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Presentació Agrovin

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Presentació Agrovin

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Presentació Agrovin

  1. 1. Ignacio Belda Antonio Santos Eva Navascués Levaduras No-Saccharomyces como fuente de enzimas de interés enológico. XXVI Congrés Anual de l’Associació Catalana d’Enòlegs
  2. 2. • Etapas iniciales: Hanseniaspora (50%- 75%), Candida y otras levaduras No-Saccharomyces • Etapas intermedias: Metschnikowia, Torulaspora y Pichia • Etapas finales: Predominio de Saccharomyces cerevisiae, más tolerante al etanol Microbiología en Fermentaciones espontáneas Kurtzman y Fell. Elsevier Science (Amsterdam, 1998). Jolly et al., 2014. FEMS Yeast Research 14, 215–237. No-Saccharomyces S. cerevisiae Más de 40 especies diferentes de levadura
  3. 3. • Etapas iniciales: Hanseniaspora (50%- 75%), Candida y otras levaduras No-Saccharomyces • Etapas intermedias: Metschnikowia, Torulaspora y Pichia • Etapas finales: Predominio de Saccharomyces cerevisiae, más tolerante al etanol Microbiología en Fermentaciones espontáneas Kurtzman y Fell. Elsevier Science (Amsterdam, 1998). Jolly et al., 2014. FEMS Yeast Research 14, 215–237. No-Saccharomyces S. cerevisiae Más de 40 especies diferentes de levadura Diferentes grados de implantación e influencia en el proceso de fermentación.
  4. 4. Grado alcohólico (%) Kloeckera Hanseniospora Candida Metschnikowia Pichia Zygosaccharomyces Torulaspora Saccharomyces spp. Saccharomyces spp. S. cerevisiae 0 3 6 9 12 Efecto de la inoculación de Saccharomyces cerevisiae Pretorius., 2000. Yeast 16: 675-729. Belda et al., 2015. Applied Microbiology and Biotechnology 99, 1911-1922
  5. 5. Grado alcohólico (%)0 3 6 9 12 Efecto de la inoculación de Saccharomyces cerevisiae S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e Reducción de la diversidad microbiana Eliminación de la actividad biológica colateral Pretorius., 2000. Yeast 16: 675-729. Belda et al., 2015. Applied Microbiology and Biotechnology 99, 1911-1922
  6. 6. Falta de control sobre la microbiota prefermentativa Grado alcohólico (%)0 3 6 9 12 S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e Reducción de la diversidad microbiana Eliminación de la actividad biológica colateral Maceración prefermentativa Problema Prácticas enológicas con repercusión microbiológica
  7. 7. Producción de etanol y otros alcoholes y ésteres Incremento de compuestos aromáticos Liberación de enzimas hidrolíticas Ugliano et al., 2006. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 6322-6331. Loscos et al., 2007. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 6674-6684. Influencia de las levaduras en la calidad del vino
  8. 8. Producción de etanol y otros alcoholes y ésteres Incremento de compuestos aromáticos Liberación de enzimas hidrolíticas Potencial aplicación de no-Saccharomyces Ugliano et al., 2006. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 6322-6331. Loscos et al., 2007. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 6674-6684. Influencia de las levaduras en la calidad del vino
  9. 9. Dominantes en las primeras etapas fermentativas y tradicionalmente asociadas a diversos inconvenientes (incremento de acido acético y otras desviaciones sensoriales). Elevado potencial enzimático: Actividades glicosidasas Aromas terpénicos β-liasa Aromas tiólicos Proteasa Inestabilidad proteica Especies con interés enológico: Kloeckera apiculata Torulaspora delbrueckii Kluyveromyces thermotolerans Metschnikowia pulcherrima Levaduras “no-Saccharomyces” Pectinasas - Filtrabilidad - Liberación de aromas y compuestos fenólicos Jolly et al., 2003. South African Journal of Enology and Viticulture 24, 55-62. Cordente et al., 2012. Applied Microbiology and Biotechnology 96, 601–618.
