Contreras & Cueto. - Historia del Perú contemporáneo [ocr] [2007].pdf
Presentacion 8
1. UNIVERSIDAD DE LAS AMERICAS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
PRÁCTICA Nro. 8
Fecha: 27 de noviembre del 2015.
Paralelo: MED 403
Tema: Identificación de Bacilos
Gram negativos (Enterobacterias).
2. Objetivos
• Objetivo General:
- Identificar y diferenciar enterobacterias.
• Objetivos Específicos:
- Reconocer las características metabólicas, actividad enzimática y
liberación de productos de desecho en diferentes medios de cultivo.
- Comprender la utilidad de los medios de cultivo diferenciales en la
identificación de bacterias.
- Leer e interpretar los cambios de coloración, turbidez y reacciones
producidas en cada prueba bioquímica.
- Usar tiras de Microgen para identificación de enterobacterias.
3. Reacciones bioquímicas para
identificación de bacilos gram negativos.
• La mayor parte de las bacterias modifican el medio
ambiente que las rodea al captar sustancias para su
crecimiento y al liberar productos metabólicos como
enzimas, exotoxinas, productos de desecho, etc.
• Las bacterias pueden oxidar diferentes compuestos para
obtener energía. Compuestos orgánicos como:
polisacáridos, hexosas, pentosas,tetrosas, polialcoholes,
ácidos orgánicos, aminoácidos, purinas, pirimidinas
• Cuando hay una oxidación completa de un compuesto
orgánico se llama respiración. Cuando hay una oxidación
incompleta de un compuesto orgánico hay fermentación.
Microbiología Basada en la Experimentación. Gamazo, C., Sánchez, S. y Camacho, A. (2013)
4. Respiración.
• Es la oxidación completa de un compuesto químico orgánico. Cuando hay
reacciones completas en aerobiosis se obtiene el rendimiento energético más
alto (mayor ATP).
• Cada átomo de carbono reducido de un compuesto, es oxidado a CO2, por
ejemplo en la glucólisis, la glucosa es oxidada hasta ácido pirúvico para entrar
en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos para su oxidación completa.
• Luego de la cadena de transporte de electrones, el último aceptor de electrones
es una molécula inorgánica y dependiendo cual es la molécula, la respiración
puede ser:
• Aerobia: cuando es el O2 que se reduce luego a H2O.
• Anaerobia: cuando el aceptor es una molécula diferente del oxígeno como
nitratos que produce nitritos, sulfatos que se reduce a ácido sulfhídrico, CO2
que produce metano
Microbiología Basada en la Experimentación. Gamazo, C., Sánchez, S. y Camacho, A. (2013)
5. Fermentación.
• Consiste en la oxidación parcial de un compuesto orgánico. No
todos los átomos de carbono de dicho compuesto son oxidados,
dando como resultado un producto intermedio como el pirúvico
que resulta de la glucólisis. Dependiendo de la enzima de la que
disponga la bacteria reducirá el pirúvico a diferentes compuestos.
Si la bacteria lo reduce a láctico, habrá fermentación láctica, si
reducen a etanol, habrá fermentación alcohólica.
• En este caso dependiendo del aceptor orgánico final de
electrones puede reducir el pirúvico a: propiónico, láctico, etanol,
butírico, glicerol, butanol, butanodiol, mezcla de ácidos, etc. Se
trata de productos de desecho que la bacteria debe excretar.
Microbiología Basada en la Experimentación. Gamazo, C., Sánchez, S. y Camacho, A. (2013)
8. Prueba de la oxidasa
• Fundamento: Detecta la presencia de citocromo en la bacteria. Los citocromos
(proteínas de la cadena de transporte de electrones), son hemoproteínas que
contienen hierro y actúan como ultimo proceso de la cadena respiratoria, transfiere
electrones hidrógeno al oxígeno, con la formación de agua. El sistema citocromo se
encuentra en microorganismos aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.
• Procedimiento:
• Interpretación: azul positivo, rosado negativo.
