1. Pomocou 8-farebnej prietokovej cytometrie bola vo vzorkách periférnej krvi
100 náhodne vybraných pacientov s CLL (Tab.1) analyzovaná povrchová
expresia ROR1 proteínu na nádorových bunkách. Porovnané boli dve varianty
imunofenotypovej detekcie CLL buniek (Obr.1) – A) použitím modifikovaného
protokolu pre sledovanie zvyškovej choroby podľa Rawstrona (kombinácia
znakov CD45/CD3/CD19/CD5/CD81/CD79b/CD22), a B) detekcia na základe
povrchovej expresie CD45/ROR1 proteínu. Naše výsledky overili povrchovú
expresiu ROR1 proteínu na bunkách CLL u všetkých testovaných pacientov
a potvrdili, že expresia ROR1 proteínu spoľahlivo identifikuje bunky CLL
a umožňuje ich efektívne odlíšiť od zdravých B-lymfocytov, a to i u pacientov
s nízkym obsahom CLL buniek (pacienti v terapii, v stave celkovej remisie
po terapii,...). Proteín ROR1 sa osvedčil ako vhodný diagnostický znak
a predstavuje jednoduchú a efektívnu alternatívu ku klasickému protokolu
pre sledovanie zvyškovej choroby podľa Rawstrona (Tab.2).
Analýza expresie ROR1 proteínu u pacientov
s chronickou lymfocytárnou leukémiou
Greif, I.1, Kotašková, J. 1,2, Pavlová, Š.1,2, Stehlíková, O.1, Plevová, K. 1,2, Doubek, M. 1,2, Bryja, V.3, Pospíšilová Š.1,2
1Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematologická a onkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno a Lékařská fakulta, Masarykova univerzita, Brno;
2CEITEC – Středovevropský technologický institut, Masarykova univerzita, Brno; 3Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno
Úvod:
S rozvojom molekulárne-biologických metód narastá množstvo molekúl s potenciálom stať sa vhodným diagnostickým nástrojom či terapeutickým cieľom. Takou molekulou
je i transmembránový tyrozínkinázový receptor, proteín ROR1, ktorý sa fyziologicky vyskytuje na povrchu buniek počas embryonálneho vývinu, zatiaľčo v dospelosti je jeho
expresia detekovaná takmer výhradne na nádorových bunkách. U hematologických malignít je ROR1 exprimovaný na povrchu buniek niektorých B-lymfoproliferácií,
predovšetkým chronickej lymfocytárnej leukémie (CLL). Podľa niektorých autorov by mohol ROR1 slúžiť ako diagnostický znak CLL. Z tohto pohľadu je nevyhnutné posúdiť
variabilitu jeho expresie medzi pacientmi a súčasne sledovať prípadné zmeny v miere expresie v súvislosti s terapiou cielenou na CLL.
Práca bola podporená grantami AZV-MZ-ČR 15-29793A-4/2015 a 15-30015A-4/2015, MŠMT ČR MUNI/A/1028/2015, MZ ČR-RVO (FNBr, 65269705) a projektem CEITEC 2020 (LQ1601) MŠMT ČR.
Záver:
 U všetkých testovaných pacientov bola na bunkách CLL potvrdená povrchová
expresia proteínu ROR1 pomocou 8-farebnej prietokovej cytometrie.
 ROR1 je nepochybne perspektívny diagnostický znak potenciálne využiteľný pre
diagnostiku i pre detekciu zvyškovej populácie CLL buniek.
Ciele práce:
1. Overiť možnosť využitia proteínu ROR1 pre detekciu CLL buniek a potvrdiť jeho vhodnosť pre sledovanie zvyškovej choroby pomocou prietokovej cytometrie.
2. Overiť vplyv terapie na mieru expresie ROR1 proteínu, tj. overiť vhodnosť proteínu ROR1 ako terapeutického cieľa pre liečbu založenú na monoklonálnych protilátkach,
a to aj u predliečených pacientov.
1. ROR1 ako potenciálny diagnostický znak
 Expresia ROR1 neklesá ani nemizne vplyvom terapie. Naopak,
u pacientov v/po terapii je expresia ROR1 signifikantne vyššia oproti pacientom,
ktorí terapiu nepodstúpili.
 Selektívna expresia ROR1 na CLL bunkách, predurčuje ROR1 proteín ako
terapeutický cieľ, a to i u pacientov, ktorí už v minulosti podstúpili nejakú formu
terapie.
Obr.1: Detekcia nádorovej populácie CLL buniek v periférnej krvi pacienta s CLL pomocou 8-farebnej
prietokovej cytometrie.
Rawstron: Nádorová populácia CLL buniek identifikovaná podľa modifikovaného protokolu
pre sledovanie zvyškovej choroby podľa Rawstrona (kombinácia znakov CD45/CD3/CD19/CD5/CD81/
CD79b/CD22).