  10. 10. Screening metabólico de alto rendimiento para la caracterización de levaduras no-Saccharomyces y su incidencia sobre la calidad del vino
  11. 11. Muestreo: origen de las levaduras • 762 levaduras aisladas y caracterizadas • Vendimias 2012-2014 Orígenes: - D.O. Ribera del Duero (Tempranillo, Cabernet Sauvignon y Merlot) - D.O. Tierra de León (Prieto Picudo) - D.O. Rueda (Verdejo)
  12. 12. 50% 12% 12% 7% 5% 4% 3%2%1% <1% Hanseniaspora uvarum Metschnikowia pulcherrima Lachancea thermotolerans Hanseniaspora clermontiae Metschnikowia fruticola Aureobasidium pullulans Metschnikowia viticola Cryptococcus amylolentus Hanseniaspora osmophila Saccharomyces cerevisiae Torulaspora delbrueckii Wickerhamomyces anomalus Kluyveromyces marxianus Meyerozyma guilliermondii Rhodotorula glutinis Zygosaccharomyces bailii Estudio poblacional (3 D.O., 3 vendimias, 5 variedades de uva) 762 levaduras 16 especies
  13. 13. Estudio enzimático de alto rendimiento β-glucosidasa β-xilosidasa α-L-arabinofuranosidasa β-liasa Proteasa Pectinasa Celulasa Revelación de compuestos aromáticos Mejora de propiedades sensoriales y tecnológicas 762 levaduras
  14. 14. Estudio enzimático de alto rendimiento β-glucosidasa β-xilosidasa α-L-arabinofuranosidasa β-liasa Proteasa Pectinasa Celulasa Revelación de compuestos aromáticos Mejora de propiedades sensoriales y tecnológicas 762 levaduras Desarrollo de métodos de screening masivo
  15. 15. 0 100 200 300 400 500 600 700 NS-EM-1 NS-EM-3 NS-EM-5 NS-EM-7 NS-EM-9 NS-EM-11 NS-EM-13 NS-EM-15 NS-EM-17 NS-EM-19 NS-EM-21 NS-EM-23 NS-EM-25 NS-EM-27 NS-EM-29 NS-EM-31 NS-EM-33 NS-EM-35 NS-EM-37 NS-EM-39 NS-EM-41 NS-EM-43 NS-EM-45 NS-EM-47 NS-EM-49 NS-EM-51 NS-EM-53 NS-EM-55 NS-EM-57 NS-EM-59 NS-EM-61 NS-EM-63 NS-EM-65 NS-EM-67 NS-EM-69 NS-EM-71 NS-EM-73 NS-EM-75 NS-EM-77 NS-EM-79 NS-EM-81 NS-EM-83 NS-EM-85 NS-EM-87 NS-EM-89 NS-EM-91 NS-EM-93 NS-EM-95 NS-EM-97 NS-EM-99 NS-G-61(C+) Enzima15Agrovin(C+) β-D-xilosidasa Estudio de actividades enzimáticas Unidadesdeabsorbancia Efecto de tratamientos agresivos en campo Finca A Finca B Finca C Finca D Observación de variabilidad poblacional
  16. 16. 0 100 200 300 400 500 600 700 NS-EM-1 NS-EM-3 NS-EM-5 NS-EM-7 NS-EM-9 NS-EM-11 NS-EM-13 NS-EM-15 NS-EM-17 NS-EM-19 NS-EM-21 NS-EM-23 NS-EM-25 NS-EM-27 NS-EM-29 NS-EM-31 NS-EM-33 NS-EM-35 NS-EM-37 NS-EM-39 NS-EM-41 NS-EM-43 NS-EM-45 NS-EM-47 NS-EM-49 NS-EM-51 NS-EM-53 NS-EM-55 NS-EM-57 NS-EM-59 NS-EM-61 NS-EM-63 NS-EM-65 NS-EM-67 NS-EM-69 NS-EM-71 NS-EM-73 NS-EM-75 NS-EM-77 NS-EM-79 NS-EM-81 NS-EM-83 NS-EM-85 NS-EM-87 NS-EM-89 NS-EM-91 NS-EM-93 NS-EM-95 NS-EM-97 NS-EM-99 NS-G-61(C+) Enzima15Agrovin(C+) β-D-xilosidasa Finca con tratamiento fitosanitario Estudio de actividades enzimáticas Unidadesdeabsorbancia Efecto de tratamientos agresivos en campo Finca A Finca B Finca C Finca D
  17. 17. Estudio filo-funcional 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 Hanseniaspora uvarum Metschnikowia pulcherrima Lachancea thermotolerans Hanseniaspora clermontiae Metschnikowia fruticola Aureobasidium pullulans Identificación molecular de las especies de levadura Caracterización enzimática
  18. 18. Estudio filo-funcional Identificación molecular de las especies de levadura Caracterización enzimática
  19. 19. Estudio filo-funcional A. pullulans C. amylolentus H. clermontiae H. osmophila H. uvarum K. marxianus L. thermotolerans M. fruticola M. pulcherrima M. viticola M. guilliermondii R. glutinis S. cerevisiae T. delbrueckii W. anomalus Z. bailii