Colocar en
portaobjetos
fragmento de
tira oxidasa
Colocar la
colonia
sobre el
papel de
oxidasa
Con un asa
o mejor
palillo de
madera
tomar una
colonia
Observar si
hay cambio
de color a
azul.
http://dianayjulian.galeon.com/bioquimicas.htm
11. SIM
La prueba de indol se emplea para detectar
la presencia de la enzima triptofanasa en
bacterias, que degrada el aminoácido
triptófano a indol.
Es un medio semisólido destinado a
verificar la movilidad, producción de
indol y de sulfuro de hidrógeno en un
mismo tubo.
Es útil para diferenciar
miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Al añadir al medio SIM el
reactivo de Kovacks o de
Erlich que contiene p-
dimetilaminobenzaldehído,
reacciona tanto con el indol
12. Prueba de INDOL:
• Fundamento:El indol, es uno de los productos de la degradación metabólicas del
amino acido triptofano. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa son
capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de Indol, acido
piruvico y amoniaco. La prueba del indo esta basada en la formación de un complejo
rojo cuando el Indol reacciona con el grupo aldehído p-dimetilaminobenzaldehido.
Este es el principio activo del reactivo de Kovacs. MEDIO DE CULTIVO: agar SIM o
caldo triptofano
• Procedimiento: Inocular al medio realizando siembra por picadura hasta la mitad
del medio a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37
grados C. al finalizar este periodo añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared
del tubo.
• Interpretación: El desarrollo de un color rojo-fucsia en la interfase del reactivo y de
los medio segundos después añadir el reactivo de Kovacs indica la presencia de
indol y por lo tanto una prueba positiva.
14. Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá
de la línea de siembra.
Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de
siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra
o en todo el medio
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el
reactivo de Kovac´s o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
16. Prueba Citrato
Determinar que una bacteria es
capaz de utilizar citrato como
única fuente de Carbono
Y compuestos amoniales como única fuente
de Nitrógeno.
Se cultiva en agar Citrato
de simmons. Que
contiene Citrato de Sodio
y Azul de timol como
indicador.
19. ROJO DE METILO – VOGES PROSKAUER:
• Fundamento: El acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la fermentación
de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto numero de vías metabólicas.
Una de ellas da como resultado la producción de acetoína (acetil-metil-carbinol) un
producto final de reacción neutra. En presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es
convertida en diacetilo y el α naftol sirve como catalizador para producir un complejo de
color rojo.
• Procedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos pruebas (2ml), se
hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a incubar a 35ºC durante como mínimo
24-72hs..
• Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la de VP.
• Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la superficie del medio
aparece un color rojo intenso es RM (+) = microorganismos que utilizan la glucosa
fermentándola hasta llegar a un pH menor a 4,4.
• VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los
reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude suavemente y luego se deja
quieto de 10 a 15 min. La aparición de color rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-
carbinol).
21. Rojo de Metilo
Sembrar en
medio MRVP
Incubar a 35
grados por
24-48 horas
Añadir 5 a 6
gotas de rojo de
metilo
Observar
resultados
inmediatamente
Positivo: Rojo
brillante a pH 4,0
Negativo: Amarillo o
colores intermedios
Enterobacterias (anaerobios facultativos), utilizarán la glucosa en 2 fases:
1. Metabolismo aeróbico (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio
2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales
obtenidos:
2.1 fermentación ácido-mixta: productos finales son etanol y ácidos orgánicos (fórmico, acético, láctico y
succínico que son detectados añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH 4.0).
2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol,
produciéndose acetoína como intermediario. Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína
puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarán con este compuesto produciendo
rojo característico.
22. TDA (detección de enzima
triptofano desaminasa)
• Producción de ácido indolpirúvico por la enzima
triptófano desaminasa utilizando como sustrato
triptófano dando un color rojo cereza cuando se
añaden iones férricos. Negativo: color pajizo.
Colonia pura
diluida en 3ml.
de solución
salina
Incubar a
35-37
grados por
18-24 horas
Con pipeta
Pasteur añadir
3 a 4 gotas de
colonia en el
pocillo 12
Añadir 1gota de
reactivo TDA y
leer el resultado
luego de 60
segundos
Positivo: Rojo
cereza
Negativo: Pajizo
23. Microgen
Sistema de identificación
de bacilos gram
negativos:
enterobacterias y un
extenso rango de bacilos
oxidasa positivos.
Realizando varias
pruebas bioquímicas
simultáneamente.
24. Método Microgen
Colonia pura
diluir en 3ml. de
solución salina
En los pocillos 1,2 y 3
colocar 3-4 gotas de
aceite mineral, cubrir
con la tira adhesiva
Con pipeta
Pasteur añadir
3 a 4 gotas de
colonia en cada
pocillo
Procedimiento de Inoculación en tiras GN A
Procedimiento de Lectura y Adición de Reactivos
Verificando la
cartilla de
color registrar
los resultados
positivos
En el pocillo 7
añadir 1 gota de
NitratoA y 1 gota
de Nitrato B, luego
de 60 seg. leer y
anotar. Completar
todos los
resultados.
En el pocillo
8 añadir 2
gotas de
reactivo de
Kovac, leer
y anotar
Verificar que la
cepa es
oxidasa
negativa.
Incubar a
35-37
grados por
18-24 horas
En el pocillo 10
añadir 1 gota
de VP I y 1
gota de VP II,
luego de 15
min. leer y
anotar
En el pocillo
12 añadir 1
gota de
reactivo TDA
y leer el
resultado
luego de 60
seg.
25. Interpretación de resultados Microgen
• Sumar las reacciones positivas de cada triplete que dará
lugar a un solo dígito.
• Con el número de cada triplete conformamos un código
con el que se identifica la bacteria usando un software o
en tablas pre-establecidas.
26.
27. Prueba TSI ( tres azúcares -hierro)
Es una prueba usada para evidenciar
varias características enzimáticas de las
bacterias como: la fermentación de la
glucosa, lactosa y sacarosa y la
producción de H2S por parte de la
bacteria sumándole producción de gas
El medio contiene Glucosa 0.1%,
Lactosa 1%, Sacarosa 1 y peptonas. El
indicador es el rojo de fenol.
28. Prueba TSI ( tres azúcares -hierro)
tomar la
colonia
Se realizar
punción y luego
se estría
29.
30. • Se debe considerar los
cambio de color en el
pico y en el fondo del
tubo.
31.
32. FENILALANINA
Es un medio para la diferenciación de bacilos
entéricos sobre la base de su capacidad para
producir ácido fenilpirúvico por desaminación
oxidativa.
Este medio se diseñó para diferenciar los
miembros de Proteeae de otros miembros de
Enterobacteriaceae por la capacidad de los
organismos de los géneros de Proteeae para la
desaminación de la fenilalanina en ácido
fenilpirúvico mediante actividad enzimática
35. UREA:
• Fundamento: Sirve para poner de
manifiesto aquellos microorganismo que
poseen la enzima ureasa.
• Procedimiento: El medio fraccionado en
pico de flauta contiene urea y rojo de fenol
como indicador, el color original del medio
es amarillo (o sea ácido) La siembra se
realiza con ansa de punta tanto en
profundidad como en la superficie. Se deja
incubar 24 hs a 35º C.
• Interpretación: Si el microorganismo es
productor de ureasa, desdobla la urea
produciendo amoníaco, consecuentemente
produce alcalinidad que se manifiesta
porque el medio toma un color fucsia.
36. MALONATO:
• Fundamento: El malonato de sodio, es una sal
orgánica que es utilizada por las bacterias como
única fuente de carbono Si un microorganismo
es capaz de utilizar el malonato de sodio como
única fuente de carbono, al mismo tiempo que
utilizar el sulfato de amonio como fuente de
nitrógeno, se produce un aumento de la
alcalinidad que se debe a la formación de
Hidróxido de sodio (NaOH).
• Procedimiento: inocular 1-2 asadas del
microorganismo en el Caldo Malonato, incubar
a 37º C por 24 horas.
• Interpretación:
Ensayo positivo: reacción alcalina (azul).
Ensayo negativo: no hay cambio
de color (verde).
Ensayo negativo: reacción ácida,
sólo fermentación de glucosa
(amarillo).
