clonación en vegetales

1. Trasformación de células vegetales
Obtencióndeplantastransgénicas
1.-INTRODUCCIÓN
Seharealizadounesfuerzoconsiderable
paraeldesarrollodevariedadesdeplantas
conunaelevadaproducción
ounvalornutricionalrealzado.Aunque
lasprincipales
investigacionessehandedicadoalamejoradelostresprincipalescereales–maíz,trigo yarroz–
sehanestablecido
tambiénprogramasdemejora
paraotrasplantascomestibles
yespeciesdehorticultura.Latecnología
delDNArecombinante,ampliamenteutilizada
consistemasmicrobianos,
estambiénunaimportanteherramienta
paralamanipulación
genéticadirecta deplantas, Existeunnúmerodemétodosdetransferencia deDNAy vectores
deexpresión
efectivosqueseocupandeunampliorangodecélulasvegetales.
Además,lascélulasvegetalessontotipotentes–sepuederegenerarunaplantaenteraa
partirdeunasolacélula–asíquesepuedenproducir
plantasfértilesqueportengen(es)
foráneo(s)
entodassuscélulas(i.e.,plantastransgénicas)apartirdecélulas
genéticamentemodificadas.Silaplantatransgénicafloreceyproducesemillasviables,
el
carácterdeseadopasaráasucesivasgeneraciones.
Existentresprincipalesmotivacionesparaeldesarrollodeplantastransgénicas.En
primerlugar, laadición delgenogenesgeneralmente mejoraelvaloragricultor, horticultor
uornamentaldeunaplanta.Segundo,
lasplantastransgénicaspuedenactuar
como
biorreactorespara la producción barata de proteínas o metabolitos económicamente
relevantes. Y por último, la transgénesis
de plantas proporciona
medioseficacesparaelestudiodelaaccióndegenesduranteeldesarrolloy
otros
procesosbiológicosdelasplantas.
Algunosdeloscaracteresgenéticamentedeterminadosquepuedenintroducirseen
plantasmedianteunúnicogeno,potencialmente,medianteunpequeñoclusterde
genes,
incluyen
actividad
insecticida,protecciónfrentealainfección
viral,resistenciaa
herbicidas,proteccióncontrabacteriasyhongospatógenos,reduccióndelasenescencia,
toleranciaaestrésambiental,pigmentación
alteradadelasflores,mejoradelacalidad
nutricional
delassemillas...Además,lasplantastransgénicaspuedenproducir
una
ampliavariedad decompuestos útiles,incluyendo agentesterapéuticos,polímeros,y
herramientas diagnósticas como fragmentos de anticuerpos. De forma alternativa,
pueden diseñarsepara la síntesis de determinantes antigénicos virales que, tras la
ingestión,
puedenusarsecomovacunascomestibles.Hastalafecha,unas140especies
vegetalesdiferenteshansidogenéticamentetransformadas,incluidasmuchasespecies
deforestales ydecultivoalolargode50países repartidosporel mundoentero.
Latransformacióndeplantassellevóacaboprimeromedianteelusodelplásmido

2. TideAgrobacteriumtumefaciens,unfitopatógenoqueensuciclovitalnormal
transforma
genéticamente lasplantasque infecta.Seriaslimitacionesenelmecanismo naturalcondujeron
aldesarrollodevectoresgenéticamentediseñadosbasadosenel
plásmidoTi:elvectorbinarioyelvectorcointegrado. Peseaqueestossistemaseran eficientes
en varias especies vegetales, las plantas monocotiledóneas,incluidas los principales
cerealesdecultivo(trigo,arrozymaíz),nopodíansertransformadas medianteA.tumefaciens.
Cuando
lasdificultadesparalatransformación
dealgunas
especiesvegetalesresultaronevidentes,sedesarrollaron
unciertonúmerode
mecanismosalternativosalatransformación
mediadaporA.tumefaciens:losmétodos
físicosdetransferenciadelDNA.Muchosdeestosmétodosrequeríanlaeliminación
delaparedcelulardelascélulasvegetales(esdecir,requeríanelusodeprotoplastos).
Estos protoplastospueden mantenerse en cultivo como células en crecimiento
Independientes
o,medianteunmediodecultivoespecífico,puedenregenerarselas
paredescelularesy
lasplantasenteras.Además,sehandesarrollado
métodosde
transformación
paraintroducirgenesclonadosenunpequeñonúmerodecélulasdeun
tejidovegetal,apartirdelcualsepuede
desarrollar
laplantaentera,evitandoasíla
regeneraciónapartirdeprotoplastos,
enocasionescompleja.Enelpresente,lamayor
partedelosinvestigadores
usalosvectoresderivadosdelplásmidoTioelbombardeo
conmicroproyectiles(biolística)paralatransformacióndecélulasvegetales.
Enestetrabajopretendemos realizaruncompendiodelastécnicasquealolargode
lahistoriasehanutilizadoparalatransgénesis
deplantas,notodasconbuenos
resultados.
LosavancesenlastécnicasutilizadasporlaIngenieríaGenéticahan
permitido
lamejoradeestosmecanismos,
alguno
deloscualessehanidodejandoatrás
pornocorroborarlosresultadosauspiciados.Aquíencontramosunamuestradeellos.
2.-AgrobacteriumCOMOMÉTODODETRANSFORMACIÓNVEGETAL:
2.1.-Agrobacteriumtumefaciens
El método másutilizado para introducir genes foráneos en una planta es la
capacidadnaturaldeA.tumefaciens.
Porello,comenzaremosrevisando
losdiferentes
estudiosquepermitierondescubrircómoestabacteriatransformaba
deformanatural
célulasvegetalesconel plásmidoTi.
2.1.1.-Transformación delacélulavegetalconelplásmido
TideA.tumefaciens
Labiología moleculary laingenieríagenéticaenplantasseinicianconel descubrimientoy
elestudiodeAtumefaciens.Estabacteria,Gramnegativa,inducela
formacióndetumores,denominados
agalladelacorona,generalmenteenlaunióndel
talloconlaraíz,ennumerosasdicotiledóneasyenmuy
pocasmonocotiledóneas
y