  20. 20. Estudio filo-funcional A. pullulans C. amylolentus H. clermontiae H. osmophila H. uvarum K. marxianus L. thermotolerans M. fruticola M. pulcherrima M. viticola M. guilliermondii R. glutinis S. cerevisiae T. delbrueckii W. anomalus Z. bailii ↑ abundancia
  21. 21. Estudio filo-funcional A. pullulans ↓ abundancia K. marxianus M. fruticola M. pulcherrima M. viticola T. delbrueckii
  22. 22. Objetivo Desarrollo de nuevos productos basados en un exhaustivo conocimiento sobre sus propiedades Investigación dirigida a la industria
  23. 23. Revelación de aromas tiólicos con Torulaspora delbrueckii • Cultivo líquido • Sin rehidratación • Dosis 20 ml/Hl • Certificación ecológica (SOHISCERT)
  24. 24. T. delbrueckii Actividad β-liasa de T. delbrueckii
  25. 25. T. delbrueckii Actividad β-liasa de T. delbrueckii Aplicación en bodega de una cepa seleccionada en base a sus propiedades enzimáticas
  26. 26. Incremento sensorial en variedades neutras mediante revelación de aromas tiólicos Condiciones de la experiencia Mosto flotado variedad Airén Volumen: 7000 l Temperatura 16ºC 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 0 2 4 6 8 10 12 Millones(UFC/ml) Td 10 exp 6 ufc/ml Sc 1o exp 6 ufc/ml densidad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 días T. delbrueckii S. cerevisiae Densidad Inoculación secuencial (SQ) de T. delbrueckii + S. cerevisiae Seguimiento de las poblaciones
  27. 27. Caracterización del perfil aromático y análisis sensorial T. delbrueckii + espontánea Inoculación secuencial de T. delbrueckii Inoculación simultánea de T. delbrueckii Fermentación con S. cerevisiae
  28. 28. Caracterización del perfil aromático y análisis sensorial TD SQ SM Sc ↑ Revelación de compuestos tiólicos T. delbrueckii + espontánea Inoculación secuencial de T. delbrueckii Inoculación simultánea de T. delbrueckii Fermentación con S. cerevisiae
  29. 29. Producción de manoproteínas Manoproteínas en vino: - Incremento de la estructura en boca de los vinos - Aumento dulzor y redondez - Complejidad y persistencia aromática - Disminución de la astringencia Contenido en manoproteínas. Equiv. manano mg/l T. delbrueckii + espontánea Inoculación secuencial de T. delbrueckii Inoculación simultánea de T. delbrueckii Fermentación con S. cerevisiae
  30. 30. Selección racional de levaduras con actividad pectinolítica y su influencia en aspectos tecnológicos y sensoriales de vinos
  31. 31. Actividad pectinolítica A. pullulans M. pulcherrima L. thermotolerans ++ + -
  32. 32. Actividad pectinolítica en levaduras Levaduras: Aureobasidium pullulans (++) Metschnikowia pulcherrima (+) Kluyveromyces thermotolerans (-) Saccharomyces cerevisiae (-) Enzimas: Enozym Lux (Control ++) Enovin Clar (Control +) Con maceración prefermentativa 12ºC (48h para levaduras; 4h para enzimas) 25ºC (temperatura de fermentación) Sin maceración prefermentativa 25ºC (temperatura de fermentación) Pectinasa IC Antocianos FiltrabilidadTurbidez IPT + S. cerevisiae
  33. 33. 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12 IC ab a b b b b Con maceración prefermentativa 0 0,05 0,1 0,15 Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25 IC ab ab a a b b Resultados en laboratorio Sin maceración prefermentativa + Sc + Sc + Sc + Sc 14 12 10 8 6 15 10 5 0 UnidadesAbs UnidadesAbs
