1. Prof. Dra. Adriana Cibele de Mesquita Dantas
UERGS – Bento Gonçalves

2. Introdução
 Os microorganismos sào pequenos demais a serem vistos
a olho nu
 Para tanto, utiliza-se um microscópio
 Alguns microorganismos são mais visíveis que outros,
devido ao tamanho ou a características mais facilmente
observáveis
 Procedimentos de coloraçao na parede celular,
membranas e outras estruturas

3. Unidades de medidas
 Unidades de microorganismos:
 micrometro (µm) = 0,000001m
 Micro indica dividida por 1 milhão (10-6)
 Nanômetro (nm) = 0,000000001 (10-9)

4. Anton van Leeuwenhoeck (1632 - 1723)
Ao segurar seu microscopio proximo a fonte de luz,
conseguiu observar organismos vivos que eram
muito pequenos a serem visto a olho nu
A amostra foi colocada na exremidade de um ponto
ajustavel e visualizada do outro lado atraves de
uma lente minuscula, quase esférica.
Maior ampliaçao possivel com esse microscopio foi
de 300x

6. Louis Pasteur (1822 - 1895)
• Inexistência da geração espontânea
• Teoria microbiana das doenças
• Fermentação, decomposição de
alimentos
• Pasteurização
• Descrição de bactérias associadas às doenças
(Staphylococcus, Streptococcus)
• Vacina anti-rábica

7. Robert Koch (1843 - 1910)
•Estudo do antraz - Postulados de Koch
•Técnicas para obtenção de culturas puras
•Placas de Petri
•Técnicas de coloração
•Estudos com Mycobacterium tuberculosis
•Descrição de Vibrio cholerae,
Trypanosoma
•1905 - Prêmio Nobel de Medicina

8. Processamento dos espécimes
• Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e
qualidade
• Coleta - Sem contaminação
• Transporte - Acondicionamento, Identificação
• Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos
ou Diferenciais
• Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com
incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobiose
• Exame inicial após 24 horas
• Análise macroscópica do crescimento
• Análise microscópica
• Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,
sorológicas, moleculares
• Análise do perfil de resistência a antimicrobianos

9. Culturas puras
 Distribuição uniforme de bactérias é essencial para visualização
das colônias
 Método mais comum; semeadura por esgotamento
 Com alça de inoculação estéril mergulhada na cultura mista,
posteriormente cultivada em meio solido
 Isoladas com alça obtém-se culturas puras, contendo somente um
tipo de bactérias.

11. Obtenção de culturas puras
 Origem de uma colonia visivel a partir de um único
esporo, de uma celula vegetativa ou de um grupo de
microorganismos em grumos ou cadeias
 Apresentam caracteristicas morfologicas diferentes,
que permitem diferenciar as colonias

12. Incubação em condições de anaerobiose
 Com o contato com oxigênio pode
causar morte das bactérias
anaeróbicas
 Crescimento com meio cultivo
especiais denominados meios
redutores
 Tioglicolato de sódio, combina-se com
o oxigênio do meio e elimina da
cultura

13. Quantificar diretamente o crescimento
microbiano
 Determinar numero de células
 No. Cels/ml em meio liquido ou gr em material solido
 Determinar a massa total populacional
 Formulas matematicas, ex.:
 70 cels = 10-6 mL
 X cels = 1 mL
 Utiliza-se procedimentos de diluições

14. Contagem em placa
 Técnica mais utilizada na determinação da população
bacteriana
 Somente as células viáveis são contadas
 Esperar 24 horas para células visíveis
 Somente em culturas puras, de uma única bactéria
 A contagem em placas são chamadas Unidades
formadoras de colônias, unidades são os grumos ou
cadeias das bactérias

15. Diluição em série
 10 mil bactérias / mL
 1 mL mostrará 10 mil colônias em placa – difícil de contar
 Transfere-se 1 mL para um tubo de 9 mL de caldo de
cultura = 1000 bactérias / mL
 Transfere-se 1 mL = 100 bactérias / mL
 Transfere-se 1 mL – 10 bactérias

16. Metodo de pour plate
 Inoculo = 1,0 mL ou 0,1 mL da diluição bacteriana
colocada diretamente na placa de petri
 Adiciona-se inoculo em placa sem meio e após o agar,
mistura-se suavemente
 Crescimento das colônias na superfície como dentro
do meio

17. Espalhamento na placa
 Adição de inoculo em placa 0,1 mL contendo meio
solido
 Espalhamento por uma alça
 Crescimento na superfície do meio

18. Contagem direta no microscópio
 Volume conhecido de suspensào é delimitada em uma
área definida em um lâmina ‘Petroff-Hausser’
 Contadores eletronicos de celulas = contadores
Coulter

