AZO TEB PEN DIN CYP BEN DIF
%
► Recuperaciones cuantitativas
► No hay efecto matriz
Calibración
externa
Eficacia SPE
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
Blanco
Tinto
MET TRI IPR AZO TEB PEN DIN CYP BEN DIF
%
• Caracterización del método propuesto

12. ► Recuperación vino tinto > 80,8 %
► Recuperación vino blanco > 83,6 %
Recuperaciones
Cuantitativas
Recuperación 100 ng/mL
0
20
40
60
80
100
120
MET TRI IPR AZO TEB PEN DIN CYP BEN DIF
%
Blanco
Tinto
Recuperación 5 ng/mL
0
20
40
60
80
100
120
140
MET TRI IPR AZO TEB PEN DIN CYP BEN DIF
%
Blanco
Tinto
ppb  TRAZA
► LOD: 0,04 – 0,16 ng/mL
► LOQ: 0,08 – 0,48 ng/mL

13. • Aplicación a muestras reales
Cód MET TRI IPR AZO
W1 30,6 ± 0,7 <LOQ 3,9 ± 0,2 27,2 ± 1,6
W2 3,9 ± 0,1 2,8 ± 0,2 3,6 ± 0,3 n.d.
W3 45,5 ± 1,7 11,8 ± 2,2 109,4 ± 7,1 3,3 ± 0,1
W4 10,4 ± 0,7 <LOQ <LOQ <LOQ
W5 48,7 ± 0,7 15,5 ± 0,7 50,9 ± 0,3 1,76 ± 0,02
W6 10,7 ± 0,2 8,31 ± 0,08 22,9 ± 0,2 <LOQ
W7 124,9 ± 1,7 57,5 ± 0,4 85,7 ± 0,6 2,2 ± 0,1
W8 0,98 ± 0,01 <LOQ <LOQ n.d.
W9 n.d. n.d. n.d. <LOQ
R1 n.d. n.d. n.d. <LOQ
R2 1,97 ± 0,08 3,9 ± 0,2 <LOQ <LOQ
R3 3,49 ± 0,03 n.d. 12,1 ± 0,5 n.d.
R4 0,55 ± 0,02 n.d. n.d. n.d.
R5 2,4 ± 0,4 n.d. 50,2 ± 8,9 <LOQ
R6 1,75 ± 0,03 2,4 ± 0,1 <LOQ <LOQ
R7 5,9 ± 0,3 3,66 ± 0,07 4,4 ± 0,1 n.d.
R8 15,7 ± 0,4 <LOQ <LOQ <LOQ
Vinos con denominación de origen de distintas zonas de España
TEB CYP BEN DIF
1,14 ± 0,05 <LOQ <LOQ <LOQ
n.d. n.d. n.d. n.d.
<LOQ 36,7 ± 0,4 <LOQ n.d.
<LOQ n.d. <LOQ n.d.
4,8 ± 0,5 n.d. 12,9 ± 0,6 0,51 ± 0,02
6,7 ± 0,6 5,0 ± 0,3 <LOQ n.d.
6,4 ± 0,5 42,3 ± 1,7 2,2 ± 0,1 n.d.
n.d. 0,65 ± 0,18 n.d. n.d.
<LOQ <LOQ n.d. 1,6 ± 0,3
<LOQ 2,3 ± 0,2 n.d. n.d.
n.d. n.d. <LOQ <LOQ
n.d. <LOQ <LOQ n.d.
n.d. n.d. n.d. n.d.
22,7 ± 3,1 0,38 ± 0,12 n.d. n.d.
1,2 ± 0,3 n.d. n.d. n.d.
<LOQ <LOQ n.d. n.d.
n.d. 0,8 ± 0,3 <LOQ n.d.
n.d.: no detectado; <LOQ: detectado a niveles de concentración inferiores al límite de cuantificación
ng/mL n = 3

14. 7
x10
0.5
1
+ESI TIC MS(all) W 62.d Smooth (2)
3
x10
0
2
4
+ESI EIC Product Ion Frag=80.0V CID@3.0 (296.1165[z=1] -> 70.0405) W 62.d Smooth (2)
5
x10
0.5
1
1.5
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@8.0 (321.2173[z=1] -> 119.0852) W 62.d Smooth (…
5
x10
0.5
1
1.5
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@10.0 (280.1543[z=1] -> 220.1327) W 62.d Smooth
3
x10
0
2
4
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@20.0 (404.1242[z=1] -> 372.0971) W 62.d Smooth
Cuentas vs. Tiempo de adquisición (min)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
TRI
IPR
AZO
MET
7
x10
0.5
1
+ESI TIC MS(all) W 62.d Smooth (2)
3
x10
0
2
4
+ESI EIC Product Ion Frag=80.0V CID@3.0 (296.1165[z=1] -> 70.0405) W 62.d Smooth (2)
5
x10
0.5
1
1.5
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@8.0 (321.2173[z=1] -> 119.0852) W 62.d Smooth (…
5
x10
0.5
1
1.5
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@10.0 (280.1543[z=1] -> 220.1327) W 62.d Smooth
3
x10
0
2
4
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@20.0 (404.1242[z=1] -> 372.0971) W 62.d Smooth
Cuentas vs. Tiempo de adquisición (min)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
TRI
IPR
AZO
MET
7
x10
0.25
0.5
0.75
1
1.25
+ESI TIC MS(all) W 62.d Smooth (3)
3
x10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@18.0 (308.1528[z=1] -> 70.0406) W 62.d Smooth (…
3
x10
0
2
4
6
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@35.0 (226.1337[z=1] -> 93.0574) W 62.d Smooth (…
3
x10
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@10.0 (326.1751[z=1] -> 148.1114) W 62.d Smooth
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Cuentas vs. Tiempo de adquisición (min)
TEB
CYP
BEN
7
x10
0.25
0.5
0.75
1
1.25
+ESI TIC MS(all) W 62.d Smooth (3)
3
x10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@18.0 (308.1528[z=1] -> 70.0406) W 62.d Smooth (…
3
x10
0
2
4
6
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@35.0 (226.1337[z=1] -> 93.0574) W 62.d Smooth (…
3
x10
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
+ESI EIC Product Ion Frag=160.0V CID@10.0 (326.1751[z=1] -> 148.1114) W 62.d Smooth
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Cuentas vs. Tiempo de adquisición (min)
TEB
CYP
BEN
Cromatogramas muestra W7:

15. ONCLUSIONES
C
► SPE excelente método de preparación de muestra  Buena la combinación de
cartuchos HLB con acetonitrilo.
► Método aplicable a distintos tipos de vinos blancos y tintos.
► LOQ: 0,08-0,48 ng/mL  Muy por debajo de lo legislado por la Unión Europea.
► Método adecuado para determinar fungicidas en muestras de vino.
► Concentraciones en muestras analizadas por debajo de lo legislado.