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CRISTINA BENJUMEA
NATALIA ZAPATA L.
INTRODUCTION
Idiopathic membranous
nephropathy is an
autoimmune disease and
a common cause of the
nephrotic syndrome in
adults
The phospholipase A2 receptor
1 (PLA2R1) was discovered as
the major antigen involved in
the pathogenesis of adult
idiopathic membranous
nephropathy.
30% of the patients
with this disease have
no obvious secondary
cause of the disease
is thought that other
endogenous
glomerular antigens
may be involved in
these cases.
They analyzed serum samples
from patients with :
idiopathic membranous
nephropathy patients
other glomerular diseases
healthy controls
to identify circulating
antibodies against
glomerular antigens
other than PLA2R1
THROMBOSPONDIN
TYPE 1
• It is a protein that in humans is encoded by the THBS1 gene.
• This protein is an adhesive glycoprotein that mediates cell-to-cell and cell-
to-matrix interactions. It can bind to fibrinogen, fibronectin, laminin and type
V collagen
FUNCTIONS
• Natural inhibitor of neovascularization and tumorigenesis (apoptosis) in
healthy tissue.
• Positive and negative modulation of endothelial cell adhesion, motility, and
growth.
• Affecting neuronal migration in the rostral migratory stream.
• Interacts with numerous proteases involved in angiogenesis
• Inmune system regulation
THROMBOSPONDIN
TYPE 1
Nephropathy
Damage or disease of a kidney
Nephrosis: is non-
inflammatory
nephropathy
Nephritis is inflammatory
kidney disease.
Bowel incontinence
Bladder incontinence
Coordination problems
Diarrhea
Dysphagia
Hypotension
Impotence
Nausea
Problems with balance
Tachycardia
Vomiting
IDIOPATHIC MEMBRANOUS
NEPHROPATHY
• Is one of the principal causes
of nephropathy. It is caused
by the thickening of part of the
glomerular basement
membrane which helps filter
the blood.
• The thicker glomerular
membrane does not work
normally. As a result, Large
amounts of protein are lost in
the urine.
• 70% of the times is associated
with PLA2R1, the other 30% is
still unknown .
IDIOPATHIC MEMBRANOUS
NEPHROPATHY
Symptoms :
• Edema
• Fatigue
• Poor appetite
• Urination, excessive at night
• Weight gain
IDIOPATHIC MEMBRANOUS
NEPHROPATHY
30% of the
patients with this
disease have no
obvious secondary
cause of the
disease
Scientist are
evaluating
circulating
antibodies against
glomerular
antigens
THBS1
Can be one of the
genes affected on
this disease
OBJECTIVE
Find circulating antibodies against glomerular antigens other than PLA2R1,
that can explain the other 30% of the patents that are still an unknown
process
Materiales y métodos:
pacientes
• Dx de IMN Biopsia renal.
Muestras de
suero
Nefropatía
membranosa
65
Otras enfermedades
glomerulares
76
Control
44
Anticuerpos
anti-PLA2R1
ELISA
Western blot
Materiales y métodos:
pacientes
• Muestras excluidas cuando:
 <18 años
Edad, género o proteinuria no disponible
Proteinuria <1 g/dL
Materiales y métodos:
tejido renal
Extractodeproteína
glomerular
Riñones
nefrectomizados
Porción sana
Riñones de
donantes
Corteza
Materiales y métodos:
Western blot/inmunoblot
Detectar proteínas específicas en una
muestra determinada
Electroforesis en gel: se separan proteínas
según su tamaño
Se transfieren a una membrana de PVDF* o
nitrocelulosa para buscar la proteína de
interés con anticuerpos específicos contra
ella
Materiales y métodos:
Western blot/inmunoblot
• Para usarse como primer anticuerpo, el
suero fue diluido en proporción 1:100
• Para detectar la THSD7A, se usó un
anticuerpo policlonal del conejo en una
dilución 1:1000
Materiales y métodos:
Western blot/inmunoblot
Materiales y métodos:
Inmunoprecipitación
• Demuestra la existencia de anticuerpos
que provocan la precipitación de sus
antígenos cuando ambos están solución
Aísla una proteína de
interés en una solución
Materiales y métodos:
Inmunoprecipitación
Anticuerpos
unidos a sustrato
sólido*
Gránulos se
añaden a la
mezcla de
proteínas
Proteínas blanco
capturadas por
los gránulos
*Gránulos microscópicos superparamagnéticos o gránulos
microscópicos de agarosa (no magnético).
Método directo
Materiales y métodos:
Inmunoprecipitación
Anticuerpos en
la mezcla de
proteínas
Se unen a su
objetivo
Perlas
recubiertas de
proteína A/G se
unen a la mezcla
Método indirecto
Materiales y métodos:
Inmunoprecipitación
Extractos glomerulares se incubaron toda la
noche con las muestras de suero.