19. Análise microscópica
Coloração de Gram

20. Coloração álcool-ácido resistente
 Se liga apenas a bactérias que possuem material céreo em suas
paredes .
 Identificação do gênero Mycobacterium:
M. tuberculosis, M. leprae e linhagens patogênicas de Nocardia.
 O corante carbolfucsina é aplicado aum esfregaço fixado e a
lâmina é aquecida por vários minutos
 A seguir a lâmina es esfriada, secada e lavada com água.
 O esfregaço é tratado com o descolorante álcool –ácido (remove o
colorante vermelho das bactérias que nâo são álcool-ácido (al-ác)
resistêntes.
 Os microorganismos al-ác resistêntes retêm a cor vermelha pois a
carbolfucsina é mais solúvel nos lipídeos da parede celular que no
al-ác.

21. Coloração de Ziehl-Nielsen

22. Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa
(presença de cápsula), coloração de flagelos, coloração de endósporos.
 Coloração Negativa: Permite demonstrar a presencia de
Negativa
cápsula (revestimento gelatinoso). Mistura-se as bactérias
com tinta nanquim ou nigrosina para criar um fundo escuro
e cora-se as bactérias com coloração simples com safranina.
 Coloração de Endósporos (Técnica de Schaeffer-Fulton):
Utiliza-se verde malaquita para a coloração primaria.
A safranina utiliza-se como contracorante para corar as poções
da cálula que não os endósporos.

23. Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa
(presença de cápsula), coloração de flagelos.
Colorante: Nigrosina
Colorante:
Carbolfucsina:Aumentar
diâmetro dos falgelos.

24. Difusão em ágar –
Método de Kirby &
Bauer

25. Microdiluições: Em placas Elisa

26. “ELISA” (do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay)
 Se baseia reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações
enzimáticas.
 A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que
catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2 ) em
H2O mais O2 .
 Existem vários modelos de testes de ELISA;
 Forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a
um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado; a seguir coloca-se
sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de
anticorpos contra o antígeno.
 Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação
antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de
um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie
onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é
ligada à peroxidase.

27.  Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que
apresença de anticorpos em determinado soro é revelada pela
competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido
contra o antígeno.
 Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a
coloração aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos.

28. Ensaio Imunoadsorvente
Ligado à Enzima - ELISA
 O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois
conjugados com enzimas.
Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase
 O produto final corado surge por ação da enzima que converte um
substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato
alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância
indicadora).
 A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de
leitura em fotocolorímetro.
 Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e
captura.

29. TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
INDIRETO DIRETO OU PLACA
SANDUÍCHE UTILIZADA

30. ELISA Indireto
ELISA Direto ou Sanduíche

31. ELISA Competitivo
 Aplicações do ELISA:
 Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa
 Vantagens:
 Teste de alta sensibilidade
 Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
 Seguros e de baixo custo

34. AFINIDADE DE INTERAÇÃO
• Força da interação entre um único epitopo
antigênico e um único sítio de combinação com
o antígeno
Alta afinidade Baixa Afinidade
Ab Ab
Ag Ag
Afinidade = Forças de atração e de repulsão
KA
[Ag] + [Ac ] ⇔ [Ag-Ac] KA= Constante
KA= [Ag-Ac] ÷ ([Ag] + [Ac]) intrínseca de associação

35. Reatividade Cruzada
• Quando os antígenos são estruturalmente
relacionados podendo ocorrer a reatividade de
um anticorpo com outro epitopo antigênico.
Reações Cruzadas
Anti-A Anti-A Anti-A
Ab Ab Ab
Ag A Ag B Ag C
Epitopo
compartilhado
Epitopo similar

36. FORÇAS QUE ATUAM NAS INTERAÇÕES
ANTÍGENO/ANTICORPO
Moléculas que apresentam grupos
laterais iônicos de cargas opostas
que se atraem fortalecendo a
interação Ag-Ac.
Forças fracas que ocorrem
devido à proximidade
física entre as moléculas.
A mais fraca das ligações.
Ocorrem entre o núcleo de um
átomo e a nuvem de elétrons de
outro formando dipolos que se
atraem.
Atua em moléculas não
polares facilitando a
aproximação, os choques
moleculares e as ligações.

37. Avidez
• São as forças totais de interação entre um
antígeno com o anticorpo
Keq = 104 106 1010
Afinidade Avidez Avidez

38. RESPOSTA DE ANTICORPOS
 Especificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.
 Quantidade
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua
produção.
 Isotipo
Determina a persistência (meia vida in vivo diferente).
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são
encontrados.
 Afinidade
Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a
afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.
 Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.

