TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR: se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas.

1. II Semestre
Facultad de me medicina
ZOHAR ESTRADA CASSIANI
DANIELA CASTILLO CRISMATT
FRANCO ALANDETE VICTOR HUGO

2. En principio se denomina así a todas las técnicas
de laboratorio que se usan para aislar ADN o
extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su
estado, cortarlo y pegarlo, amplificar una región
en una enorme cantidad de moléculas (clonación
de fragmentos en bacterias u otros vectores
como virus , PCR Etc.

3. Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el
diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos mas o
menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa
seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos ,
diagnóstico viral o de infección viral (VIH, Hepatitis C, PIF, otros),
selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento
genético de una especie, test de paternidad, diagnóstico de identidad
forense, etc.

4. La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del
ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque
usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados
de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del
medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir
purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

5. La figura muestra el pellet de
células a partir del cual se
obtendrá el ADN
Así se ve el ADN recién extraído en
alcohol.

7. Conocer:
• Los fundamentos de la técnica de amplificación de ADN
por PCR
• Usos y aplicaciones de PCR
• Ventajas y desventajas del PCR

8. • Es la amplificación de ADN in vitro por medio de la
polimeracion de cadena de ADN utilizando un
termociclador.
• Es propósito del PCR es hacer muchas copias de un
fragmento de ADN
• Se realiza la amplificación de un segmento especifico
de ADN, teniendo poco material disponible.

9. • Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis
en 1987
• Gano el premio nobel de química en
1993 por su invento
• Utilizo el PCR para amplificación del
gen de β- hemoglobina humana, y el
diagnostico prenatal de anemia
falciforme.

10. • La PCR se realiza en un “ thermo
cycler” o termociclador
* Es una maquina que calienta y
enfría la reacción de periodos cortos
de tiempo.

11. 1: DESNATURALIZACION: Consiste en separar la doble hebra de ADN y
convertirla en hebra sencilla.
Típicamente se usa a una temperatura de 25°C – 95°, Por 15 a 40 segundos
El tiempo depende del tamaño del genoma

12. 2: APAREAMIENTO O “ANNELING”:
Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la
hebra sencilla del ADN y se pega a lugares específicos por
complementariedad de base. Por eso se deja bajar la temperatura
Ej: 55° C por 30 segundos. La temperatura y el tiempo puede variar
entre cebadores según sea el caso.

13. 3. POLIMERACION O EXTENSION.
Una polimerasa de ADN extiende los “primers” en el espacio
comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos
trifosfatados (dNTP´s) de 5´a 3´leyendo el ADN de 3´a 5. de
esta forma se sintetiza la secuencia complementaria de las
hebras de ADN molde.

16. • En un principio, la polimerasa de ADN que se utilizaba
era de bacterias E.Coli, pero esta es sensitiva a altas
temperaturas, por lo que había que añadir enzimas
fresca al comenzar el tercer ciclo.
• Se remplazo la enzima por la de la bacteria “ thermus
aquaticus” conocida como Taq pol

17. • La detección del producto de la PCR se
realiza normalmente mediante corrido
electroforético.
• Dependiendo del tamaño de la
amplificación y la resolución que
deseamos utilizaremos diferentes medios
(agarosa, poliacrilamida) a distintas
concentraciones.

18. La posterior visualización se puede realizar por bromuro
de etidio (lámpara de luz UV) Tinción de plata,
fluorescencia, radioactividad

19. • Detección de agentes infecciosos como : hepatitis B y C,
papiloma virus, VIH, entre otros.
• Análisis de ADN de cualquier organismo vivo o muerto, análisis
de fósiles.
• Mutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a
través de los “primers” con mutaciones)
• Investigación forense
• Pruebas de paternidad

21. • A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una
cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.
• El proceso se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.
• Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
• Sus aplicaciones son multiples,
análisis prenatales, etc.
medicina
forense,
diagnostico,

22. • Se puede reproducir solamente parte del genoma en donde se
conoce por lo menos una mínima secuencia 20 – 40 pd
• Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al
fragmento que se desea sintetizar.
• La polimeracion puede tener errores al sintetizar el ADN.
• Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo
investigador o de cualquier otro)

23. Electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la biología
molecular. El principio básico es ADN, ARN, y proteínas que pueden ser separadas
por medio de un campo eléctrico. El ADN y ARN pueden separarse de tamaño
ejecutando el ADN a través de un gel de agarosa. Las proteínas pueden separarse
de tamaño mediante el uso de un gel de SDS-PAGE
Se utiliza generalmente con
propósitos analíticos, pero puede
ser una técnica preparativa para
purificar moléculas parcialmente
antes de aplicar espectrometría de
masa, PCR, clonación o
secuenciación de ADN.