3. gimnospermas (DeCleeneyDeLey,1976). Estabacteriadelsueloinfectaa
comopartedesuciclovitalinsertandogenesforáneosenlasmismasy
consiguiendoqueseexpresenen formadeproteínas.
dicotiledóneas
En1947,ArminC.BraundelinstitutoRokefellerdeInvestigaciónMédica,logró
cultivartejidodelaagalla
librede
bacteria,pudiendoobservarcomolos
tumores
crecíaninvitroenunmediobásicocarentedeauxinasycitoquininas(hormonas
necesarias
paraelcrecimientodecélulas
vegetalesnormales).Braunconcluyóquela
bacteriaintroducíaenlascélulasun“principiotumorígeno”.
En 1965, Menaguéy Morel del instituto de investigaciones agronómicas de
Versalles, observaron que las células tumorígenaspodían sintetizar una serie de
derivadosde
intermediariosmetabólicosdelamayoríadelosaminoácidos,cetoácidosy
azúcares.Denominaronaestassustanciasquímicasopinas.
Fueen1974cuandoJeffSchell,MarcVanMontanguysuscolaboradoresdela
UniversidaddeGante,encontraronplásmidosmuy desarrolladosenlascepasvirulentas
yobservaronqueerantransferidosdesdeestasacepasnovirulentaspor conjugación.
Luego el “principio tumorígeno” del que hablaba Braun, responsable de la
formacióndelacrowngall(enausencia
delabacteria)eralatransferencia
fragmentodeDNAllamado T-DNAque asu vezselocalizabaenunplásmido
denominóTi(deinductordetumores).TraslatransferenciaelT-DNAseintegrabaen
genomanucleardelaplantaysuexpresióninducíaelfenotipotumoral.
deun
alquese
el
Figura:PlámidoTi.ElT-DNAestádefinidoporlosbordesderechoe
izquierdoeincluyelosgenesparalabiosíntesisde
auxina,citoquininayopina;estosgenessontranscritosytraducidossólo enlas célulasdelaplanta. Fueradela
regióndel T-DNA,hayun clusterde genesvir, un genquecodificaparaun enzima(s)del catabolismodela
opina,yun origendereplicación(ori)quepermitequeelplásmidoseamantenidodeformaestableenA.

4. tumefaciens
GENES op
ExperimentosdeconjugaciónrealizadosenlaUniversidaddeLeidenporRobA
Schiperoortysuscolegasevidenciaron
queesteplásmidoTilepermitíaalabacteria
degradaroctopina
onopalina(opinas)ycrecersobreunodeesoscompuestos,además
determinabasieltumorsintetizaríaunauotraopinay
eraesaopinalaqueinducía,
específicamente, la transferencia del plásmido en la conjugación.El gen opes el
responsabledelasíntesisdeopinas.
Basándoseeneltipo deopinascodificadaspor elplásmidoTiDessauxetalen1992
yVudequin-Dransartetalen1995clasificaronaunampliorangodeagrobacteriasen
distintasvariedadessegún
indujeran
lasíntesisdeoctopina,nopalina,agropina,
succinamopina ocrisopina.Lasopinasformadasenlostumorespuedenser metabolizadas por
el Agrobacteriumque lo inicia pero no por la mayoría de las bacterias delsuelo
(TempeyPetit,1982).Estasopinas
sirvencomofuentedecarbonoy
denitrógenoparaelAgrobacteriumqueindujoeltumoryparatodosaquellosque
presentenlosgenes para elcatabolismo delaopina producida,estosgenesquepermiten
ladegradaciónselocalizanen el plásmidoTi perofueradelT-DNA.
Así,mediantelamodificacióngenéticadelaplanta,Agrobacteriumcreaunnicho
favorable parasímismo,utilizandolamaquinariadelacélulavegetalparaproducir sustancias
quenovaautilizarestaperoquepermitenelcrecimientodelabacteria,el
plásmidoTi
simbióticoes,portanto,elelementocentraldeunainterrelaciónecológica
altamenteevolucionada.
GENES onc
AlgunosdelosgenesdelplásmidoT-DNA(genesonc)eranlosresponsablesdela
síntesisanormaldehormonasdecrecimientoporpartedelaplanta,losaltosnivelesde
estasauxinasycitoquininaseranlosquepermitíanunadiferenciaciónanormaldelas
célulasdelaplantayprovocabanuncrecimientoneoplásico.Existenprincipalmente
tresoncogenesdeloscualesdosiamM(codificalatriptofanomonooxigenasa)
yiaaH(codificalaiodoaceamidahidrolasa)
codificanenzimasqueinicianlasíntesisdeuna
nuevaauxinabiosintética.Actúansecuencialmenteparaconvertireltrpenindol-3-acetamida y
luego en indol-3-acetico (IAA). El gen ipt(codifica la isopenteniltransferasa)es el
responsabledelasíntesisdecitokininas.
Mientrasqueestosgenesestánimplicadosenlasíntesisdeauxinasycitoquininas
dosgenesT-DNA
modulanlasactividadesdelasmismas.Setratade5y6b,elgen5
influyeenlasrespuestas delaplantaalasauxinas mediantelasíntesisautorregulada de
antagonistas(Körberetal,1991)y
lafunciónconcretadelgen6besdesconocida,
algunosestudiossugierenquereducelaactividaddelascitoquininas(Spanieretal,1989;Gaudine
tal,1994)mientrasqueotrosparecendemostrarquetieneunefecto
similaraldelasauxinas(Tinlandetal,1989,1990).
Losgenesqueregulanlosniveles

5. hormonalesenlacélulainfectadasonmuy
importantespuestoquenivelesdemasiado
altos,puedenprovocarlamuertedelamisma, enlugardela formacióndeltumor.
Origende replicación
El oripermitequeel plásmidoTi seamantenidodeformaestable enA tumefaciens.
ExistentreselementosgenéticosnecesariosparalatransferenciadelT-DNAala
planta,estasregionescríticasestánpresentesentodoslosplásmidosdeAgrobacterium,
aunquesuestructurayorganizaciónsonmuydistintassegúnla especieylavariedad:
BordesflanqueantesdelT-DNA:
A laizquierda yderechadelT-DNAexistendos directrepeats deunos24-25pbque
flanqueanydefinenelT-DNA(vanHaarenetal,1998).Estosbordes
sonsecuenciasen
cisnecesariaspara
latransferencia(Zambryskietal,
1983)ynormalmente
todoelDNA
contenidoentrelosmismosestransferido alaplanta.Parecequeelbordederechoes crítico en la
transferencia del DNA y en el proceso tumorígenomientras que el izquierdonoafectaala
formacióndeltumor.
Genesvir.
GenesdevirulenciaoregiónvircodificadaporelplásmidoTienunaregiónde35
kblocalizadafueradelT-DNA,existen25genesvirreunidosen7operones.
Recientes
investigaciones
indicanquelainteracciónentrelosgenesvirylassecuenciasdelos
bordesinicianel procesodetransferencia.
Genescodificadosporelcromosomabacteriano.
Estosgenessonnecesariosparalaunióndelabacteriaalacélulavegetaldañada.
GENES vir
Paraqueesteprocesodetransferenciatengalugaresnecesarioqueademásde
practicarle una heridaalaplantaestasinteticeuna seriedecompuestos queinduzcanla
expresión
delosgenesvir(Boltonetal,1986;Janssensetal,1986;Stacheletal1986).
Setratadederivadosdeaminoácidos, azúcaresyunaseriedecompuestos derivados del
metabolismodelfenílpropanoico(principalvíaparalaproduccióndemetabolitos
secundarios)yunaseriedemetabolitossecundariosqueproducenlascélulasdañadas.
Stacheletalen1986,trabajandoconNicotianatabacumidentificaronungrupode
compuestosqueinducíanlaexpresióndelosgenesviralañadirAgrobacteriuuma
exudados
deheridaspracticadasaestaplanta.Unadelassustanciasmásactivas
identificadasfuelaacetosiringona, peroademásesnecesarioquesedenunaserie condiciones
paraquelatransferencia tengalugar:debenutilizarsemediospobresen azúcares,debajopHy
connivelesbajosdefosfato(Winansetal,1988;Ankenbauery
Nester,1990;Canguelosiet