39. INTERAÇÕES
 Reações reversíveis.
reversíveis
 Ligações não covalentes:
-Pontes de hidrogênio
-Interações hidrofóbicas
-Interações de Van der Waals
-Ligações iônicas

40. MÉTODOS
1) Reagentes não marcados
• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting

41. MÉTODOS
APLICAÇÕES
 PRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
- Pesquisa
- Imunoeletroforese - Diagnóstico
 AGLUTINAÇÃO -
- Aglutinação direta e indireta Soroepidemiologi
- Inibição da aglutinação a
- Teste de Coombs
 IMUNOENSAIOS
- RIA
- ELISA
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo
- Western Blotting

42. PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
 Precipitação:
Formação de complexos Ag/Ac.
 Aglutinação:
É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac
que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.
 As reações de precipitação e de aglutinação decorrem,
respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e
particulado.

43. REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
 Interação entre Ac e Ag solúvel
 Ac precisa ser bivalente
 Ag precisa ser bi ou polivalente
 A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que
cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA
PRECIPITAD
O

44. É importante levar-se em conta como
ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes
concentrações dos mesmos. Observe
abaixo:
Anticorpo livre + - -
Antígeno livre - - +
100%--
Percentual
de
complexo
imune
precipitado Zona de excesso Zona de Zona de excesso
de anticorpo equivalência de antígeno
Quantidade de antígeno adicionado

45. TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla:
• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:
• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são
adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por
exemplo, é mostrado abaixo:
Ac

46. IMUNODIFUSÃO DUPLA
 As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em
zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma
linha de precipitação:
 Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das
proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com
corante
Utilização: muito usada
em pesquisa e
diagnóstico de algumas
Ag Ag doenças, como
cisticercose
Ac
Ag Ag Ag Ag
Ac Ac
46

47. IMUNODIFUSÃO RADIAL
 Permite a quantificação do
antígeno ou do anticorpo.
 O processo continua até ser
atingida a zona de equivalência,
com os complexos precipitando-
se em um anel (halo) em torno
do orifício.
Utilização: dosagem Poços onde são
de IgG, IgA e IgM e colocados
proteínas séricas. padrões e
amostras a
Agarose serem dosados
contendo
anticorpos Halo de anti-IgG
IgG – precipitação
anti-IgG
humana

48. IMUNOELETROFORESE
 Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em
gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
 As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo
com os seus PM e cargas elétricas.
 Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.
 Ag e Ac formam arcos de precipitação.
1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna
canaleta
Ag
canaleta
+ -
Ag
3- Difusão e precipitação
48

49. REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
 Ac + Ag multivalente particulado
 Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-
quantitativo)
 Pó-zona: excesso de Ac
 Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica
(repulsão)
 Agregação visível de
partículas = Eritrócitos,
bactérias, fungos e látex

50. AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema
ABO)
1) Amostra de sangue na placa teste:
2) Reagente (anticorpo anti A, B):
50

51. AGLUTINAÇÃO DIRETA
4) Mistura-se:
3) Controle negativo:
51

52. AGLUTINAÇÃO DIRETA
5) Leitura do resultado:
negativo positivo
Um resultado positivo é indicado por uma
aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na
placa teste), como ilustrado acima.
52

54. AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies
(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a
Doença de Chagas:
• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi
(ligação covalente) e então distribuídas nos poços
da placa.
• O soro teste e os controles positivos e negativos,
devidamente diluídos, são adicionados aos poços
da referida placa.
• Se houver Ac específico contra o Ag, as
hemácias se aglutinam e formam uma camada
no fundo do poço. Quando não existe Ac específico,
as células formam um botão no Aglutinação
fundo do poço.
Positiva
Negativa

55. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
+ Resultado
Urina negativo:
Soro anti - hCG
(ausência de hCG
Partículas
Adicionam-se na urina).
revestidas com
hCG Ocorre aglutinação,
São incubados
e colocados
pois os anticorpos
numa placa anti-hCG não são
bloqueados na
incubação inicial,
porque não havia o
Resultado positivo:
hormônio na urina.
(presença de hCG
na urina): não ocorre Livres, podem
aglutinação. aglutinar as
partículas
Ac se ligaram no hCG da urina, revestidas de hCG.
(ficando bloqueados), na incubação inicial
55

56. IMUNOENSAIOS
 Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos,
isótopos)
 Tipos:
- RIA
- ELISA
- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO
- WESTERN BLOTTING

57. IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica:
 Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma
substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite
luz no espectro visível.
 Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode
ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.
 A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as
comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV
(microscópio de fluorescência).
 Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC)
e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta,
indireta ou saduíche.

59. Microscópio de fluorescência com epiluminação
fluorescência emitida
luz UV atinge o ma- chega ao observador
terial examinado

60. TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

61. APLICAÇÃO DA TÉCNICA
IFA direta:
 Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em
cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
IFA indireta:
 Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de
Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
 É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais
intensa) e especificidade.