25. Son un tipo de biochip : es un dispositivo a pequeña escala, análogo a un
circuito integrado, ensamblado de moléculas orgánicas asociadas a
organismos vivos
En este caso las moléculas orgánicas son fragmentos de ADN
seleccionados del genoma.
Estos microrrays son pequeños dispositivos
de cristal con orificios rellenos de ADN
marcados con sustancia fluorescente

26.  Para detectar anomalías del ADN (delecciones ,
duplicaciones, etc.)
 Para diagnosticar enfermedades que causan
alteraciones en el ADN: ( Cáncer, Esquizofrenia, Autismo
etc.)
 Para simples diagnósticos.
 Para reparar genes alterados.

28. EDWIN SOUTHERN DESARROLLO ESTA TECNICA EN 1975

29.  Sirve para detectar por hidrolisis la presencia de una porción
de ADN en una muestra.
 Fundamento: complementariedad de bases
 Se diseña una sonda con nucleótidos marcados que sean
complementarios al sector de ADN buscado.
 El sector de ADN buscado puede ser un gen, o parte del mismo.
Se puede utilizar para el diagnostico molecular de patologías
genéticas.

30. HIBRIDACION.
 La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDAmuestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es
la muestra en simple cadena)
 Los nucleótidos de la sonda están marcados P 32 (radiactivos) si al
revelar hay marcador radiactivo presente, esta en la muestra analiza
la secuencia complementaria a la sonda.

31.  Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba
 Se lava para quitar el máximo de hibridaciones inespecificas.
 Se revela por auto radiografía.

33.  Extracción del ADN
Fragmentar en ADN en porciones mas pequeñas (enzimas
de restricción)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforética usando como sustrato de migración un
gel (separación por tamaño)

34.  Desnaturalización con solución salina alcalina ( SIMPLE CADENA)
 Transferencia a soporte solido (membrana de nylon / nitrocelulosa): por
capilaridad o electroforesis: pasan del gel a la membrana.
 Se agrega solución (NaCl) para evitar rehibridación previa al colocar la
sonda.

37.  Es una técnica analítica usada para detectar proteínas especificas en
una muestra determinada. Mediante una electroforesis en gel se
separan las proteínas.
 Las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana
electroforética

40. Se utiliza para estudiar los patrones de expresión de un tipo
específico de la molécula de ARN como comparación relativa entre
un conjunto de diferentes muestras de ARN. Es esencialmente una
combinación de desnaturalización electroforesis en gel RNA y una
mancha. En este proceso de ARN está separado basado en tamaño y
es transferido a una membrana que luego es sondeada con un
etiquetado como complemento de una secuencia de interés.

44.  Seminario de fundamento y procedimiento de las pruebas de WESTERN BLOT
http://www.slideshare.net/tratamiento1/fundamento-y-procedimiento-de-las-pruebas-de-westernblot?from_search=4
 Newmwdical : técnicas de biología molecular
http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-(Spanish).aspx
 Blot educativo de genética clásica y estructural (técnicas de biología molecular)
http://genmolecular.wordpress.com/tecnicas-de-biologia-molecular/
 Amplificación de ADN in vitrio: PCR (polymerase chain reaction)
http://www.slideshare.net/svls89/pcr-2899058
 Seminario de genética : técnicas de biología molecular
http://www.slideshare.net/BernardoOro/tecnicas-de-biologa-molecular
 MICRORRAYS DESENMASCARAN ENFERMEDADES ESCONDIDAS
http://www.slideshare.net/jkv/micro-arrays-presentation
 Wikiperdia: Western blot
http://es.wikipedia.org/wiki/Western_blot