37. comprende cuatro géneros (Klebsiella, Enterobacter, Hafnia y Serratia).
Genero : Klebsiella
• Recibió ese nombre en honor a Edwin Klebs, microbiólogo alemán de
fines del siglo XIX.
• Klebsiella esta compuesta por especies que forman tres grupos
fileticos:
Klebsiella
38. Grupo I
Grupo II
Grupo III
• K. pneumoniae subespecies
pneumoniae, rhinoscleromatis y
ozaenae.
• K.granulomatis
• K. ornithinolytica
• K. planticola
• K. trevisanii
• K. terrígena.
• (este grupo es transferido al nuevo
genero Raoultella en honor al
bacteriólogo frances Didier Raoult).
• K. oxytoca
Las especies de Klebsiella y Raoultella están
ampliamente distribuidas en la naturaleza y en el
tubo digestivo.
39. Cuando se recuperan colonias
grandes con una consistencia
mucoide en las placas de
aislamiento se debe de
sospechar que es una especie
de Klebsiella.
En agar MacConkey, las
colonias se presentan
grandes, mucoides y rojas, y
el pigmento rojo suele
difundirse en el agar lo que
indica fermentación de
lactosa.
40. • Las especies de aislamiento clínico
frecuente son Klebsiella pneumoniae
subespecie pneumoniae y K. oxytoca.
Klebsiella pneumoniae subespecie
pneumoniae
Gram negativo
Anaerobio facultativo
Encapsulado
Inmóvil
Fermentación de lactosa
Se encuentra en la flora
normal de la boca, la piel y los
intestinos.
41. • Puede causar la neumonía
enfermedad que causa cambios
destructivos a la inflamación y la
hemorragia pulmonar humano
con la muerte celular (necrosis)
que a veces produce, esputo con
sangre, mucosa (esputo jalea de
grosella).
42. • Al igual que con muchas bacterias, el tratamiento
recomendado ha cambiado ya que el organismo ha
desarrollado resistencias. A menudo son resistentes a
múltiples antibióticos. La evidencia actual implica un plásmido
como la fuente de los genes de resistencia.
• Resistente a ampicilina, carbenicilina y ticarcilina.
• Debido ala producción de enzimas beta-lactamasas hacen
que sean resistentes a los agentes beta-lactamicos, incluidas
las cefalosporinas de tercera generación.
• Sensible a amoxicilina-clavulánico y fluorquinolona
44. Pertenece a la familia Enterobacteriaceae.
Bacilo Gram negativo.
Anaerobio facultativo.
Móvil, no forma esporas.
Fermenta Glucosa y Lactosa.
Catalasa +, Oxidasa -
Habitan normalmente en el intestino grueso,
suelo, agua y materia en descomposición.
47. Morfología de la Colonia Bacteriana
• Color verde metálico
característico de E. coli
• Colonias
aisladas, medianas,
circulares, convexas,
moradas, contorno
verde-metálico,
bordes redondeados. http://trinitynews.ie/wp/wp-
content/uploads/2013/10/E-Coli.jpeg
48. Enterobacter cloacae
Normal en la
microbiota
intestinal, puede
vivir en suelo,
agua, alimentos,
aguas servidas.
Infecciones de tracto urinario y tracto
respiratorio, menos común en
infecciones intra-abdominales.
Infección de tejidos blandos, piel,
endocarditis, meningitis, artritisy
osteomielitis, en personas con sistema
inmune debilitado.
Bacilos gram negativos.
Anaerobios facultativos.
Catalasa positivos.
Mótiles.
Fermentadores de
glucosa con producción
de gas. Urea positiva
(alrededor del 65%).
Lactosa, sucrosa, manitol
y celobiosa positiva.
Voges-Proskauer positiva. citrato
de Simmons positiva. Arginina y
ornitina positiva.
Resistencia natural a: aminopenicilinas
(ampicilina) y a cefalosporinas de
primera generación (cefalexina,
cefazolina) porque produce una
cefalosporinasa cromosomica inducible
http://www.microbiologyinpictures.com/enterobacter%20cloacae.html
