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Resumo de microbiologia Diagnostica      1

1 – Fundamentos laboratoriais do diagnostico microbiológico


O diagnostico microbiológico :

- Auxilia no diagnostico e tratamento das doenças infecciosas, avalia e monitora a terapêutica antimicrobiana, ajuda
a controlar infecções hospitalares (determinando as medidas de controle das infecções).

- Determina o perfil de sensibilidade e avalia o surgimento de resistência antimicrobiana.

O medico deve: solicitar o exame qdo indicado, na requisição deve conter os dados que possam auxiliar o
laboratório, interpretar corretamente os resultados para instituir a terapêutica mais adequada, e sempre que
necessário comunicar-se com o laboratório.

O laboratório deve: coletar e transportar o material de forma adequada, identificar as amostras, selecionar as
técnicas mais adequadas para cada caso, emitir os laudos, auxiliar o medico na interpretação dos exames.

O laboratório de microbiologia deve se estruturar adequadamente para isolamento, identificação e perfil de
sensibilidade, avaliar a qualidade do material clinico coleta e ter critérios para rejeição das amostras.



Procedimentos iniciais em microbiologia clinica




Princípios – a semeadura primaria adequada é uma das mais importantes e fundamentais etapas da rotina na
microbiologia. Qdo a coleta é realizada em outro lugar (hospitais e clinicas) se deve observar data e horário da
coleta, natureza do material clinico, sitio anatômico da coleta. A escolha dos meios de cultura mais apropriados,
temperatura, atmosfera e tempo de incubação garantem o sucesso do diagnostico.
Resumo de microbiologia Diagnostica       2

Qualquer material pode ser processado para cultura: Urina, Fezes, Escarro, Lavado brônquico, Líquor, Esperma,
Fragmento de tecido, Líquidos orgânicos , Secreções em geral.



   •   COLETA E TRANSPORTE - os materiais devem ser coletados e enviados ao laboratório em meios de
       transporte e/ou frascos adequados para cada tipo de material, de acordo com o exame solicitado. Alguns
       exemplos são:

       - Frascos de coleta com boca larga e tampa de rosca para coleta de fezes, urina ou escarro.

       - Swab com meio Stuart ou AMIES para Isolamento de bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas

       - Swab com Meio de Stuart ou AMIES com carvão ativado – para isolamento de bactérias aeróbias e
anaeróbias facultativas, preferencialmente para isolamento de gonococos, hemófilos e pneumococos.

       - Meio Cary Blair – conservante de fezes para isolamento de enteropatógenos

       - Meio TSA em tubo – para o envio de cepas de microrganismos para exames complementares ou para
confirmação da identificação laboratorial.




       Os meios de transporte são inertes, isto é, preservam a viabilidade dos microrganismos nas amostras e
evitam a proliferação bacteriana, mantendo assim a proporção e a quantidade dos diversos microrganismos.

        Esses meios frequentemente contem Agar semi-solido que auxilia na preservação contra a dessecação dos
microrganismos. Alguns contem carvão ativado ou outra substancia com a finalidade de adsorver e remover agentes
tóxicos como ácidos graxos.

        O meio de transporte preconizado por Aimes é uma modificação do meio Stuart, no qual o glicerofosfato de
sódio foi substituído por um fosfato inorgânico. A presença de glicerofosfato no meio Stuart possibilitava que
espécies poucos exigentes se multiplicassem (microrganismos contaminantes) alterando a proporção dos
microorganismos presentes, dificultando a recuperação dos microrganismos mais fastidiosos. O fosfato inorgânico
elimina o eventual crescimento de contaminantes. Não há fonte de carbono nem de energia nos meios de
Resumo de microbiologia Diagnostica        3

transporte, impossibilitando assim a multiplicação bacteriana durante o acondicionamento da amostra no meio,
independente da temperatura.



