Dokumen tersebut membahas tentang DNA dan proses replikasi DNA. DNA merupakan materi genetik yang menyimpan informasi genetik dan mereplikasi diri melalui proses replikasi DNA. Proses replikasi DNA meliputi inisiasi, sintesis primer, sintesis untai pengawal dan tertinggal, penghapusan primer, dan ligasi untuk membentuk DNA baru.
3. I.PENDAHULUAN
• Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida,
yaitu polimer linier yang tersusun dari monomer-
monomer nukleotida yang berikatan melalui
ikatan fosfodiester. Fungsi utama asam nukleat
adalah sebagai tempat penyimpanan dan
pemindahan informasi genetik. Informasi ini
diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui
proses replikasi. Sel memiliki dua jenis asam
nukleat yaitu asam deoksiribonukleat
(deoxyribonucleic acid/DNA) dan asam
ribonukleat (ribonucleic acid/RNA). (Marks
Dawn,et al., 2000).
4. Deoxyribonucleic Acid (DNA)
DNA merupakan materi yang membentuk
kromosom-kromosom dan juga merupakan
informasi genetik yang tersimpan dalam tubuh
makhluk hidup.
Instruksi-instruksi genetika ini berperan
penting dalam pertumbuhan, perkembangan,
dan fungsi organisme dan virus
DNA hanya dapat ditemukan di dalam nukleus
5.
6. Sejarah
DNA pertama kali berhasil dimurnikan
pada tahun 1868 oleh ilmuwan Swiss
Friedrich Miescher di Tubingen, Jerman,
yang menamainya nuclein berdasarkan
lokasinya di dalam inti sel. Namun
demikian, penelitian terhadap peranan
DNA di dalam sel baru dimulai pada awal
abad 20, bersamaan dengan ditemukannya
postulat genetika Mendel. DNA dan
protein dianggap dua molekul yang paling
memungkinkan sebagai pembawa sifat
genetis berdasarkan teori tersebut.
7. DNA Struktur
• Outside / Backbones
Made Of:
– Alternating
Phosphates and
Sugars
• Inside / Steps Made
of:
– Nitrogenous Bases
James Watson dan Francis
Crick memenangkan Nobel di
tahun 1962 mengenai model
penyatuan sturktur DNA.
Bersama dengan Rosalind
Franklin dan Maurice Wilkins,
mereka menyatakan bahwa
struktur DNA merupakan dua
untaian nukleotida yang disebut
dengan double helix, dimana
untaian tersebut tersusun secara
spiral dengan posisi gula dan
gugus fosfat terletak di sisi luar
dan basa-basa nitrogen saling
berpasangan di sisi dalam
(menyambung kedua untaian
tersebut).
8.
9. DNA Nukleotida
• Nukleotida merupakan monomer dari DNA.
• Structure:
– Phosphate
– Deoxyribose Sugar
– Nitrogenous Base
10. Basa Nitrogen
4 Types of Bases:
– A = Adenine
– T = Thymine
– G = Guanine
– C = Cytosine
14. Sebuah sistem fingerprint scanner memiliki dua pekerjaan,
yakni mengambil gambar sidik jari Anda, dan memutuskan
apakah pola alur sidik jari dari gambar yang diambil sama dengan
pola alur sidik jari yang ada di database. Ada beberapa cara
untuk mengambil gambar sidik jari seseorang, namun salah satu
metode yang paling banyak digunakan saat ini adalah optical
scanning.
Inti dari scanner optical adalah charge coupled device (CCD),
sistem sensor cahaya yang sama digunakan pada kamera digital
dan camcorder. CCD merupakan sebuah larik sederhana dari
diode peka cahaya yang disebut photosite, yang menghasilkan
sinyal elektrik yang merespon foton cahaya. Setiap photosite
merekam sebuah pixel, titik kecil yang merepresentasikan cahaya
dan membenturnya. Pixel-pixel ini membentuk pola terang dan
gelap dari sebuah gambar hasil scan sidik jari seseorang.
15.