6. al,1990).
VirAyvirG sondos genes reguladoresnecesariospara laactivacióntranscripcional
delosoperonesvir(StachelyZambrynski, 1986a), mientrasqueestosdosgenesson expresados
constitutivamente,losdemásgenesvirpermanecensilenciadosenausencia
deciertosfactores,producidosporlaplanta,que activansusíntesis.
-VirG, enbasealahomologíadesusecuenciadeaminoácidos, fueincluido enuna
clasedegenes reguladorespositivosinducidosporfactoresexternos(Nixonetal,1986;
Winanset al,1986).
-VirA ,perteneceaunsegundo grupodegenes quedirigelaactivacióndeproteínas
reguladoras
positivasdelaexpresióngénica(Ronsonetal,1987;Winansetal,1986).
Presentaunaaltahomologíaconquimiorreceptores
proteínkinasatransmenbrana(Lerouxetal,1987)yselocalizanenlamembranadeAgrobacteriu
m(Winansetal,
1989).
La inducción de los genes virde Agrobacteriumimplica que el sistema de
reconocimientode
labacteriadetecteloscompuestos
fenólicosproducidosporlaplanta
ytransmitalainformaciónalinteriordelacélulabacteiana.Esteprocesoesmediado
porel
productodelosgenes
virAyvirG.Eldominioperiplásmicode
laproteína
VirA
detectaelpHexternoy
lapresenciadeinductores
aunquenotienequeunirse
necesariamentealosmismos(Leeetal,1992).Losinductores comolaglucosaola acetosiringona
sonreconocidosporVirA.Enelcasodelainducciónporazúcares,es
necesarioelproducto
delgenchvE,localizadoenelcromosomabacteriano,yque
codificaporunaproteínadeuniónperiplásmica.LaseñalpercibidaporVirAprovoca
su
autofosforilación
enunresiduodehistidinaespecífico
yestaestransmitida
posteriormenteaVirGporlafosforilacióndelácidoaspártico52deldominioreceptor
deeste(Jinetal,1990).LaunióndelaproteínacitoplasmáticaVirGalasllamadas
cajasvirenlasregiones promotoras delosoperonesvirprovocalaactivacióndela trascripción
deformaeventual
(Stecketal,1988;Jinetal1990;PowelyKado,1990;
Heñidoet
al,1994;Scheeren-Grootet
al,1994).

7. Figura:Activacióndelosgenesvir.
Hansidoidentificadosmuchosdeloslocicromosómicosqueafectanalaexpresión
delosgenesvir.MutacionesenChvD,ros,miaA,ivr,
chvGychvIsonalgunos
ejemplosysuinfluenciaendichaexpresiónnoestátodavíabiencaracterizada,de
cualquierforma,lainfluenciacromosómicaenlaexpresiónyregulacióndelosgenes
viryportantoenlavirulenciaestámasquedemostrada.
Una vez se ha producido el reconocimiento y la unión a la célula vegetal
susceptible,el siguientepasoen
la tranformaciónes
la producciónde un T-DNA
intermediariodenominado
T-strand.Labacteriaproduceunacopialinealdecadena
sencillaapartirdelT-DNA (Stacheletal,1986).JuntosVirD1yVirD2reconocen las repeticiones
directasdelosbordesdelT-DNAyproducendoscortesentreeltercery
cuartonucleótidofinaldecadasecuencia repetitivade losbordes (Yanofskyetal,1986;
Wangetal,1987;Pansegrauetal,1993;Jasperetal,1994;Scheiffeleetal,1995).
EstosdoscortesmarcanlossitiosdeinicioyterminacióndelaformacióndelaT- strand.
VirD1actúacomounatopoisomerasarelajandoladoblehélice(GhaiyDas,1989)
aunqueestonopudoserconfirmadoutilizandoVirD1purificado(Scheiffeleetal,
1995).Traselcorte
VirD2permanece
covalentementeunida
alextremo5´finaldelaTstrand(Herrera-Estrellaet
al1988;YoungyNester,1988;Ward
yBarnes,1988)
medianteelresiduo
detirosina
número29,deestaformaprotegealaT-stranddela
accióndeexonucleasas(Dürrembergetal,1989),aestaprotecciónsesumala
proporcionadaporVierE2quetambiénseune,peroalolargodetodalaT-strand.
VirD2actúacomoproteínapilotoimpidiendoladeleccióndeesteextremoquees
imprescindible
paralatransferenciayaquesudelecciónabolelatransferenciamientras
quesisedeleccionaelbordeizquierdosolodisminuyelaeficaciadelproceso(Jooset
al,1983;Hermanetal,1990).Estapolaridadobservadaestáentotalconcordanciacon
elmodoenelquesegeneralaT-strand,yaquesusíntesisnopuedeiniciarsesinel
bordederechomientrasquelaterminaciónpuedetenerlugarsinelizquierdoaunquela
frecuenciaseabaja.
LasproteínasVirCestánimplicadasenlaformacióndelcomplejodeborde,al
menosen el casodelosplásmidosTipara laoctopina(Toroetal, 1989).VirC1seunea
lasecuenciaODpresenteenelbordederecho,ydirigeelcorterealizadoporVirD2en dicho borde
(Toro et al, 1988), sin embargo, el modo en que VirC1 media la
interacciónentreVirD2yODesdesconocido
AunquetodoelDNAlocalizadoentrelosbordesderechoeizquierdoestransferido
laplanta,enocasiones,tambiénsetransfierensecuenciasqueno están entre los mismos
(Joosetal,1983;Hermanetal,1990;Martineauetal,1994;Denisetal,1995;Clusteretal,1995)seg
uramentedebidoaqueelbordeizquierdonoesprocesado(Ramanathan

8. yVeluthamby,1995).Enel20-25%delaslíneastransgénicassedetectansecuencias
quenopertenecenalT-DNAy
queselocalizancorrienteabajodelborde
izquierdo
(Martineauetal,
1994).Inclusosehademostradoquesecuenciascromosómicaspueden
sertransferidasalaplanta,aunque,conunafrecuenciade10-4(Hermanet al,1994).
UnavezproducidalaT-strand,esnecesarioqueestaseatransportadaatravésdela
membranabacteriana,diversosestudiosdemuestranquelosproductosdeloperónvirB
estánimplicadosenesteproceso(Tompsonetal,1988;Wardetal,1988;Shirasuetal,
1990).
Dehecholamayoríadelos11ORFscodificados
poresteoperóncodifican
proteínasquereúnenlascaracterísticasesencialesdeunsistemadetransporteatravés
demembrana.
RecientementesehaobservadoquetraslainduccióndelosgenesvirAgrobacterim
formaun
pili,
enausenciadelmismo
no
seproducelatransferenciadelTDNA(Fullneretal,1996).Portantodichatransferenciaseproduceporunprocesodeconjugacióne
n elqueestánimplicados estospolipéptidoscuya función concretasetratadedilucidaren
estosmomentos.
Bordesderechoe izquierdo
UnaveztrasladadoelT-DNAalaplantaestedebeinsertarseenelgenomaypara
ellosonnecesariaslasunidadesderepeticiónde25pbpresentesenel bordederecho:
Derecho: 5’-TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN–3’
Izquierdo:5’-TGGAGGATATATNNNNNTGTAAANN–3’
DurantelainsercióndelT-DNAenelDNAcromosómicodelaplanta,éstea
menudoexperimente
cortasdeleccionesdebidoalprocesodeempalmeentreambos
DNAs.Lainserción
delT-DNAesaleatoriamientrasquelosbordespresentancierta
homologíacon aquelloslugaresdelDNAdelaplantaenlosqueseinsertan.
Traslainserciónseproducelaactivacióndenumerososgenescomolosoncyop
queyahemosdescrito.
2.1.2-IngenieríagenéticadeplantasusandoT-DNA
ElusodeT-DNAenlaingenieríagenéticadeplantassebasaencuatrograndes
descubrimientos
yeneldesarrollodenuevastécnicas.Elprimerofuelalocalizacióny
deleccióndelosgenesquegobernaban
laformacióndeltumor(ipt,iaaMeiaaH).El
segundoeldesarrollo
demarcadoresútilesparadetectaraquellascélulasvegetalesque
habíansidotransformadasporAgrobacterium.
Elterceroeldesarrollodevectoresy
procedimientosgenéticosquepermitíanintroducir
genesforáneosenelT-DNAy
el
cuartoeldesarrollodevariossistemasdecultivodetejidosquepermitieronlainfección eficiente
y
la regeneración
de plantas transgénicas
completas a partir de células
vegetalestransformadasconel insertodeinterés.

9. El proceso básico de transformación
recogidoenlafiguraadjunta:
vegetal utilizando
A.tumefaciensaparece
Figura: TransformaciónmedianteAgrobacteriumtumefaciens.

10. Limitacionesde losplásmidosTi
LosgenesT-DNAaunqueselocalizanenunplásmidobacteriano,ytienenun
origenclaramenteprocariótico,estánflanqueadosporseñales5´y3´quepermitensu
expresiónyfuncionamientoencélulasvegetales(Gheisenet al,1985).
Eldesarrollodelosvectoresdetransformaciónvegetalsebasaenlaideadeque,
exceptolassecuenciasdelosbordes,
ningúnotrogendelT-DNAesnecesarioparala
transformaciónylaintegraciónenlacélulavegetal.Porloquepuedensersustituidos
porunDNAexógeno,yaquecualquierDNAcomprendido entredichosbordesserá transferidoal
genomadelaplanta.
Pero estos los plásmidos Ti presentan ciertos inconvenientes, que como ya
mencionamos,tuvieronqueirsiendosolventadospocoapoco.
-Losgenesonctienenquesereliminados,asílascélulasvegetales transformadasno
proliferanenuntejidotumoralypuedenregenerarplantasnormales.Peroestoacarrea
uninconvenienteyesquealnoformarselostumores,lascélulastransformadas
son
fenotípicamenteindistinguibles
delascélulasnormales,porellodebenusarse
marcadoresquepermitanseleccionarlas célulastransformadas.
-Tambiéndebeneliminarselosgenesquecodificanlasopinas,yaquelaplanta
desvíapartedesusrecursosparasintetizarestoscompuestosylaproducciónfinal
obtenidaesmenor.
-LosplásmidosTisonlargosparaloexperimentosdederecombinaciónde
DNA(200,800kb),luegolossegmentosdeDNAquenosonnecesariosparaelclonage seeliminan.
LaeliminacióndeestossegmentosdeDNAesloqueseconoceconelnombrede
desarmedelplásmidoTi.
SISTEMAS DE VECTORES DERIVADOS DEL PLÁSMIDO TI
Unavezsuperadosloscontratiemposseñaladosenelpuntoanterior,atecnología
delDNA recombinante sededicóadiseñarvectoresbasadosenplásmidoTinatural. Estos
vectores, tienen una organización similar
y constan de los siguientes
componentes:
-Ungenmarcadorseleccionable, como laneomicinafosfotransferasaque confiere
resistencia alakanamicina alascélulasvegetalestransformadas.Lamayoríadelos genes
marcadoresutilizadossondeorigenprocariótico,por loquedebenponersebajo elcontrol

11. delaplanta,porellosehacenecesarioañadirunpromotory
unasecuencia
determinacióndepoliadenilación,
queregulenypermitanlatranscripcióndeestos
genesenlaplantabajolasseñalesadecuadas.(Normalmente,ademásdeungenmarcador para
seleccionarlas célulasvegetalestransformadas,se empleaun segundo marcadorque puede
consistirenungenseleccionableomascomúnmenteenungenparalasíntesisdeopinascomola
nopalina.Estesegundomarcadorvaapermitirqueseandetectadasaquellascélulastransformad
as que escaparondelrégimende seleccióninicial)
-UnorigendereplicaciónquelepermitaalplásmidoreplicarseenE.coli.En
algunosvectorestambiénsehaañadidounorigendereplicaciónquefuncioneen
A.tumefaciens.
-LasecuenciadelbordederechodelT-DNAcomomínimo,aunquealgunos
vectorestambiénincluyenlaizquierda.
-UnpolylinkerquefacilitelainsercióndelgenclonadoenlaregióndelT-DNA
entrelosdosbordes.
-Lugaresúnicosdereconocimentoparaendonucleasasderestricción,necesarios
paraclonarelgeno fragmentodeDNAdeinterésen el T-DNA.
- Un gen marcador bacteriano para seleccionar las células de E.coliy
Agrobacteriumquehanincorporadoel vector.
-El gen/genesquequeremosintroducirenlaplanta debenser tambiénañadidos,al
igualquelospromotoresnecesariosparasuexpresiónenlaplanta.
Laadicióndeestoselementosesloqueseconoceconelnombredearmadodel
nuevoplásmido.
PuestoquesinlosgenesvirestosvectoresnopuedeninsertarporsímismoselTDNAenlacélulavegetal,sehandiseñadodostiposdesistemasdevectoresderivados
delplásmidoTi, estossistemassonlosqueseutilizanenla actualidad:
-Sistemadevectorcointegrado(sistemacis):seintroducennuevosgenesenun
plásmidoTinooncogénicomedianterecombinaciónhomóloga(Zambriyskietal,
1983;Deblaereet al,1985).
-Sistemadevectorbinario(sistematrans):losnuevosgenessonclonadosenun
plásmidoquecontieneT-DNA
nooncogénico,esteplásmidoesposteriormente
introducidoenunavariedaddeAgrobacteriumqueposeeunplásmidoTiconuna
regiónvirintactaperoque carecedeT-DNA.
Encualquieradelosdoscasos,elDNAdeinterésprimeroseclonaenEcherichia
coliyposteriormentesetransfiereaAgrobacteriumporconjugación(VanHauteetal,