ROR1: Populácia ROR1+ buniek identifikovaná na základe povrchovej expresie ROR1 proteínu.
Z dot-plot grafov je zjavné, že v oboch prípadoch sa jedná o rovnakú populáciu buniek, a teda obe
varianty detekcie identifikujú nádorové CLL bunky.
legenda: žltá - CLL bunky (CD3-/CD5+/CD19+/nízka expresia CD22, CD79 a CD81); zelená –
B-lymfocyty/ROR1+ bunky; červená – granulocyty+monocyty (CD3-/CD19-); modrá – T-lymfocyty
(CD3+/CD19-); fialová – B-lymfocyty/non-B-CLL bunky (CD3-/CD5-/CD19+/ROR1-); populácie
lymfocytov boli detekované na základe SS, FS a expresie CD45 (nezobrazené).
počet testovaných pacientov s CLL vek testovaných pacientov s CLL
celkom bez terapie v/po terapii min. max. medián
muži 60 19 41 41 82 66
ženy 40 19 21 48 87 68
celkom 100 38 62 41 87 67
Tab.1: Súbor pacientov s CLL použitý v analýze metódou prietokovej cytometrie.
Tab.2: Porovnanie detekcie CLL buniek na základe povrchovej expresie ROR1
proteínu oproti protokolu pre sledovanie zvyškovej choroby podľa Rawstrona.
Obr.2: Porovnanie relatívnej expresie génu
ROR1 medzi skupinami pacientov
v rôznych fázach ochorenia a forme
terapie.
legenda: neaktívni – odber v neaktívnej
fáze ochorenia bez terapie; aktívni –
odber v aktívnej fáze ochorenia bez
terapie; FCR – terapia kombináciou
liečív fludarabin, cyklofosfamid a
rituximab; progresia po CR – odber po
terapii vo fáze progresie po celkovej
remisii; refraktérni – odber po
viacnásobnej terapii u silne rezistentnej
formy ochorenia; R+Zyd – terapia
kombináciou liečív rituximab a zydelig;
ibrutinib – terapia podávaním ibrutinibu.
2. ROR1 ako potenciálny terapeutický cieľ
Tab.3: Súbor pacientov s CLL použitý v analýze metódou qRT-PCR.
Pomocou metódy qRT-PCR bola potvrdená expresia génu ROR1 vo všetkých testovaných
vzorkách pacientov s CLL (Tab.3). Hodnotených bolo 56 vzoriek (32 pacientov s CLL), pričom
každá vzorka reprezentovala jedinečný odber v rôznych fázach ochorenia a typu terapie.
Pacienti, ktorí podstúpili nejakú formu terapie vykazovali signifikantne vyššiu mieru
expresie než pacienti bez terapie (Obr.2). Rozdiely expresie ROR1 proteínu medzi
jednotlivými skupinami neliečených pacientov nie sú výrazné, k výraznejším rozdielom
dochádza až u skupín pacientov po terapii. Zmeny expresie génu ROR1 u pacientov
v priebehu liečby (Obr.3) naznačuje možný vplyv terapie na mieru expresie. Z hľadiska
hodnotenia potenciálu ROR1 proteínu ako terapeutického cieľa je rozhodujúce, že
podstúpením terapie nedochádza k zníženiu ani vymiznutiu povrchovej expresie ROR1
proteínu. Naše výsledky tým potvrdili, že ROR1 je možné využiť pre
bez terapie v/po terapii
skupina pacientov
na základe fázy
ochorenia a
terapie
neaktívni aktívni
terapia
fludarabin,
cyklofosfamid
a rituximab
refraktérni
progresia po
celkovej remisii
terapia
rituximab
a zydelig
terapia
ibrutinib
počet vzoriek
(počet pacientov)
9 8 2 8 5 14 10
17 (13) 39 (19)
Percento buniek identifikovaných ako CLL pomocou ROR1
(100% = CLL bunky identifikované podľa Rawstrona)
zhoda 100% 99,9 - 96,6% 96,5% a menej
počet vzoriek 123 (90%) 9 (7%) 3 (3%)
Obr.3: Zmeny expresie génu ROR1 u pacienta s CLL v priebehu liečby.
legenda: FCR – terapia kombináciou liečív fludarabin, cyklofosfamid a rituximab; ofa/dexa – terapia
kombináciou liečív ofatumumab a dexametazon; PR – parciálna remisia; B/R – terapia kombináciou liečív
bendamustin a rituximab; ibrutinib – terapia podávaním ibrutinibu; R+Zyd – terapia kombináciou liečív
rituximab a zydelig; FT – prvá terapia.
cielenú liečbu založenú na
monoklonálnych protilátkach
nezávisle od toho, či pacient
v minulosti podstúpil terapiu alebo
nie.