16. • Tahap selanjutnya dalam pencocokan adalah memasukkan sampel DNA ke
mesin PCR. Langkah dasar penyusunan DNA fingerprint dengan PCR yaitu
dengan amplifikasi (pembesaran) sebuah set potongan DNA yang
urutannya belum diketahui. Prosedur ini dimulai dengan mencampur
sebuah primer amplifikasi dengan sampel genomik DNA. Satu nanogram
DNA sudah cukup untuk membuat suatu plate reaksi. Jumlah tersebut
didapat dari isolasi satu tetes darah kering, dari sel-sel yang melekat pada
pangkal rambut atau dari jaringan apa saja yang ditemukan di TKP.
Kemudian primer amplifikasi tersebut digunakan untuk menjiplak pada
sampel DNA yang mempunyai urutan basa yang cocok. Hasil akhirnya
berupa copy urutan DNA hasil amplifikasi dengan DNA sampel. Setelah itu,
copy tersebut akan di karakterisasi dengan elektroforesis untuk melihat
pola pita DNA nya. Karena setiap urutan DNA pada semua orang berbeda,
maka jumlah dan lokasi pita DNA setiap individu juga berbeda. Pola pita
inilah yang disebut dengan DNA fingerprint.
17.
18. Prinsip metode PCR (Poly chain
Reaction)
• PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA (PENGGANDAAN DNA )
secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu dari
keseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR melibatkan variasi
suhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase
yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Padaproses PCR, enzim
polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermusaquaticus (Taq)
yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90oC.
• Berikut adalah tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR
yaitu :
• Denaturasi
Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oC
yangmnyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA
tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru
yang akan dibuat.
19. • Penempelan (Annealing)
Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru
jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang
sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target
yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer
dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah
sekitar 550C selama 30-60 detik.
20. • Pemanjangan (Ektension)
• Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase
akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan
antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.
• Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang
baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan
dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan
proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara
eksponensial (Marks Dawn, et al., 2000).
21.
22. Komponen-Komponen untuk Reaksi PCR
• DNA cetakan / DNA target
Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen
DNA target. Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan
untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa
DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA
templat tersebut mengandung fragmen DNA
• Primer
Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb =
pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer
yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara
gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu : target
yang dituju.
1. Panjang primer : 15-30 pb
2. Kandungan GC sekitar 50%
3. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda
4. Urutan nukleotida yang sama harus dihindari
5. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin
23. • DNA Polimerase
Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan
enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil
mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati
titik didih air.
• Buffer / Dapar
Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang
mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. Reaksi PCR hanya akan
berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan
proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk
menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+,
ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor
yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase.
• dNTPS
dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida
bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan
pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target (Innis M. and Gelfand D. in
White Thomas, 1990).
24.
25. Replikasi DNA
❶ Inisiasi
Pelepasan untai DNA
• Sebuah enzim yang disebut helikase direkrut ke lokasi untuk unwinding
(proses penguraian/seperti membuka resleting) heliks dalam alur
tunggal.
• Helikase melepaskan ikatan hidrogen antara pasangan basa, dengan
cara yang tergantung energi. Titik ini atau wilayah DNA yang sekarang
dikenal sebagai garpu replikasi (Garpu replikasi atau cabang replikasi
adalah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi). Setelah heliks
yang terbuka, protein yang disebut untai tunggal mengikat protein (SSB)
mengikat daerah terbuka dan mencegah mereka untuk menempel
kembali. Proses replikasi sehingga dimulai, dan garpu replikasi
dilanjutkan dalam dua arah yang berlawanan sepanjang molekul DNA.
26. ❷ Sintesis Primer
• Sintesis DNA Primer
Sintesis baru, untai komplementer DNA menggunakan
untai yang ada sebagai template yang dibawa oleh enzim
yang dikenal sebagai DNA polimerase.
DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis DNA secara
independen, dan membutuhkan 3′ gugus hidroksil untuk
memulai penambahan nukleotida komplementer. Ini mensintesis
bentangan pendek RNA ke untai DNA yang ada. segmen pendek
disebut primer, dan terdiri dari 9-12 nukleotida.
Hal ini memberikan DNA polimerase platform yang diperlukan
untuk mulai menyalin sebuah untai DNA. Setelah primer
terbentuk pada kedua untai, DNA polimerase dapat
memperpanjang primer ini menjadi untai DNA baru.
27. ❸ Sintesis leading strand
DNA polimerase dapat menambahkan
nukleotida baru hanya untuk ujung 3′ dari untai
yang ada, dan karenanya dapat mensintesis DNA
dalam arah 5′ → 3′ saja. Tapi untai DNA berjalan
di arah yang berlawanan, dan karenanya sintesis
DNA pada satu untai dapat terjadi terus
menerus. Hal ini dikenal sebagai untaian
pengawal (leading strand).
28. ❹ Sintesis lagging Strand (untai tertinggal)
Pada untai berlawanan, DNA disintesis secara terputus dengan
menghasilkan serangkaian fragmen kecil dari DNA baru dalam arah 5
‘→ 3′. Fragmen ini disebut fragmen Okazaki, yang kemudian bergabung
untuk membentuk sebuah rantai terus menerus nukleotida. Untai ini
dikenal sebagai lagging Strand (untai tertinggal) sejak proses sintesis
DNA pada untai ini hasil pada tingkat yang lebih rendah.
❺ Penghapusan Primer
Meskipun untai DNA baru telah disintesis primer RNA hadir pada untai
baru terbentuk harus digantikan oleh DNA. Kegiatan ini dilakukan oleh
enzim DNA polimerase I (DNA pol I). Ini khusus menghilangkan primer
RNA melalui ‘5→ 3′ aktivitas eksonuklease nya, dan menggantikan
mereka dengan deoksiribonukleotida baru dengan 5 ‘→ 3′ aktivitas
polimerase DNA.
29. ❻ Ligasi
Setelah penghapusan primer selesai untai tertinggal masih
mengandung celah antara fragmen Okazaki berdekatan. Enzim
ligase mengidentifikasi dan menyumbat celah tersebut dengan
menciptakan ikatan fosfodiester antara 5 ‘fosfat dan 3′ gugus
hidroksil fragmen yang berdekatan.
❼ Terminasi (pemutusan)
Replikasi ini terhenti di lokasi terminasi khusus yang terdiri
dari urutan nukleotida yang unik. Urutan ini diidentifikasi oleh
protein khusus yang disebut tus yang mengikat ke situs tersebut,
sehingga secara fisik menghalangi jalur helikase. Ketika helikase
bertemu protein tus itu jatuh bersama dengan untai tunggal
protein pengikat terdekat.
30.
31. SINTESIS PROTEIN
• Dalam tahap-tahap sintesis protein akan dibahas bagaimana
DNA dan RNA melaksanakan proses dalam pewarisan sifat
kepada keturunannya dengan melakukan proses sintesis
protein, yaitu proses penyusunan senyawa protein dengan
membentuk rangkaian rantai polipeptida.
• Tahap-tahap sintesis protein ini terjadi di dalam ribosom dan
pengaturan sintesis protein dilakukan oleh gen (DNA) di
dalam inti. Gen, dalam hal ini DNA ketika menjalankan
fungsinya, yaitu menyusun protein sangat dipengaruhi oleh
susunan sel serta gen-gen lain dalam lingkungannya. Kegiatan
sel diatur oleh berbagai enzim, yaitu senyawa protein yang
bekerjanya sangat spesifik.
• Tahap-tahap sintesis protein terjadi melalui dua tahap, yakni
transkripsi dan translasi.
32.
33. Transkripsi
• Proses ini berlangsung di dalam inti sel. Transkripsi
merupakan proses sintesis langsung RNA dari DNA. Pada saat
inti sel memerintahkan perlunya sintesis protein, informasi
DNA dialihkan melalui RNA pembawa pesan yang disebut RNA
messenger (mRNA). mRNA berisikan salinan langsung
pasangan basa dari DNA. Tahap inilah yang dinamakan dengan
transkripsi.
34. • Tahap inisiasi transkripsi dimulai dengan pengenalan daerah
gen di DNA oleh enzim RNA polimerase. Daerah ini dinamakan
dengan promoter, yakni tempat dimulainya sintesis pasangan
DNA oleh mRNA.
• RNA polimerase akan membuka ikatan double helix pada
bagian gen yang dikenali dan kemudian akan menyalin urutan
basa yang ada pada DNA
• Proses transkripsi diakhiri jika gen di daerah rantai template
telah selesai dibaca (terdapat kodon stop). DNA memiliki
mekanisme agar RNA polimerase dapat mengenali akhir dari
gen dengan kode basa tertentu, daerah ini dikenal dengan
nama terminator. Proses akhir dari transkripsi ini dinamakan
dengan terminasi. Setelah itu, rantai mRNA akan keluar dari
DNA menuju ribosom di sitoplasma.
35. • 2. Translasi
• Tahap sintesis protein berikutnya adalah translasi. mRNA mengandung
urutan basa yang akan diterjemahkan menjadi protein (asam amino). Kode
genetik, yang dibawa di dalamnya (kodon) dibaca dalam urutan tiga basa
(triplet) menjadi protein. Proses penerjemahan kodon menjadi protein
atau yang disebut dengan translasi.
• Ribosom, sebagai tempat pembuatan protein terdiri atas dua bagian yang
disebut subunit kecil dan subunit besar. Secara garis besar, translasi dibagi
menjadi tiga tahap, yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi. Pada tahap
inisiasi, mRNA akan menempel pada subunit kecil ribosom. Subunit kecil
ini akan mengenali kode awal genetik AUG dari mRNA yang disebut
sebagai start kodon. Subunit besar ribosom kemudian akan bergabung
dengan subunit kecil membentuk kompleks ribosom.
• Proses penerjemahan ini dibantu oleh tRNA yang membawa pasangan
kodon dari mRNA. Pasangan basa tRNA di ribosom ini dinamakan sebagai
antikodon. tRNA akan datang membawakan pasangan basa yang sesuai
dengan kodon dari mRNA.
36. • Tahapan selanjutnya adalah elongasi dari pembacaan kodon
oleh tRNA sehingga terbentuk rantai polipeptida. Elongasi
akan berhenti pada tahap pembacaan urutan basa spesifik
yang memerintahkan proses translasi dihentikan (tahap
terminasi). Urutan ini biasanya terdiri atas UAA, UAG, dan
UGA yang dikenal dengan nama stop kodon.
37.
38. Mutasi DNA
Mutasi adalah suatu perubahan yang terjadi pada bahan
genetik yang menyebabkan perubahan ekspresinya. Perubahan
bahan genetik dapat terjadi pada tingkat pasangan basa,
tingkatsatu ruas DNA, bahkan pada tingkat kromosom. Peristiwa
terjadinya mutasi disebut mutagenesis. Sedangkan, individu yang
mengalami mutasi sehingga menghasilkan fenotip baru disebut
mutan. Faktor yang menyebabkan mutasi disebut mutagen.
39. Mutasi Gen (Mutasi Titik)
Mutasi gen atau mutasi titik adalah mutasi yang terjadi karena
perubahan pada satu pasang basa DNA suatu gen. Perubahan
DNA menyebabkan perubahan kodon-kodon RNAd, yang
akhirnya menyebabkan perubahan asam amino tertentu pada
protein yang dibentuk.
• Subtitusi pasangan basa
Subtitusi pasangan basa ialah pergantian satu pasang
nukleotida oleh pasangan nukleotida lainnya Subtitusi pasangan
basa ini kadang-kadang tidak menyebabkan perubahan protein,
karena adanya kodon sinonim (kodon yang terdiri atas tiga
urutan basa yang berbeda, tetapi menghasilkan asam amino
yang sama).
40. Misalnya, basa nitrogen pada DNA adalah CGC menjadi
CGA sehingga terjadi perubahan kodon pada RNA-d
dari GCG menjadi GCU. Sedangkan, asam amino yang
dipanggil sama, yaitu arginin.
Subtitusi pasangan basa ada dua macam, yaitu transisi
dan tranversi.
• *Transisi adalah penggantian satu basa purin oleh
basa purin yang lain, atau penggantian basa pirimidin
menjadi basa pirimidin yang lain.
• *Tranversi adalah penggantian basa purin oleh basa
pirimidin, atau basa pirimidin oleh basa
41.
42. • Penambahan atau pengurangan pasangan basa
Penambahan atau pengurangan basa pada DNA dapat
menyebabkan perubahan sederetan kodon RNA-d yang
terdapat di belakang titik perubahan tersebut, berarti
juga akan terjadi perubahan asam amino yang disandikan
melalui RNA-d tersebut. Akibat lain dari penambahan
atau pengurangan basa adalah terjadinya pergeseran
kodon akhir pada RNA-d. Pergeseran kodon akhir
menyebabkan rantai polipeptida mutan menjadi lebih
panjang atau lebih pendek. Mutasi ini disebut juga mutasi
ubah rangka karena menyebabkan perubahan ukuran
pada DNA maupun polipeptida.
