QUORUM SENSING REGULA LA FORMACIÓ DE BIOFILM ENVIBRIO SCOPHTHALMI - XRB Annual Meeting 2012

1. El quorum sensing regula la formació
de biofilm enVibrio scophthalmi
13 de juliol de 2012

2. Què és el quorum sensing?
R
E
- Producció d’antibiòtics
S
- Alliberació de factors de virulència
P
- Swarming
O
- Formació d’endòspores
- Formació de biofilm
S
- Síntesi d’exopolisacàrids
T
A

3. Tipus d’autoinductors

4. Vibrio fischeri
Engebrecht J & Silverman M (1984) Identification of genes and
gene products necessary for bacterial bioluminescence. Proc Natl
Acad Sci U S A 81: 4154-4158.

5. Diversitat de circuits de QS…
V. harveyi, V. cholerae…
Waters, C.M. and Bassler, B.L. 2005. Quorum Sensing: cell-to-cell communication in
bacteria. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21:319-346.

6. El cas de Vibrio scophthalmi…
Especificitat alta amb el turbot tot i que no
és l’espècie més abundant a l’aigua de
mar on viuen aquests peixos*
* Cerdà-Cuéllar et al. 1997. Vibrio scophthalmi sp. nov., a
new species from turbot (Scophthalmus maximus).
International Journal of Systematic Bacteriology 47(1); 58-61.
HIPÒTESI DE TREBALL
La colonització de l’intestí del turbot per aquesta espècie
podria estar regulada per mecanismes de quorum sensing?

7. Objectius
- Quins circuits de quorum sensing presenta?
- Quines funcions regulen?

8. Materials i mètodes
Detecció d’AHLs Detecció de l’AI-2
- Extracció d’AHLs - Detecció en el sobrenedant
utilitzant la soca biosensora de l’AI-2
de V. harveyi BB886 (AI-1 +, AI-2 -).
- Separació AHLs mitjançant
cromatografia en capa fina i
detecció amb el biosensor - Detecció i seqüenciació de la seva
d’AHLs A. tumefaciens NTL4 sintasa, luxS, mitjançant PCR
utilitzant encebadors degenerats.
- Identificació mitjançant espectrometria
de masses

9. Materials i mètodes
DETECCIÓ DE GENS IMPLICATS EN LA TRANSDUCCIÓ DEL SENYAL
luxR V. harveyi-like, luxR V.fisheri-like, luxN
- Detecció gens mitjançant - Seqüenciació complerta del
encebadors degenerats. gen mitjançant PCR inversa.
ER
Control negatiu
V. scophthalmi
PhiX174HaeIII
ER
V. vulnificus
Encebador1 Encebador 2
Seqüència ADN coneguda
Regió desconeguda
PCR
Digestió i lligació
luxR
Seq. coneguda
Seq. desconeguda
ER: enzim de restricció

10. Materials i mètodes
SEQÜENCIACIÓ GENÒMICA DE V. scophthalmi (soques A089 i A102)
Sequenciador 454 (Roche Diagnostics) i ensamblatge amb el programa Newbler
Identificació d’altres gens relacionats amb circuits
de quorum sensing en vibris

11. Materials i mètodes
IDENTIFICACIÓ DE FUNCIONS REGULADES PER QUORUM SENSING
Creació de recombinants productors Creació de mutants amb els gens
de la lactonasa Aiia de Bacillus sp. luxS i luxR delecionats

12. Materials i mètodes
IDENTIFICACIÓ DE FUNCIONS REGULADES PER QUORUM SENSING
- Cinètica de creixement
- Motilitat
- Formació de biofilm en microplaques de poliestirè

13. Resultats
Detecció d’autoinductors A089 A102
- Detecció de 3 molècules activadores del 1
biosensor A. tumefaciens NTL4
2
3
- Identificació de la molècula 3 com a
una AHL amb una m/z de 300.2414
corresponent amb una N-(3-hidroxi-
dodecanoil)-L-homoserin lactona

14. Resultats
- Detecció de l’autoinductor AI-2 en els sobrenedants de
V. scophthalmi
12000 2
1,8
10000
1,6
relative light units
1,4
8000
OD 600 nm
1,2
6000 1
0,8
4000
0,6
0,4
2000
0,2
0 0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
hours
- Detecció i seqüenciació del gen codificant per la seva
sintasa (519 bp amplimer):
Similitud del 78% amb el gen luxS de V. vulnificus.

15. Resultats
Detecció de gens implicats en la transducció del senyal (PCR)
-Detecció i seqüenciació del gen luxR V. harveyi-like (615 bp):
Similitud del 75% amb el gen luxR de V. vulnificus.
-Els gens luxR V. fischeri-like i luxN no van ser detectats mitjançant l’amplificació
mitjançant PCR utilitzant encebadors degenerats.

16. Resultats
Detecció de gens implicats en la transducció del senyal (seqüenciació genòmica)
- En el cas de la soca A089 es van obtenir un total de 287 contigs que es van
agrupar en 20 scaffolds representant un total de 4.5 Mb.
- En el cas de la soca A102 es van obtenir un total de 223 contigs que es van
agrupar en 4 scaffolds representant un total de 4.45 Mb.
- En ambdues soques es van detectar homòlegs dels següents gens implicats en
la transducció del senyal:

17. Resultats
Funcions regulades pels circuits QS en V. scophthalmi
Efecte de les AHLs en el creixement Efecte de les AHLs en la motilitat
pACYC pACYC-aiiA
% motilitat 100 49,39
SD 16,76

18. Resultats
Funcions regulades pels circuits QS en V. scophthalmi
Efecte de la deleció de luxR i luxS en la formació de biofilms
C- wt ∆luxR ∆luxS

19. Resultats
Efecte de la deleció de luxR i luxS en les proteïnes de membrana externa
∆luxS
∆luxR
wt

20. Conclusions
- Vibrio scophthalmi presenta uns circuits de quorum sensing similars
als que presenta V. harveyi.
-V. scophthalmi produeix 3 molècules del tipus AHL una de les quals es va
identificar com a N-(3-hidroxi)-L-homoserin lactona, tot i que es desconeix
la seqüència de la seva sintasa.
- La disminució de la concentració d’aquestes AHLs mitjançant la lactonasa AiiA
de Bacillus sp. provoca una disminució en la taxa de creixement.
- El regulador luxR regula positivament la formació de biofilm a elevades
densitats cel·lulars.
- La deleció del gen luxS disminueix la formació de biofilm.
- V. scophthalmi té un gen codificant pel receptor de l’autoinductor CqsA,
el gen cqsS, tot i que no s’ha identificat el gen codificant per aquest
autoinductor.

21. AGRAÏMENTS: