Resumen de tecnicas moleculares empleadas en la actualidad

1. ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE
CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE CIENCIAS QUÍMICAS
BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL
por
ELIANA SÁNCHEZ MOREANO
(2385)

2. DOCENTE: Ing. PAOLA CHILUIZA
ABRIL- AGOSTO 2015
TÉCNICAS MOLECULARES
Las técnicas moleculares desde la década de los 70 han sido empleadas como
herramientas para identificar distintos organismos, e incluso emparentarlos y así conocer
su línea evolutiva (mutaciones). En la actualidad, las técnicas moleculares han permitido
resolver un sinnúmero de incógnitas en el campo microbiológico y clínico, puesto que
han sido fundamentales en la detección de microorganismos de desarrollo tardío o difícil
en medios de cultivo, o aquellos que no sean detectables con pruebas tradicionales como
la serología. En tal virtud, el objetivo del presente trabajo es exponer las principales
técnicas moleculares que son aplicadas a nivel global.
Las Técnicas Moleculares pueden ser definidas como un conjunto de procedimientos o
metodologías cuya finalidad es detectar el material genético (ADN y ARN) y
caracterizarlo (mutaciones, translocaciones, etc.).
En términos generales, las ventajas y desventajas que se derivan de este tipo de técnicas
propias de biología molecular son:
Desventajas:
1) Falta de estandarización
(protocolos).
2) Costosos
Ventajas:
1) Alta sensibilidad.
2) Específicos
3) Rapidez.

3.  REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
PCR es una reacción de amplificación del ADN; para este método se emplea la enzima
ADN polimerasa, la cual sintetiza el ADN de forma natural.
ELEMENTOS IMPORTANTES:
1) Sustrato: En base al sustrato que usemos en la PCR se distingue:
 PCR: El sustrato es el ADN genómico.
 RT-PCR: El sustrato es ADN complementario (ADNC) originado a partir del
ARNm (Transcripción inversa: Retrovirus)
2) Templado o molde: Generalmente ADN o ADNC
3) Enzima: ADN polimerasa (extraída de un microorganismo termófilo: Thermus
aquaticus).
4) Primers: Secuencias de oligonucleótidos.
5) Desoxirribonucleótidos tri-fosfatados.
6) Otros: Cofactor enzimático como es el Mg2+ (0,5 a 2,5 mM), solución buffer y agua.
ETAPAS DEL PROCESO:
Repetición
de 30 a 35
ciclos de 3
pasos:

4. a) Desnaturalización: Se calienta el ADN y las cadenas se separan (a 95°C durante
aproximadamente 20 a 30 s). A mayor contenido de C-G en el templado mayor tiempo
para romper los enlaces (C-G: 3 enlaces covalentes mientras A-T: 2).
b) Hibridación: Alineación de los primers y posterior formación del complejo:
templado- primers (Temperatura: 50-60 °C).
c) Extensión:Actúa la ADN polimerasa en el complejo templado-primers (Temperatura
óptima para la actividad enzimática: 72 °C). (TAMAY DE DIOS et al, 2013)
VARIANTES:
Las variantes de este método son:

5.  TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
Touchdown PCR: Disminución
gradual de la temperatura en cada
ciclo.
Hot start PCR:
PCR que se lleva a cabo a altas
temperaturas, para evitar
amplificar productos no deseados.
ADN polimerasa se activa a
dichas temperaturas.
Colony PCR:
PCR de colonias bacterianas, con el
objetivo de identificar colonias que
contengan la secuencia de
nucleótidos de interés.
Nested PCR:
PCR que comprende dos rondas
de amplificación con distintos
pares de primers en cada una. Alta
sensibilidad de detección.
Multiplex PCR:
Incluye más de dos primers en la
misma reacción o proceso.
PCR inverso:
Reacción que amplifica las
regiones flanquedas de un
fragmento de ADN, del cual se
conoce su secuencia interna
RT-PCR:
Emplea fragmentos pequeños de
ARN para obtener ADNc
PCR en tiempo real:
Combina dos métodos: PCR
tradicional y las sondas
fluorescentes (identificación)
AFLP:
Detecta polimorfismos debido a
modificaciones en la secuencia de
ADN que comprende los sitios de
corte de las enzimas de restricción.
PCR asimétrica:
PCR que amplifica de manera
preferencial a una de las cadenas
del ADN .

6. Mediante las técnicas de hibridación se sintetizan ácidos nucleicos bicatenarios a partir
de cadenas individuales mediante la complementariedad de sus bases nitrogenadas.
Consecuentemente, permite identificar el grado de relación existente entre los diferentes
tipos de ácidos nucleicos. (FERNÁNDEZ, s.f.)
SONDA DE HIBRIDACIÓN:
Fragmento de ácido nucleico de longitud variable que se utiliza para analizar las bases
complementarias de otra cadena de ácido nucleico.
TIPOS DE SONDAS: ADN, ARN y nucleótidos.
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN:
TÉCNICA DE
HIBRIDACIÓN
DESCRIPCIÓN
POR FILTRACIÓN
1) Se desnaturaliza el ADN o ARN.
2) Se lo inmoviliza en una superficie
inerte: nitrocelulosa.
3) Hibridación con una sonda marcada
(detección)
VARIANTES
 SOUTHERN BLOT: Se transfiere el
ADN del gel sacarosa a una superficie
de nitrocelulosa y se lo hibrida con
sondas radioactivas o coloridas.
 NORTHERN BLOT: Transfiere ARN
del gel de sacarosa a un medio inerte
adecuado para la hibridación.
 DOT BLOTTING: Transferencia del
ADN al filtro de manera eficiente
debido a que emplea adaptadores.
IN SITU (HIS) 1) Se desnaturaliza el ADN a 95°C.