Mutasi ubah rangka ini dapat dibedakan menjadi dua,
yaitu penambahan basa (adisi) dan pengurangan basa
(delesi).
47. STUDI MUTASI TITIK A3243G DNA MITOKONDRIA PENYEBAB
MATERNALLY INHERITED DIABETES AND DEAFNESS
• Mutasi pada posisi 3243 telah diteliti sebagai mutasi kausal pada diabetes turunan
maternal dengan ketulian atau MIDD
• Database MITOMAP 2004 menyebutkan penyakit mithocondrial myopathy,
encephalopathy,lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS) juga termasuk satu
dari subkelompok klinik mitochondrial encephalopathy yang utama dan
disebabkan oleh mutasi tunggal gen tRNALeu yang bertanggung jawab untuk
translasi UUR (R = A atau G) kodon leusin (tRNALeu(UUR))
• Pasien yang memiliki mutasi mtDNA A3243G cenderung nonobesitas,
nonketoasidosis, menyerang usia dewasa, terutama jika muncul gangguan
pendengaran, atau jika terdapat riwayat keluarga garis keturunan seibu yang
diabetes dengan gangguan pendengaran(Sriwidodo,2008).
• Penderita diabetes dengan anggota keluarga yang masih sehat, memiliki
kecenderungan
• risiko tinggi mendapatkan penyakit diabetes, dan akan sangat menguntungkan
apabila dapat didiagnosis dan diintervensi secepat mungkin penderita MIDD
memiliki kecenderungan mengalami peningkatan asam laktat, sehingga dihindari
penggunaan antidiabetik oral golongan metformin.
48. Teknologi DNA Rekombinan
• Kumpulan teknik atau metoda yang digunakan
untuk mengkombinasikan gen-gen secara
buatan. Teknologi DNA rekombinan telah
memberikan manfaat dibidang ilmu
pengetahuan maupun dibidang terapan.
49.
50. 1. Therapi gen untuk penyakit
• Dilakukan dengan menggantikan gen yang
mengalami kerusakan dengan gen yang
normal, digunakan untuk mengobati penyakit-
penyakit keturunan (genetic disorders) dan
penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan
gen (misal: kanker)
52. BidangPertanian:
• BakteriIce-(ice minus): bakteriyang telah
direkayasa sehingga tidak membeku pada
suhu rendah. Digunakan (disemprotkan) pada
tanaman agar tanaman tidak membeku
dimusim dingin. Telah diperdagangkan dengan
merek FrostbanR
53. Organisme transgenik
• Organisme yang membawa
gen yang berasal dari jenis
organisme lainnya.
Contoh:
• Tanaman kapas-Bt dan tomat-
Bt tahan terhadap serangan
hama karena menghasilka
ntoksin yang dapat
membunuh hamanya.
• Toksin pada kapas-Bt dan
tomat-Bt disandikan oleh gen
yang berasal dar ibakteri
Bacillus thuringiensis (Bt =
Bacillus thuringiensis)
• Tanaman kapas-Bt dan tomat-
Bt = tanaman transgenik
54. Bagaimana membuat dan menyisipkan DNA rekombinan pada
tanaman: Bakteri Agrobacteriumtumefaciens
Untuk menyisipkan gen kedalam genom tanaman.
• Prinsip: Agrobacteriumtumefaciens strain liar
(galur alami) memiliki plasmid Ti. Pada plasmid Ti
terdapat T-DNA yang mengandung gen penyebab
tumor.
• Pada waktu menginfeksi tanaman,
Agrobacteriumtumefaciens menyisipkan T-DNA
kedalam kromosom sel tanaman sehingga sel-sel
tanaman yang terinfeksi membentuk tumor.
55.
56. • Gen yang diinginkan dimasukkan kedalam sel
tanaman dengan cara menitipkannya (menyisipkan)
padaT-DNA.
• Agrobacterium yang digunakan untuk menginfeksi
sel tanaman adalah Agrobacterium yang sudah tidak
patogen