62. IMAGENS

63. CITOMETRIA DE FLUXO
 Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em
uma corrente através de um feixe de Laser.
 Separa as células por fluorescência ativada.
 Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.
 É um teste qualitativo e quantitativo.
APLICAÇÕES
 Tipo de linfócitos;
 Quantidade, tamanho, granulosidade;
 Isolamento de populações celulares;
 HIV

65. RADIOIMUNOENSAIO - RIA
 Marcações:
 I125: emite raios gama
 H3: raios beta
 Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de
10-12g)
 Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo.
 Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue,
Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

66. Metodologias que utilizam reagentes
não marcados:
•Precipitação
•Aglutinação
•Hemólise (Fixação de Complemento)
Metodologias que utilizam reagentes
marcados
•Radioimunoensaios
•ELISA
•Imunofluorescência
•Western Blotting
•Citometria de Fluxo

68. Zona de equivalência: Ag-Ac
se ligam equimolarmente
formando uma rede estável.
Excesso de antígeno: Os
complexos podem ser
dissolvidos quando há excesso
de Ag pois o Ac fica livre para
se ligar a novos Ag adicionados
diminuindo a formação de
complexos insolúveis.
Excesso de Ac: Ocorre
redução de imunocomplexos
pois todo o Ag está precipitado
e fica Ac livre no sobrenadante.
Pró-Zona

73. Imunodifusão radial (Mancini)
Ac no gel
• Método
– Anticorpo no gel Ag Ag Ag Ag
– Antígeno no poço
 Interpretação
 Diâmetro do anel é
Diameter2
proporcional à
concentração do Ag
 Quantitativo
 Níveis de Ig
Ag Concentração

74. Imunoeletroforese/Precipitação
• Método
– Antígenos são separados por eletroforese
– Anticorpo é colocado num corte no ágar
+ -
Ag Ag
Ab
Ag
Ab
• Interpretação
– Arco de precipitina representa a interação Ag-AC

75. Imunoeletroforese/Precipi
tação

76. WESTERN BLOTTING
 Eletroforese de
proteínas.
 Identifica
antígenos ou
anticorpos.

77. WESTERN BLOTTING

78. WESTERN BLOTTING

80. Caracterização sorológica

81. Atividades
desempenhadas
pelo Microbiologista
Clínico

82. Processamento dos espécimes
Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidade
Coleta - Sem contaminação
Transporte - Acondicionamento, Identificação
Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou
Diferenciais
Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com
incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobiose
Exame inicial após 24 horas
Análise macroscópica do crescimento
Análise microscópica
Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,
sorológicas, moleculares
Análise do perfil de resistência a antimicrobianos

83. Semeadura por esgotamento
Meios ricos, seletivos, diferenciais

84. Incubação em condições de anaerobiose

85. Análise macroscópica do crescimento

87. Análise microscópica
Coloração de Gram

88. Coloração de Ziehl-Nielsen

89. Outras técnicas de coloração

90. Caracterização bioquímica

91. Caracterização bioquímica

93. Difusão em ágar -
Kirby & Bauer

94. Macrodiluições

95. Microdiluições

97. ELISA

98. Western blot

100. Análises moleculares
PCR
Geometric
Amplification
20
↓
1st
cycle
21
2 cycle
↓
nd
22
↓ n th
cycle
↓
2n

102. ELISA

103. Western blot

105. Análises moleculares
PCR
Geometric
Amplification
20
↓ 1 cycle
st
21
↓ 2 cycle
nd
22
↓ n th
cycle
↓
2n

107. Enxergando os microrganismos:
Microscópio
 Ampliação: jogo de lentes, campo magnético
 Resolução: depende do comprimento de onda utilizado
para enxergar
Há dois tipos:
Óptico:
Fase, campo escuro, fluorescência
Jogo de lentes (20-2000x)
Luz visível (300-700nm)
Eletrônico:
Transmissão, varredura
Campo magnético (até 40000x)
Feixe de elétrons

108. Figura microscópio

109. Figura resolução
www.bmb.psu.edu/courses/ micro107/microscopy/

110. Esterilização de meios e equipamentos
 Escolha entre esterilizar (morte de microrganismos vegetativos e esporos)
 UV
 Vapor úmido (mínimo 20 minutos – 120 °C )
 Vapor seco (acima de 150 °C )
 O aumento da temperatura e do tempo aumenta a perda de nutrientes (vitaminas)
 Melhor aumentar a temperatura e diminuir o tempo (UHT)
 Pasteurização (morte de patogênicos)
 62 °C em 30 minutos, resfriamento brando
 Tindalização (70-100 °C ) 1 h, após 24 h repete
 Desinfecção (desinfetantes, antissépticos)
 Agentes quimioterápicos (Sulfa, Cloranfenicol, antibióticos)
 Filtro de lã de vidro