Se les añadió Matriz de afinidad IgG4 para
purificación y aislamiento de dicha Ig
Se recogieron los inmunoprecipitados
Examinar la presencia de la proteína THSD7A
usando los anticuerpos anti-THSD7A
Materiales y métodos:
Espectrometría de masas
Bandas
visibles del
WB.
Corte
Digestión con
tripsina
Péptidos digeridos
identificados con
espectrometría de
masas
• Permite
elucidar
estructura y
propiedade
s químicas
de una
molécula.
Materiales y métodos:
análisis histológico
• Inmunofluorescencia: visualizar la
distribución de una proteína o antígeno
específico en células o secciones de
tejido.
• Inmunohistoquímica: revela la existencia
de distintas proteínas en las muestras de
tejidos, permiten conocer el origen y la
función de diferentes células.
RESULTADOS
Se estudiaron muestras de Pacientes con NMI y muestras control para
analizar total de proteínas en extractos glomerulares humanos
Positivos para
anticuerpos
PLA2R1
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recombinante
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PLA2R1
Reaccionaron
para una proteína
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o con otras
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glomerulares
No presentaron
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RESULTADOS
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RESULTADOS
RESULTADOS
Se usaron dos
estrategias para
identificar el antígeno
Hidrolisis parcial de
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Se encontraron 3
bandas : 250, 225 y
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Por:
Características
Localización
Expresión en riñón humano
RESULTADOS
• Tras todos los estudios realizados se detectó que la
proteína que se estaba buscando era la THSD7A
• También se vio que tanto la forma nativa como la
recombinante de la proteína mostraban la misma masa tras
la glicosilacion lo que se puede interpretar como una
pequeña diferencia en modificaciones post
transcripcionales.
• Todas las muestras presentaron inmunoprecipitación
RESULTADOS
RESULTADOS
Para determinar la Ig
predominante, se usaron
anticuerpos contra IgG1 hasta
IgG4
La predominante es
la IgG4
RESULTADOS
THSD7A nativo y recombinante desaparecieron tras el
proceso de reducción lo que sugiere que los
anticuerpos atacan en epitopos específicos
RESULTADOS
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en western blot y
proteína en orina.
1. Proteínas altas al
diagnóstico.
2. Bajaron con inhibición
farmacológica
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anticuerpos.
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severa
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corticotropina
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proteinuria
constante
RESULTADOS
RESULTADOS
Las biopsias renales se analizaron con
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• THSD7A se relaciona con colágeno tipo IV y la
fibronectina.
• Se ubica principalmente en podocitos.
RESULTADOS
RESULTADOS
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PLA2R1 se expresa menos que THSD7A
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RESULTADOS
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• Inmunosupresión
Si se encontraron cambios significativos en el género,
encontrando ms mujeres en el grupo positivo para THSD7A
(65% )
Discussion
Names What did they say? Agree Disagree
Debiec H,
Svobodova B, et
al.
“Staining of the biopsy specimen for
the presence of the antigen
(THSD7A or PLA2R1) may identify
a small additional percentage of
patients whose serum was sampled
after immunologic remission had
occurred.”
x
Ju W, Greene SC,
et al.
“This finding is consistent with
recent data showing that THSD7A
is more highly expressed in
podocytes than in glomerular
endothelial and mesangial cells.”
x
Discussion
Names What did they say? Agree Disagree
East L, Isacke CM “THSD7A was initially characterized
as an endothelial protein that is
expressed in the placental
vasculature. ”
x
Hoxha E, Debiec
H, et al.
“Furthermore, renal-biopsy samples from
patients who were positive for anti-
THSD7A antibodies had increased
staining for the antigen within immune
deposits, a phenomenon also seen in
patients who are positive for anti-PLA2R1
antibodies”
x
Personal conclussions
• I think is very important to know a new antigen for the
IMN, because it is a way to create effective treatments
for these people. This discovery is very interesting
because the authors are motivating us to investigate.
Now is clear that PLA2R1 and THSD7A are implicated in
IMN, but now the objective is to search which are the
others antigens implicated in this disease and why the
antibodies are expressing in some people but not in
others.