12. 1983)oelectroporación(Mersereauet al,1990).
Sistemasdevectorbinario:
El vectorbinariolleva:
-OrígenesdereplicacióntantoparaE.colicomoparaA.tumefaciens,oensu
defectounorigendereplicacióndeampliorango.
-UngenmarcadorseleccionabletantoparaE.colicomoparaA.tumefaciens.Tanto el
genmarcadorcomolos genesquese deseaseanexpresadospor la
insertadosentrelosbordesderechoeizquierdo.
El vectorbinarionolleva:
-Losgenesvir
Todos los pasos de clonaje se realizan en E. coliantes de que el vector sea introducidoen A.
tumefaciens.A. tumefacienspresentaun plásmido Ti con el set
completodegenesvirperonoconstadeT-DNA.AsíelplásmidoTidefectivosintetiza
logenesvirquepermitenlatransferenciadelT-DNAdelvectorbinario.
Se trataría de un vector binario que contiene el gen de interés y el gen
marcadorseleccionableentrelosbordes
delT-DNAyunplásmido
Tillamadoayudante
quecontiene losgenesvirnecesarios paraquelatransferenciaalgenoma vegetaltenga
lugar(deFramondetal,1983;
Hoeckemaetal,1983).
Esteeselsistemaquemasse
utilizaactualmente.
Figura:Vectorbinario.
Sistemasdevectorcointegrado:
El vectorcointegradolleva:

13. -ELorigendereplicacióndeE.coliynopuede existirautónomamenteenelinterior
deA.tumefaciens.
-MarcadorseleccionablequepuedeserutilizadotantoenE.colicomoen A.
tumefaciens.
-Marcadorseleccionableparalascélulasvegetalestransformadas.
-Losgenesdiana(ainsertarenl genomadelaplanta).
-El bordederechodelT-DNA.
-UnasecuenciadeDNAquepresentahomología respecto a un segmento del plásmidoTi
desarmado
El plásmidodesarmadoTi lleva:
-El bordeizquierdodelT-DNA
-El clusterdegenesvir
-UnorigendereplicaciónparaA.tumefaciens.
Figura:Vectorcointegrado
PeroesteplásmidoTidesarmadocarecede:bordederecho del T-DNAyde los
genesonc.ElvectorcointegradotienequeintegrarseenesteplásmidoTidesarmado
paraformarunplásmidoTi recombinante.

14. TantoelplásmidoTidesarmadocomoelvectorcointegradollevansecuenciasde
DNAhomólogasqueproporcionan
unlugarparalarecombinaciónhomólogainvivo,
normalmenteestasecuenciasselocalizandentrodelT-DNA.
Traslarecombinación
homólogaelvectorcointegradoseintegraenelplásmidoTiyesteproporcionalos
genesvir,necesarios
para
latrasferencia
delT-DNAaunampliorango
decélulas
vegetales.Laúnicaforma
dequeestosvectores
seanmantenidosenA.tumefacienses
comopartedeunaestructuracointegrada.
Elproblemaalahoradeutilizarestosvectoresesquesugrantamaño(normalmente
mayor
de10kb)dificultasumanipulación
invitro.Ademáslosplásmidostangrandes
tiendenatenermenossitiosderestricción
únicosparaelproceso
declonaje.Porellose
suelenutilizarvectoresbinariosdepequeño
tamañobasadosenlasecuenciadelvector
binariopBIN19.Estevectorpresenta
laventajadequesiguesiendo
funcionalaunquela
mayorpartedesuDNAseadeleccionada.Asísepuedeconstruirunvectorque,
en
lugar
delas11,8kbquepresentael
original,solamentetenga
3-5kb.Estevectorminibinario
sedenominapCB301 ysemuestraenla figuraadyacente.
Figura:VectorPcb301.Abreviaturas:oriV,partedelorigendereplicación;npt,
gendelaneomicinafosfotransferasa;trfA,partedel origendereplicación;RB, bordederechodel
T-DNA;MCS,sitiode
clonajemúltiple;LB,Bordeizquierdodel
TDNA;P35s,promotorconstitutivodel virusdel mosaicodela coliflor;TP,secuenciadela
proteínadiana;T35s,secuenciadeterminacióndela transcripcióndel gen35sdel virusdel
mosaicodela coliflor;bar,gendela fosfinotricinaacetiltransferasa.(Xianget al.,1999)
Dadoqueciertasregionesnecesariasparalaconjugaciónhansidodeleccionadas,
estevectornopuedesertransferido a A.tumefaciensporconjugación porloquetienen
queusarse mecanismosalternativos comolaelectroporación, delaquehablaremosmastarde.
VentajasqueofrecenlosvectoresderivadosdepCB301:
-Elgenbar,selocalizaadyacenteaunaregiónpromotorayaunaregiónde
terminacióndelatranscripión,
codificaporelenzimafosfinotricínacetíltransferasaque
esinsertadaenelsitiodeclonaciónmúltiple.Lasplantastransformadasloexpresany