7. 2) Se añade una solución que contiene la
sonda con el ADN o ARN marcado
3) Hibridación.
IN SITU CON
FLUORESCENCIA (FISH)
Procedimiento similar al anterior, pero emplea
sondas específicas para cromosomas o una
secuencia de ellos.
GENÓMICA COMPARATIVA
(CGH)
Detecta las amplificaciones o pérdidas de un
fragmento de ADN, mediante las
comparaciones de dos muestras de ADN
genómico (tumoral y normal).
GENE ARRAYS
Es otra variante de la hibridación con sondas.
Su objetivo es analizar el genoma completo de
un organismo (secuencia de genes,
mutaciones).
Se emplean membranas de blotting o placas de
micro titulación

8.  TÉCNICA DEL ADN RECOMBINANTE: Clonación
Es una técnica que consiste en separar o
aislar una secuencia de ADN, para
posteriormente introducirla en un
plásmido. Para aislar la secuencia o gen
de interés se emplean enzimas de
restricción que cortan la cadena de ADN
por los grupos fosfato sin dañar las bases.
ETAPAS:
 SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Es una técnica que permite conocer la secuencia exacta de nucleótidos de una muestra de
ácido nucleico.
FRAGMENTACIÓN:Seaisla el fragmento de
interés mediante una enzima de restricción.
LIGACIÓN:Mediante la enzima ligasa, uniral ADN
de interés al vector(plásmido o ADN circular)
TRANSFERENCIA:Unavezque se haya unido el
vectoral gen de interés, se los introduce en la
célula (clonación).
SELECCIÓN: Escogemos las células que hayan
manifestado el gen de interés

9. La secuenciación se puede dar de dos formas:
 Directa: Se secuencia el producto de la PCR.
 Indirecta: Se secuencia el producto de una clonación.
Para realizar una secuenciación se requiere de: una plantilla para copiar, un primer, ADN
polimerasa.
MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN:
En conclusión, las técnicas moleculares tienen un gran alcance en el análisis de
biomoléculas importantes como son los ácidos nucleicos, no obstante esa tecnología es
costosa y al no ser difundida ampliamente tiene una escasa estandarización. Las técnicas
moleculares poseen una alta sensibilidad y especificidad, y nos ayudan en la solución de
problemas asociados a organismos, ya que en base a su información genética podemos
entender su evolución (mutaciones), desarrollo y metabolismo, y aprovechar las
sustancias o metabolitos que producen o inhibir los tóxicos (silenciar un gen).
MÉTODO ENZIMÁTICO O DE SANGER
* Se separa la muestra en 4 alícuotas.
* Consiste en emplea ADN polimerasa
para sintetizar cadenas de ADN con una
terminación específica.
* Se realizan 4 reacciones de naturaleza
enzimática: con menos contaminantes.
Se realizan en pocos días
(FERNÁNDEZ, sf)
MÉTODO QUÍMICO
* La muestra de ADN se fragmenta por
medio de 4 reacciones: Corte de
purinas, adeninas, pirimidinas y
citosinas.
* Permite distinguir los nucleótidos en
cada corte y deducir la secuencia.
(NECOCHEA y CANUL, 2004)
PIROSECUENCIACIÓN
*Enzimas adicionales: ATP- sulfurilasa, luciferasa y apirasa
* Sustratos adicionales: adenosin-fosfosulfato (APS) y luciferina
* Mediante el empleo de estas enzimas vamos a tener reacciones
que generan señales luminosas y hace el proceso más rápido y
barato (ahorramos en marcas luminosas).
(SANTAMARÍA, s.f.)

10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Páginas web:
FERNÁNDEZ, P. Hibridación de los ácidos nucleicos. Fundamento teórico. Barcelona.
http://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-
bcfb-d75fd6b2ee9f
LLEONART, M et al. Técnicas de hibridación, clonación y secuenciación de ácidos
nucleicos en el diagnóstico anatomopatológico. Madrid.
http://www.conganat.org/seap/revista/v30-n3/13.pdf
NECOCHEA, R. y CANUL, J. (2004). Secuenciación de ácidos nucleicos.
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf
PALOMINO, C y GONZALEZ, Y. Técnicas moleculares para la detección e
identificación de patógenos en alimentos: ventajas y limitaciones.
http://www.scielosp.org/pdf/rpmesp/v31n3/a20v31n3.pdf
PROUST, P. Clonación, ya nadie es único.
http://www.eiq.cl/pproust/ciencia/clonacion.pdf
SALAZAR, L. (2004). Técnicas de biología molecular.
SANTAMARÍA, R. Secuenciación.
http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/temas/8_Secuenciaci%C3%B3n.
pdf
STRAMBOULIAN. Técnicas Moleculares de microbiología en la práctica.
http://www.stamboulian.com.ar/pdf/tecnicas_moleculares.pdf

11. TAMAY DE DIOS, L et al. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf
Técnicas moleculares de detección de patógenos y de sus factores de virulencia.
http://cvb.ehu.es/open_course_ware/castellano/salud/tecnicasmol/tema-9-
tecnicas-moleculares-de-deteccion-de-patogenos-y-sus-genes-de-virulencia.pdf
Variantes PCR. http://www.espanol.pcrlinks.com/barra/variantes.htm