Personal conclussions
• Been able to investigate this kind of diseases
that don't have a known reason is a really
good thing, because lots of them can have a
better treatment if only the scientist and
doctors could understand what is really
happening, because some of this are not well
treat not because lack of possibilities but
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Por: Cristina Benjumea Zuluaga
Por: Natalia Zapata López

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Thrombospondin Type-1 Domain-Containing 7A in Idiopathic Membranous Nephropath

  • 2. INTRODUCTION Idiopathic membranous nephropathy is an autoimmune disease and a common cause of the nephrotic syndrome in adults The phospholipase A2 receptor 1 (PLA2R1) was discovered as the major antigen involved in the pathogenesis of adult idiopathic membranous nephropathy. 30% of the patients with this disease have no obvious secondary cause of the disease is thought that other endogenous glomerular antigens may be involved in these cases. They analyzed serum samples from patients with : idiopathic membranous nephropathy patients other glomerular diseases healthy controls to identify circulating antibodies against glomerular antigens other than PLA2R1
  • 3. THROMBOSPONDIN TYPE 1 • It is a protein that in humans is encoded by the THBS1 gene. • This protein is an adhesive glycoprotein that mediates cell-to-cell and cell- to-matrix interactions. It can bind to fibrinogen, fibronectin, laminin and type V collagen FUNCTIONS • Natural inhibitor of neovascularization and tumorigenesis (apoptosis) in healthy tissue. • Positive and negative modulation of endothelial cell adhesion, motility, and growth. • Affecting neuronal migration in the rostral migratory stream. • Interacts with numerous proteases involved in angiogenesis • Inmune system regulation
  • 5. Nephropathy Damage or disease of a kidney Nephrosis: is non- inflammatory nephropathy Nephritis is inflammatory kidney disease. Bowel incontinence Bladder incontinence Coordination problems Diarrhea Dysphagia Hypotension Impotence Nausea Problems with balance Tachycardia Vomiting
  • 6. IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY • Is one of the principal causes of nephropathy. It is caused by the thickening of part of the glomerular basement membrane which helps filter the blood. • The thicker glomerular membrane does not work normally. As a result, Large amounts of protein are lost in the urine. • 70% of the times is associated with PLA2R1, the other 30% is still unknown .
  • 7. IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY Symptoms : • Edema • Fatigue • Poor appetite • Urination, excessive at night • Weight gain
  • 8. IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY 30% of the patients with this disease have no obvious secondary cause of the disease Scientist are evaluating circulating antibodies against glomerular antigens THBS1 Can be one of the genes affected on this disease
  • 9. OBJECTIVE Find circulating antibodies against glomerular antigens other than PLA2R1, that can explain the other 30% of the patents that are still an unknown process
  • 10. Materiales y métodos: pacientes • Dx de IMN Biopsia renal. Muestras de suero Nefropatía membranosa 65 Otras enfermedades glomerulares 76 Control 44 Anticuerpos anti-PLA2R1 ELISA Western blot
  • 11. Materiales y métodos: pacientes • Muestras excluidas cuando:  <18 años Edad, género o proteinuria no disponible Proteinuria <1 g/dL
  • 12. Materiales y métodos: tejido renal Extractodeproteína glomerular Riñones nefrectomizados Porción sana Riñones de donantes Corteza
  • 13. Materiales y métodos: Western blot/inmunoblot Detectar proteínas específicas en una muestra determinada Electroforesis en gel: se separan proteínas según su tamaño Se transfieren a una membrana de PVDF* o nitrocelulosa para buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella
  • 14. Materiales y métodos: Western blot/inmunoblot • Para usarse como primer anticuerpo, el suero fue diluido en proporción 1:100 • Para detectar la THSD7A, se usó un anticuerpo policlonal del conejo en una dilución 1:1000
  • 16. Materiales y métodos: Inmunoprecipitación • Demuestra la existencia de anticuerpos que provocan la precipitación de sus antígenos cuando ambos están solución Aísla una proteína de interés en una solución
  • 17. Materiales y métodos: Inmunoprecipitación Anticuerpos unidos a sustrato sólido* Gránulos se añaden a la mezcla de proteínas Proteínas blanco capturadas por los gránulos *Gránulos microscópicos superparamagnéticos o gránulos microscópicos de agarosa (no magnético). Método directo
  • 18. Materiales y métodos: Inmunoprecipitación Anticuerpos en la mezcla de proteínas Se unen a su objetivo Perlas recubiertas de proteína A/G se unen a la mezcla Método indirecto
  • 19. Materiales y métodos: Inmunoprecipitación Extractos glomerulares se incubaron toda la noche con las muestras de suero. Se les añadió Matriz de afinidad IgG4 para purificación y aislamiento de dicha Ig Se recogieron los inmunoprecipitados Examinar la presencia de la proteína THSD7A usando los anticuerpos anti-THSD7A
  • 20. Materiales y métodos: Espectrometría de masas Bandas visibles del WB. Corte Digestión con tripsina Péptidos digeridos identificados con espectrometría de masas • Permite elucidar estructura y propiedade s químicas de una molécula.
  • 21. Materiales y métodos: análisis histológico • Inmunofluorescencia: visualizar la distribución de una proteína o antígeno específico en células o secciones de tejido. • Inmunohistoquímica: revela la existencia de distintas proteínas en las muestras de tejidos, permiten conocer el origen y la función de diferentes células.
  • 22. RESULTADOS Se estudiaron muestras de Pacientes con NMI y muestras control para analizar total de proteínas en extractos glomerulares humanos Positivos para anticuerpos PLA2R1 Reaccionaron con PLA2R1 nativo y recombinante Negativos para anticuerpos PLA2R1 Reaccionaron para una proteína de 250 KD Muestras control o con otras enfermedades glomerulares No presentaron ninguna reacción similar
  • 23. RESULTADOS • En pacientes negativos para anticuerpos PLA2R1 se encontró un antígeno de 250 KD presente en el glomérulo humano. • Se encontró que es una proteína N-glicosilada y que se expresa exclusivamente en la membrana celular, lo que ayuda a concluir que es diferente al PLA2R1.
  • 25. RESULTADOS Se usaron dos estrategias para identificar el antígeno Hidrolisis parcial de proteínas Electroforesis y western blot Se encontraron 3 bandas : 250, 225 y 200 KD Se generó una lista de posibles antígenos Por: Características Localización Expresión en riñón humano
  • 26. RESULTADOS • Tras todos los estudios realizados se detectó que la proteína que se estaba buscando era la THSD7A • También se vio que tanto la forma nativa como la recombinante de la proteína mostraban la misma masa tras la glicosilacion lo que se puede interpretar como una pequeña diferencia en modificaciones post transcripcionales. • Todas las muestras presentaron inmunoprecipitación
  • 28. RESULTADOS Para determinar la Ig predominante, se usaron anticuerpos contra IgG1 hasta IgG4 La predominante es la IgG4
  • 29. RESULTADOS THSD7A nativo y recombinante desaparecieron tras el proceso de reducción lo que sugiere que los anticuerpos atacan en epitopos específicos
  • 30. RESULTADOS 3 pacientes analizados en western blot y proteína en orina. 1. Proteínas altas al diagnóstico. 2. Bajaron con inhibición farmacológica 3. 4 meses después subió nuevamente con aumento de anticuerpos. 4. Cambio de tratamiento. 5. Baja proteínas y anticuerpos. 1. Proteinuria severa 2. Tratamiento con corticotropina 3. Baja anticuerpos y proteinuria 1. No recibió inmunosupr esores 2. Alta proteinuria constante
  • 32. RESULTADOS Las biopsias renales se analizaron con inmunofluorescencias, se encontró que: • THSD7A se relaciona con colágeno tipo IV y la fibronectina. • Se ubica principalmente en podocitos.
  • 36. RESULTADOS Alto contenido granular de THSD7A y PLA2R1 normal
  • 37. RESULTADOS Normal para THSD7A pero elevado para PLA2R1
  • 38. RESULTADOS Pacientes con NMI secundario, normal para ambos valores
  • 40. RESULTADOS Al comparar características clínicas, no se encontraron relevancias en • Edad • Proteinuria • Albumina sérica • creatinina • Inmunosupresión Si se encontraron cambios significativos en el género, encontrando ms mujeres en el grupo positivo para THSD7A (65% )
  • 41. Discussion Names What did they say? Agree Disagree Debiec H, Svobodova B, et al. “Staining of the biopsy specimen for the presence of the antigen (THSD7A or PLA2R1) may identify a small additional percentage of patients whose serum was sampled after immunologic remission had occurred.” x Ju W, Greene SC, et al. “This finding is consistent with recent data showing that THSD7A is more highly expressed in podocytes than in glomerular endothelial and mesangial cells.” x
  • 42. Discussion Names What did they say? Agree Disagree East L, Isacke CM “THSD7A was initially characterized as an endothelial protein that is expressed in the placental vasculature. ” x Hoxha E, Debiec H, et al. “Furthermore, renal-biopsy samples from patients who were positive for anti- THSD7A antibodies had increased staining for the antigen within immune deposits, a phenomenon also seen in patients who are positive for anti-PLA2R1 antibodies” x
  • 43. Personal conclussions • I think is very important to know a new antigen for the IMN, because it is a way to create effective treatments for these people. This discovery is very interesting because the authors are motivating us to investigate. Now is clear that PLA2R1 and THSD7A are implicated in IMN, but now the objective is to search which are the others antigens implicated in this disease and why the antibodies are expressing in some people but not in others.
  • 44. Personal conclussions • Been able to investigate this kind of diseases that don't have a known reason is a really good thing, because lots of them can have a better treatment if only the scientist and doctors could understand what is really happening, because some of this are not well treat not because lack of possibilities but because lack of knowledge.
  • 45. Mapa conceptual Por: Cristina Benjumea Zuluaga

Hinweis der Redaktion

  1. PVDF fluoruro de polivinilideno:  inmoviliza las proteinas por que es muy afin a ellas, más concretamente a los aminoácidos mediante enlaces hidrofóbicos
  2. Albumina, creatinina, proteína urinaria, edad o tto inmunosupresivo
  3. No tenían anticuerpos séricos!