15. sonfácilmentedetectadas.
- Adyacenteal genbarperoen orientaciónopuestase localiza un casete que
incluye:unpromotor35S;unasecuenciadeDNAquecodificaproteínasqueseexpresa
tantoenmitocondriascomoencloroplastos;
unelementodeunióntransnacionalque
incrementaelniveldeexpresión
delaproteínacodificadaporelgenanterior;una
porcióndelsitiodeclonación múltipley unasecuencia determinacióndela transcripción.
- Estos vectores derivados son flexibles, fáciles de usar y contienen una
ampliagamadesitiosderestricciónúnicos.
2.2.-Agrobacteriumrhizogenes
ExisteotrafamiliadeplásmidosdeAgrobacteriumquepodríaservirdevectoresde
genesparalaobtención
deplantassanas,genéticamentemodificadas.Provocanuna
proliferacióndelasraícesdenominada“raízencabellera”,enlaplantasinfectadaspor
A.rhizogenesyse
llamanplásmidosRi(de
rootinducing).
Lasraíces,comoeltejidode
laagalla,crecenrápidamenteenun cultivolibredebacterias.
JacquesTempéysuscolegasdel InstitutonacionalFrancésde Investigaciones
Agronómicas,
demostraronquelascélulasdelasraícescontienenopinasyT-DNA.Al
igualquelosplásmidos
Tidelmutanteraícesdelanopalina,
losplásmidosRidan
origenacélulasvegetalestransformadasque puedenregenerarplantasfértilesintactasy sanas.
EstosplásmidosRiparecenservectoresdesarmadossinviolenciaexteriorylos
procedimientos
paratransformar
plantasutilizándolossonbastantesimilaresalosdeA.
tumefacienspor
loquenonosextenderemosmasydaremospasoaotrotipodetécnicas
quepermitenlatransferenciadirectadeDNA
3.-VECTORESVIRALES:
Losvectoresviralesnohansatisfecho lasexpectativassobresuusoenIngeniería Genética
deplantas,perosítienenelpotencialdecomplementar
lastecnologías
existentesdetransferenciadirectadegenesytransformaciónmedianteAgrobacteriumde
manera efectiva. Se pueden infectar de forma sistémica plantas completas e
investigarasílaexpresión
génicaenlosdiferentestejidos.Lainfecciónsistémicatiene
lugardeformatípicaendíasosemanas,noenmeses,
ylaspartículasviralesse
acumulanenaltosnivelesconduciendo alaamplificacióngénicay alaposibilidadde expresión
agranescala.Sinembargo,losvirusdescubiertoshastaahoranoseintegran
enelgenoma
huésped,y
latransmisión
atravésdelalíneagerminalnohasidoposible.
Tambiénexistenproblemas conrespecto alaexistenciadeunrangodehospedadores limitadoy
problemasdeempaquetamientosegúneltamañodelinsertoenvectores virales.

16. Existendosgruposdiferenciadosdevirusvegetales,losvirusDNAylosvirus
RNA. Engeneral,losvirusdeRNA tienensucicloenelcitoplasmamientrasquelos virusdeDNA
pueden tenersureplicaciónasociadaalnúcleo.Deestamanera,losvirus deDNA presentan
mecanismosderegulación similaresalosdelaplantahuésped, mientras quelosvirusdeRNA
tienenmecanismosderegulacióngeneralmente diferentes.LosvirusDNAconstituyen sóloel12%delosvirusvegetalesquese
conocen(Lebeurier,1986).Puedensubdividirse
endosgrupos:loscaulimovirusde
doblecadenay
losgeminivirusdecadenasencilla.Debidoaqueesmásfáciltrabajar
convirusDNA,
lamayorpartedeltrabajoendesarrollodevectoresviralessellevaa caboenestosvirus.
1.-VIRUSDNA
Caulimovirus:
Figura:Visiónalmicroscopiodepartículasvirales decaulimovirusinfectandountejidovegetal.
ExistenalmenosdocemiembrosdelaFamiliaCaulimoviridae(HullyDavies,
1983),ydeellosel mejorcaracterizadoesel virusdelmosaicodelacoliflor(CaMV).
ElCaMVposeeungenomaconDNAdedoblecadenadeaproximadamente8
kilobases,
yconunrango
limitadodehospedadores,
ensumayoríacrucíferascomola
colifloryelnabo.Losáfidossonlosvectores
detransmisión
naturales;sinembargo,
tambiénsepuedeproducir
infecciónmedianteinoculación
mecánicayagroinfección(usodeAgrobacteriumcomovectorparafacilitarlainfecciónviraldepla
ntas).
ElDNAviralsetranscribeenelnúcleodelascélulasinfectadasmediantelaRNA
polimerasaIIcodificadaporelgenomavegetal.Seproducen
dostranscritos
principalmente,unRNA35scorrespondientealDNAviralcompletoconunarepetición
terminalde180pb,yunRNAmensajerosubgenómico
19squeterminaenelmismo
punto
queelRNA35s.Hay
ochopautasdelecturaabiertapotenciales(ORFs).El
transcrito19sprobablementecodificaelORFIV,responsable
deldesarrollodelos
síntomas(Baughmanetal.,1988).
Sehapropuesto
quelosotrosORFssontraducidos

17. desdeeltranscrito35smedianteunmecanismo(“relayrace”)enelquelosribosomas
parandespuésdepasarelcodóndeterminacióndeuntranscrito,y sereinician enel siguiente
codóndeiniciación deltranscrito. TambiénsehasugeridoquelosORFsIVy Vpodríanexpresarse
comounalargaproteínaprecursoraqueseríaposteriormente
modificadaparaproducirdosproteínasfuncionales.
El virus se replica mediante el primingdel transcrito 35s con un tRNA-met
codificadoporelhospedador,seguidadelasíntesisdelacadenamenos(-)deDNA
catalizadaporuna reversotranscriptasacodificadaporel virus.
ElORFIIesunfactordetransmisiónporáfidos(Daubertetal.,1983)ynoes
esencialparalainfectividadviralcomounhechonatural.Gronenbornetal.(1981)
clonaronconéxitoDNAextrañoenelORFIIyencontraronquemayortamañode
DNAquesepodíaintroducirdeestamaneraeradeaproximadamente250pb.Brissonet
al.
(1984)remplazaronORF II con un pequeño(234pb)debacterianoquecodificapara
ladihidrofolatoreductasa(dhfr),elcualfueexpresadoypropagadodeformaestableen
plantasdenabo. Estegenconfiereresistenciaalmetotrexato,y lasplantasdenaboque fueron
infectadasconCaMVqueconteníaestegendhfrresultaronresistentesadicho
compuesto.Seencontróquecuandoalgunadelasconstrucciones
teníaunaextensa
regiónnocodificanteentreel final de ORF I y el principiode dhfr, entonces la construcción
erainestableparaeltránsitoalaplantayexpresabaelgenenmenor
medida.Estasensibilidad
altamañodelassecuenciasintergénicashalladaenCaMVmuestralo cuidadosquehayqueseren
el diseñodeestetipodevectores.
En el vector CaMVsimple el tamaño límite de los insertos clonados es
probablementedeunas800pb(mediantedelecciónyadición).Sesugirióotra
aproximacióndiferente,queeslaconstruccióndemutantescomplementarios,talesque
el“vector”mutantetransporte
elDNAextrañoysólounaspocasdelasfuncionesde
CaMV,yelotromutanteportetodoslosORFsdeCaMV(peroesdeficienteenlos
ORFsqueportanel“vector”.Estaaproximación
hasidotestada(Choeetal.,1985);se
contruyeronparesdecomplementarios,mutantesnoinfectivosCaMVqueseusaronen
unainfección
mixta.Seconsiguió
unainfecciónconéxito,perosucesos
de
recombinacióneliminaron
elDNAexógeno.Laaltafrecuencia
derecombinaciónde
CaMVsehabíaobservadoyaconanterioridad
(WaldenyHowell,1982).Quizás,silos
mutantesdefectivoscomplementarios
pudiesenconstruirsesinhomología,oconmuy
poca,estaaproximación
deldiseñodelvectorresultaríafructífera.Pazkowskietal.
(1986)intentarontambién usarlacomplementacióncomo unarutaparalautilizaciónde
CaMVcomo vector; remplazaronelORF IV(traducidodeltranscrito 19s)conlaregión
codificadoradeNPTII.Desafortunadamente,
estemutantenofueinfectivotantoporsí
mismocomocuandoeracomplementado
porlacepasalvajedelvirus.ElgenNPTII
se
expresóapartirdelpromotorviralcuandoelvirusmutantefuetransferido alos protoplastos
denabomediantetransferenciadirectadegenes,peronohuboescapedel
virus,ylassecuenciasviralesseasociaronsóloconDNAgenómicode altopeso molecular.

18. OtraaproximaciónalacomplementaciónenlosvectoresCaMVseríaintroducirun
genomadeunvirusdefectivocomplementario
dentrodelgenomadelaplantamediante
agroinfección(transformaciónmediadaporAgrobacterium).
Éstepodríaconstituirun
sistemaequivalentealsistemadecélulasCOSparalapropagación
devectoresbasados
enelvirusSV40defectivodemamíferos(Gluzman,1981).Lavalidezdeestemétodo
envectoresbasadosenCaMVaúnempiezaainvestigarse.EltrabajodePazkowskiet
al.(1986)
diolugaralademostración
dequelosproductosgénicosdelosgenomasde
CaMVmutantesclonados enplantaspuedenserexpresados. Shewmakeretal.(1985) clonaron
unacopiaenteradeCaMVenunagranvariedaddeespeciesvegetales,y
mostraron
que
tantoeltranscrito19scomoel35ssonexpresados(adistintosniveles
según
laespecie).Además,Waldenhaconseguidoplantasdetabaco(fuera delrangode hospedadores
normaldeCaMV)quecontienendímerosdeCaMVymuestraqueel
homogenizadodelahojadeestasplantasesinfecciosocuandoseinoculaennabo;pero
aúnnoestáclarosielvirus
se
replicaeneltabaco,osílainfeccióndelnaboestá
mediadaporlostranscritos19sy
35s.Quizáseltabaco,queesmássusceptible
a
transformacióngenética,puedausarsecomomodelopara estesistema.
Recientementenuevosestudiosproponenelusodeestosviruscomovectores.El
másprometedor,desarrolladoporHullet al. (2005)proponeunsistema deactivaciónde
transgénmediadaporelvirusCaMV.Apesardeello,elsistemadetransformación
vegetalmediadaporcaulimovirus
sigue,hoy
endía,sinconstituirunsistemaeficazy
conaplicabilidadenesteterreno
Geminivirus:

19. Figura:Visiónalmicroscopiodepartículasvirales degeminivirusinfectandountejido vegetal.
Losgeminivirus(revisadoporDaviesetal.,1987;Harrison,1985;Stanley,1985)
sonvirusDNAdecadenasencillaquesereplicanenelnúcleodelascélulasmediante
unDNA
intermediario
dedoble
cadena.Copiasclonadas
devariosmiembrosdelos
geminivirussontransmisiblesaunampliorangodehospedadores,queincluyentantoa
monocotiledóneascomoadicotiledóneas(Harrison,1985).
En la literaturase presentanevidencias de algunas enfermedadescausadas por
geminivirus desde hacevariossiglos.Estasenfermedades secaracterizanpor presentar
síntomascomoenrollamientodelahoja,rugosidad,mosaicosamarillos,enanismodela
planta,clorosisygeneralmente unadisminución enelrendimiento. Sinembargo,fueen
ladécadadelosaños1970cuandosedeterminóqueelagentecausaldeuna
enfermedad
queproducía
unmosaicodoradoenyucaeraunvirusconcaracterísticasúnicasque
incluíanunamorfología geminada(dosicosahedrosunidosporunlado)yungenoma circular
deDNA
decadenasencilla.Apartirdeentonces,elnúmerodegeminivirusregistrados
haidocreciendoaceleradamentehastallegaraserunadelasfamiliasmás
numerosas.Losgeminivirus sonunafamiliadeviruspatógenosdeplantasqueson transmitidos
porinsectosvectoresaunagranvariedaddeplantasmonocotiledóneasy
dicotiledóneas.Ladistribucióngeográfica delinsectovectoreslaresponsable dela distribución
paraleladelgeminivirusquetransmite.LafamiliaGeminiviridaesedivide
en
tresgénerossegúnsu
espectrodehuéspedes(si
infectanmonoodicotiledóneas),asu
insectovector(moscablancaochicharrita),y
asuestructuragenómica(monoo
bipartita).Aquellos virustransmitidos porlachicharrita tienen,porlogeneral,genomas
monopartitos,
mientrasquelostransmitidosporlamoscablancatienengenomas
bipartitos.Losmiembrosdeestaclasehan sido recientementepropuestoscomo vectores
vegetales.
Además del interés que los geminivirusdespertaroncomo agentes causales de
muchasenfermedadesdeimportanciaeconómica,elhechodetenerungenomade DNAatrajo
laatencióndemuchosgruposquesededicaronaexplorarla
posibilidadde
usarlosgeminiviruscomo vectorespara laintroducciónde materialgenéticoenplantas.
Unasegundarazónpoderosaeralaperspectivadeusarlosgeminiviruscomomodelos