  34. 34. 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12 IC ab a b b b b Con maceración prefermentativa 0 0,05 0,1 0,15 Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25 IC ab ab a a b b Resultados en laboratorio Sin maceración prefermentativa ↑ Intensidad de Color con M. pulcherrima con maceración prefermentativa + Sc + Sc + Sc + Sc 14 12 10 8 6 15 10 5 0 UnidadesAbs UnidadesAbs  15 %
  35. 35. 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12 IC ab a b b b b Con maceración prefermentativa 0 0,05 0,1 0,15 Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25 IC ab ab a a b b Resultados en laboratorio Sin maceración prefermentativa + Sc + Sc + Sc + Sc 14 12 10 8 6 15 10 5 0 Pérdida de acción sin maceración prefermentativa UnidadesAbs UnidadesAbs  15 %
  36. 36. 0,65 0,7 0,75 0,8 Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12 IPT ab a ab b ab b 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12 Antocianos a a a a aa * Con maceración prefermentativa 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25 IPT ab ab ab a c bc 0,3 0,4 0,5 0,6 Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25 Antocianos a bc bcd d cab Resultados en laboratorio Sin maceración prefermentativa ↑ del contenido en polifenoles en presencia de M. pulcherrima + Sc + Sc + Sc + Sc + Sc + Sc + Sc + Sc 50 45 40 35 30 60 50 40 30 100 80 60 40 20 0 80 75 70 65 UnidadesAbs UnidadesAbs UnidadesAbs UnidadesAbs  14 %  10 %
  37. 37. 0 50 100 150 Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12 Filtrabilidad c bc a d bb 0 20 40 60 Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12 Turbidez b c a cd cdd Con maceración prefermentativa 0 50 100 150 200 Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25 Filtrabilidad bc bc a c db 0 10 20 30 40 50 Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25 Turbidez c c b c ca Resultados en laboratorio Sin maceración prefermentativa ↓ Turbidez y tiempo de retención de los vinos con no-Saccharomyces + Sc + Sc + Sc + Sc + Sc + Sc + Sc + Sc Seg/mL Seg/mL NTU NTU  57 %  34 %
  38. 38. Ensayos industriales 700 Kg de uva Tempranillo 7 ensayos: Mp+Sc1 Mp+Sc2 Mp+Sc3 Mp Sc1 Sc2 Sc3 Intensidad de Color La actividad pectinolítica de M. pulcherrima incide sobre parámetros como IC, IPT o la Turbidez de los vinos
  39. 39. Ensayos industriales 700 Kg de uva Tempranillo 7 ensayos: Mp+Sc1 Mp+Sc2 Mp+Sc3 Mp Sc1 Sc2 Sc3 Intensidad de ColorÍndice de Polifenoles Totales La actividad pectinolítica de M. pulcherrima incide sobre parámetros como IC, IPT o la Turbidez de los vinos
  40. 40. Ensayos industriales 700 Kg de uva Tempranillo 7 ensayos: Mp+Sc1 Mp+Sc2 Mp+Sc3 Mp Sc1 Sc2 Sc3 Intensidad de ColorÍndice de Polifenoles Totales La actividad pectinolítica de M. pulcherrima incide sobre parámetros como IC, IPT o la Turbidez de los vinos
  41. 41. Conclusiones • La implantación en el mercado de cepas de levaduras no- Saccharomyces requiere un conocimiento exhaustivo sobre su metabolismo y repuesta en bodega. • El uso de levaduras no-Saccharomyces ha de realizarse de forma racional con objetivos concretos de mejora de la calidad sensorial de los vinos en base a sus propiedades metabólicas. • En un entorno de alta especialización tecnológica, el desarrollo de nuevos productos y procesos en enología requiere, cada vez mas, de una interacción dinámica entre la industria y los centros de investigación.
  42. 42. Moltes Gràcies Equipo investigador: Antonio Santos Eva Navascués Ignacio Belda Domingo Marquina Javier Ruiz Alejandro Alonso

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