Este estudio identificó una nueva proteína antigénica, THSD7A, involucrada en el 30% de los casos de nefropatía membranosa idiopática donde no se encuentran anticuerpos contra PLA2R1. Los investigadores encontraron anticuerpos circulantes contra THSD7A en muestras de suero de pacientes con nefropatía membranosa idiopática. Además, mediante análisis de biopsias renales, observaron una mayor expresión de THSD7A en los podocitos de estos pacientes. Estos hallaz
2. INTRODUCTION
Idiopathic membranous
nephropathy is an
autoimmune disease and
a common cause of the
nephrotic syndrome in
adults
The phospholipase A2 receptor
1 (PLA2R1) was discovered as
the major antigen involved in
the pathogenesis of adult
idiopathic membranous
nephropathy.
30% of the patients
with this disease have
no obvious secondary
cause of the disease
is thought that other
endogenous
glomerular antigens
may be involved in
these cases.
They analyzed serum samples
from patients with :
idiopathic membranous
nephropathy patients
other glomerular diseases
healthy controls
to identify circulating
antibodies against
glomerular antigens
other than PLA2R1
3. THROMBOSPONDIN
TYPE 1
• It is a protein that in humans is encoded by the THBS1 gene.
• This protein is an adhesive glycoprotein that mediates cell-to-cell and cell-
to-matrix interactions. It can bind to fibrinogen, fibronectin, laminin and type
V collagen
FUNCTIONS
• Natural inhibitor of neovascularization and tumorigenesis (apoptosis) in
healthy tissue.
• Positive and negative modulation of endothelial cell adhesion, motility, and
growth.
• Affecting neuronal migration in the rostral migratory stream.
• Interacts with numerous proteases involved in angiogenesis
• Inmune system regulation
5. Nephropathy
Damage or disease of a kidney
Nephrosis: is non-
inflammatory
nephropathy
Nephritis is inflammatory
kidney disease.
Bowel incontinence
Bladder incontinence
Coordination problems
Diarrhea
Dysphagia
Hypotension
Impotence
Nausea
Problems with balance
Tachycardia
Vomiting
6. IDIOPATHIC MEMBRANOUS
NEPHROPATHY
• Is one of the principal causes
of nephropathy. It is caused
by the thickening of part of the
glomerular basement
membrane which helps filter
the blood.
• The thicker glomerular
membrane does not work
normally. As a result, Large
amounts of protein are lost in
the urine.
• 70% of the times is associated
with PLA2R1, the other 30% is
still unknown .
8. IDIOPATHIC MEMBRANOUS
NEPHROPATHY
30% of the
patients with this
disease have no
obvious secondary
cause of the
disease
Scientist are
evaluating
circulating
antibodies against
glomerular
antigens
THBS1
Can be one of the
genes affected on
this disease
9. OBJECTIVE
Find circulating antibodies against glomerular antigens other than PLA2R1,
that can explain the other 30% of the patents that are still an unknown
process
10. Materiales y métodos:
pacientes
• Dx de IMN Biopsia renal.
Muestras de
suero
Nefropatía
membranosa
65
Otras enfermedades
glomerulares
76
Control
44
Anticuerpos
anti-PLA2R1
ELISA
Western blot
11. Materiales y métodos:
pacientes
• Muestras excluidas cuando:
<18 años
Edad, género o proteinuria no disponible
Proteinuria <1 g/dL
12. Materiales y métodos:
tejido renal
Extractodeproteína
glomerular
Riñones
nefrectomizados
Porción sana
Riñones de
donantes
Corteza
13. Materiales y métodos:
Western blot/inmunoblot
Detectar proteínas específicas en una
muestra determinada
Electroforesis en gel: se separan proteínas
según su tamaño
Se transfieren a una membrana de PVDF* o
nitrocelulosa para buscar la proteína de
interés con anticuerpos específicos contra
ella
14. Materiales y métodos:
Western blot/inmunoblot
• Para usarse como primer anticuerpo, el
suero fue diluido en proporción 1:100
• Para detectar la THSD7A, se usó un
anticuerpo policlonal del conejo en una
dilución 1:1000
16. Materiales y métodos:
Inmunoprecipitación
• Demuestra la existencia de anticuerpos
que provocan la precipitación de sus
antígenos cuando ambos están solución
Aísla una proteína de
interés en una solución
17. Materiales y métodos:
Inmunoprecipitación
Anticuerpos
unidos a sustrato
sólido*
Gránulos se
añaden a la
mezcla de
proteínas
Proteínas blanco
capturadas por
los gránulos
*Gránulos microscópicos superparamagnéticos o gránulos
microscópicos de agarosa (no magnético).
Método directo
19. Materiales y métodos:
Inmunoprecipitación
Extractos glomerulares se incubaron toda la
noche con las muestras de suero.
Se les añadió Matriz de afinidad IgG4 para
purificación y aislamiento de dicha Ig
Se recogieron los inmunoprecipitados
Examinar la presencia de la proteína THSD7A
usando los anticuerpos anti-THSD7A
20. Materiales y métodos:
Espectrometría de masas
Bandas
visibles del
WB.