20. deestudiodemanerasimilaralostrabajosrealizadosconbacteriófagos
amediadosdel
siglopasadoounpocomástardeconalgunos
virus
deDNA
(SV40,adenovirus)en
sistemasanimales.Laposibilidaddeusar
losgeminiviruscomovectoresparaintroducir
DNAforáneoenplantasha ido perdiendointerésalverificarseque estos viruspresentan
restricciónalaumentodetamañodesugenoma,esdecir,cuandoselesintroducen
genesforáneos
queaumentaneltamañodelgenomalosvirusquiméricostiendena
eliminareseDNA
enunintentoderecuperar
sutamañooriginal.
Porotrolado,los
geminivirussíestánrespondiendo
alasexpectativasdeserusadoscomomodelospara
estudiaralgunosprocesosmolecularesenplantas.
Elgenomadelviruslatentedelayuca(CassavaLatentVirusCLV)consisteen
doscomponentesdenominados DNA1yDNA2.ElDNA1codificafunciones esencialesparala
replicación,peronoparalainfecciónsistémica o latransmisióncélula a célula(Townsendet
al.1986);tambiénsehadescubiertoqueesteDNA1codificauna
proteínadelacubiertaquenoesesencialparalainfectividad(StanleyyTownsand,
1986).Wardetal.(1988)mostraronque,aunqueladeleccióndelgenquecodificapara laproteína
delacubiertasuprimelainfectividadmedianteinoculación
manualcon
moléculaslinealesdeDNA
1y
DNA2,losmutantesenlosqueseremplazapor
secuenciasdetamañosimilar sontotalmente infecciosos.Cuando elgen deestaproteína
sesustituyeporelgenCATbacterianoyelDNA1diseñadoseinoculaenNicotiana
benthamianajuntoconeltiposalvajedeDNA2,lasplantasdesarrollansíntomas
normales
deinfección,y
CATseexpresasistemáticamenteenaltosniveles(80
unidades/mgdeproteínasoluble)10díasdespuésdelainoculación.Los mutantes defectivosde
complementacióndeCLVsufrenfrecuentementerecombinaciónpara
originarel
virusdetiposalvaje(Wardet
al.,1988).Sinembargo,nose
observó
inestabilidadenlaexpresiónvíricadeldenCAT,presumiblementeporquenoexistía
unapresiónselectivapara ladeleccióndelgen.
Hayesetal.(1988)realizaronuntrabajosimilarconelvirusdelmosaicodorado
deltomate
(TGMV).ElTGMV
tieneungenomabipartitodedosmoléculascirculares
deDNAdecadenasencilla,aproximadamente
de2,5kb(DNAAyDNAB).Laúnica
homologíaentrelasdos
cadenaseslallamada“regióncomún”deunas
200pb.Hayeset
al.(1988)encontraron
que,cuandolasplantasdetabacodetiposalvajeson
agroinfectadasconbacteriasquecontienen(dentrodelmismoT-DNA)odímerosde
DNAAy
DNAB,oundímeroparcialdeAy undímerodeB,oundímerodeByun dímeroparcialdeAcon
ausencia deunapartedelgenquecodifica laproteínadela cubierta, lainfección sistémica
seconsiguefácilmente.Lainfecciónsistémicase
consigue
tambiéncuandolasplantassonagroinfectadasconunamezclaconunacepa
quecontieneundímerodeAy
otracepaquecontieneundímero
deB.Sehasugerido
quelapartículaApuedecodificalasfunciones
necesariasparalareplicación,yquela
partículaBcodificalasfunciones
relacionados
conlatransmisióncélulaacélulayel
desarrollodelossíntomas.
Hayesetal. (1988)construyeronvectores en loscuales la regiónque codificaNPTII
sustituye
alaregiónquecodificalaproteínadelacubierta,yrealizaronapartirdeaquí

21. sistemasdeagroinfecciónenplantasdetabaco.Estosvectoresconteníano1,6copias
repetidasen
tándemdelaregión
quecodifica
NPTII
delDNAAdelTGMV
(pBIN19A1.6neo),olomismomásdoscopiasdedelDNABdeTGMV(pBIN19A1.6
neoB2)entrelosbordesdelT-DNA
deAgrobacterium.Lasplantasdetabacodetipo
salvajefueronagroinfectadasconpBIN19A1.6neoB2,ylasplantastransgénicasB2
(queconteníanelDNABdeTGMVintegrado
enelgenoma)
fueron
agroinfectadascon
pBIN19A1.6
neo.Cuatrodelas20plantasdelprimertipo,y18delas20delsegundo
fueroninfectadassistemáticamentetalycomosedeterminómedianteunanálisisdotblotdeDN
Ausandosondas específicaspara DNAAyDNABdeTGMV.Ningunasde las plantas neoinfectadasmostraron
síntomas.
Las
infecciones
fueron
confirmadas
medianteSouthernBlot;seencontraron
formasdelDNAviralsuperenrrolladasyen
círculoabiertodeltamañoesperado.
Cuandoseusaronplantasdeltiposalvajesinneo
pBIN19A1.6B2parainfectarplantasdetabaco,lainfecciónfuemáseficiente.
También se construyeron plantas que contenían A1.6neo integrado en su
cromosoma.MedianteSouthernblotreencontróenelDNAdelaplantalasformas
mononméricas
delDNA
AneodeTGMV
(conlaregióncodificantedeNPTIIenlugar
delgendelaproteína
delacubierta.Eltamaño
delNTPIIexpresadoenelDNAAde
TGMVesde2708pb, en comparacióncon el DNAA dela cepasalvaje,queesde2588
pb.Eltamañolímitedeestevectorhasidoampliadomediantelaintroducción
dela
regióncodificanteparalaglucuronidasa(GUS)enelsitiodeNPTII;esunaumentode
600pb.
ExistenvariasdiferenciasinteresantesentreeltrabajoconCMVyconTGMV.La
pérdidadeinfectividadobservado
enlosmutantesCLVpordeleccióndegenparala
proteínadecubiertanosehaobservado
enlosmutantesTGMVpordeleccióndelgen
paralaproteína
decubierta,
locualsugierequequizáseltamañoobligadoenCMVes
másreducidoenCMVqueenTGMV.Además,laconstrucción
deTGMVprodujo
plantasasintomáticas,
adiferencia
deCMV.Debido
aqueelgenmarcador,el
hospedadoryelmétododeinfeccióndifierenenlosdosexperimentos,noestáclarosi
lasdiferenciasobservadas
fuerondebidasalosvirusoalaformaenquelos
experimentosfueronllevadosacabo.
Losvectoresbasadosengeminivirusparecenconstituirunaenormepromesaen
cuantoaaplicabilidad.Puedenproporcionar
mecanismoseficientesdeamplificación
génicaenplantas, tantopor infección sistémica deplantasconelvectorproporcionando
unrápidoensayodeexpresióngénica,oporproducirplantastransgénicasparaun
dímeroparcialdelvectorproporcionandoamplificacióngénicaheredable.Aúnnoseha
determinadoellímiteencuantoaltamañodelDNAforáneoquesepuedereplicarpor unvector
deeste tipo, pero noestá limitadoporrestricciones encuantoa encapsulamiento,
comoenelcasodeloscaulimovirus.Además,elrangode
hospedadoresdelosgeminivirusesmuyelevado.