Corte
Digestión con
tripsina
Péptidos digeridos
identificados con
espectrometría de
masas
• Permite
elucidar
estructura y
propiedade
s químicas
de una
molécula.
21. Materiales y métodos:
análisis histológico
• Inmunofluorescencia: visualizar la
distribución de una proteína o antígeno
específico en células o secciones de
tejido.
• Inmunohistoquímica: revela la existencia
de distintas proteínas en las muestras de
tejidos, permiten conocer el origen y la
función de diferentes células.
22. RESULTADOS
Se estudiaron muestras de Pacientes con NMI y muestras control para
analizar total de proteínas en extractos glomerulares humanos
Positivos para
anticuerpos
PLA2R1
Reaccionaron con
PLA2R1 nativo y
recombinante
Negativos para
anticuerpos
PLA2R1
Reaccionaron
para una proteína
de 250 KD
Muestras control
o con otras
enfermedades
glomerulares
No presentaron
ninguna
reacción similar
23. RESULTADOS
• En pacientes negativos para anticuerpos PLA2R1 se encontró un
antígeno de 250 KD presente en el glomérulo humano.
• Se encontró que es una proteína N-glicosilada y que se expresa
exclusivamente en la membrana celular, lo que ayuda a concluir que
es diferente al PLA2R1.
25. RESULTADOS
Se usaron dos
estrategias para
identificar el antígeno
Hidrolisis parcial de
proteínas
Electroforesis y
western blot
Se encontraron 3
bandas : 250, 225 y
200 KD
Se generó una lista de
posibles antígenos
Por:
Características
Localización
Expresión en riñón humano
26. RESULTADOS
• Tras todos los estudios realizados se detectó que la
proteína que se estaba buscando era la THSD7A
• También se vio que tanto la forma nativa como la
recombinante de la proteína mostraban la misma masa tras
la glicosilacion lo que se puede interpretar como una
pequeña diferencia en modificaciones post
transcripcionales.
• Todas las muestras presentaron inmunoprecipitación
28. RESULTADOS
Para determinar la Ig
predominante, se usaron
anticuerpos contra IgG1 hasta
IgG4
La predominante es
la IgG4
29. RESULTADOS
THSD7A nativo y recombinante desaparecieron tras el
proceso de reducción lo que sugiere que los
anticuerpos atacan en epitopos específicos
30. RESULTADOS
3 pacientes analizados
en western blot y
proteína en orina.
1. Proteínas altas al
diagnóstico.
2. Bajaron con inhibición
farmacológica
3. 4 meses después
subió nuevamente
con aumento de
anticuerpos.
4. Cambio de
tratamiento.
5. Baja proteínas y
anticuerpos.
1. Proteinuria
severa
2. Tratamiento
con
corticotropina
3. Baja
anticuerpos y
proteinuria
1. No recibió
inmunosupr
esores
2. Alta
proteinuria
constante
32. RESULTADOS
Las biopsias renales se analizaron con
inmunofluorescencias, se encontró que:
• THSD7A se relaciona con colágeno tipo IV y la
fibronectina.
• Se ubica principalmente en podocitos.
40. RESULTADOS
Al comparar características clínicas, no se encontraron
relevancias en
• Edad
• Proteinuria
• Albumina sérica
• creatinina
• Inmunosupresión
Si se encontraron cambios significativos en el género,
encontrando ms mujeres en el grupo positivo para THSD7A
(65% )
41. Discussion
Names What did they say? Agree Disagree
Debiec H,
Svobodova B, et
al.
“Staining of the biopsy specimen for
the presence of the antigen
(THSD7A or PLA2R1) may identify
a small additional percentage of
patients whose serum was sampled
after immunologic remission had
occurred.”
x
Ju W, Greene SC,
et al.
“This finding is consistent with
recent data showing that THSD7A
is more highly expressed in
podocytes than in glomerular
endothelial and mesangial cells.”
x
42. Discussion
Names What did they say? Agree Disagree
East L, Isacke CM “THSD7A was initially characterized
as an endothelial protein that is
expressed in the placental
vasculature. ”
x
Hoxha E, Debiec
H, et al.
“Furthermore, renal-biopsy samples from
patients who were positive for anti-
THSD7A antibodies had increased
staining for the antigen within immune
deposits, a phenomenon also seen in
patients who are positive for anti-PLA2R1
antibodies”
x
43. Personal conclussions
• I think is very important to know a new antigen for the
IMN, because it is a way to create effective treatments
for these people. This discovery is very interesting
because the authors are motivating us to investigate.
Now is clear that PLA2R1 and THSD7A are implicated in
IMN, but now the objective is to search which are the
others antigens implicated in this disease and why the
antibodies are expressing in some people but not in
others.
44. Personal conclussions
• Been able to investigate this kind of diseases
that don't have a known reason is a really
good thing, because lots of them can have a
better treatment if only the scientist and
doctors could understand what is really
happening, because some of this are not well
treat not because lack of possibilities but
because lack of knowledge.
PVDF fluoruro de polivinilideno: inmoviliza las proteinas por que es muy afin a ellas, más concretamente a los aminoácidos mediante enlaces hidrofóbicos
Albumina, creatinina, proteína urinaria, edad o tto inmunosupresivo