    •   Recebimento da amostra

            –   Verificar identificação

            –   Verificar o volume de amostra x exames solicitados

            –   Verificar se amostra foi coletada em meio de transporte, swab e/ou frasco apropriado

            –   Verificar se a amostra é adequada para o exame solicitado

    •   RECOMENDA-SE QUE TODO O PROCESSAMENTO INICIAL DE AMOSTRAS CLÍNICAS SEJAM REALIZADOS EM
        CABINE DE SEGURANÇA BIOLÓGICA

    •   O ideal é semear imediatamente ou até 2h após coleta após o recebimento da amostra.



Técnicas microscópicas
A microscopia é a técnica mais comum utilizada para detecção de microrganismos diretamente de amostra clinicas e
para a melhor caracterização morfotintorial dos isolados em cultura.

Coloração pelo método de gram - metodologia utilizada para classificar as bactérias com base na morfologia e na
reação de coloração pelo método de gram. As bactérias podem ser gram positivas ou negativas de acordo com a
diferença na composição da parede bacteriana.

As bactérias gram positivas possuem uma parede espessa de peptideoglicano e grandes quantidades de acido
teicoico, o qual retem o corante inicial (cristal violeta), não sendo afetadas pela descoloração com álcool-acetona.
Com isso as células aparecem azul escuro.

As bactérias gram negativas possuem parede celular constituída de uma camada delgada (fina) de peptídeoglicano
que permite a descoloração do cristal violeta com álcool-acetona e posterior coloração com o corante de fundo,
safranina ou fucsina.



Resultado              Cepa                           Resultado esperado
Gram negativo          Escherichia coli               Bacilos corados em rosa
Gram positivo          Staphylococcus aureus          Cocos corados em azul escuro ou violeta



Cultura (isolamento e identificação)
Os meios de cultura são preparações sólidas, semi-sólidas ou líquidas, simples ou complexas que se empregam no
laboratório para cultivar micro-organismos, constituindo ambientes artificiais que se assemelham tanto quanto
possível às condições naturais.
Resumo de microbiologia Diagnostica   4

•   Selecionar o meio de cultura adequado

       –   Controle de qualidade do meio de cultura no uso

               •   Aparência, validade e ausência de contaminação

               •   Identificar os meios com informações de recuperação da amostra origem

               •   Não ocultar o nome nem a validade dos meios usados
Resumo de microbiologia Diagnostica      5



    •   Amostra em Swab – esfregaço e cultura – eluir swab em salina e utilizar para semear em esgotamento.

    •   Amostra de aspirados e exudatos – em seringa transferir para tubo estéril, homogenizar semear por
        esgotamento, fazer esfregaço.
    •   Amostra de escarro – selecionar a porção mais purulenta ou sanguinolenta, preparar o esfregaço pela
        coloração de gram, semear por esgotamento.

    •   Amostra de líquidos orgânicos – centrifugar, remover o sobrenadante e semear o sedimento, preparar
        lamina.
    •   Amostra de fragmentos de biopsia de tecidos – transferir a amostra para placa estéril, fragmenta-la com
        bisturi semear por esgotamento.
    •   Amostra de urina
                 Jato médio – homogenizar a amostra e semear com a alça, fazer esfregaço.
                 Primeiro jato – centrifugar, retirar o sobrenadante, semear o sedimento, preparar a lamina para
                 demarcação.
    •   Amostras ósseas – remover tecidos moles, transferir para o meio thioglicolato (THIO) que é um caldo.
    •   Amostra de fezes – semear em pequenas porções em meios apropriados por esgotamento. Transferir 4 a 5
        porções para caldos enriquecidos.




Isolamentos

Técnicas de semeadura
Semeadura quantitativa em estrias com alça calibrada – com alça calibrada e flambada, faz o inoculo inicial
traçando uma linha central, em seguida são traçadas estrias verticalmente a esta linha central em zig-zag na
superfície do meio.
Resumo de microbiologia Diagnostica         6



Semeadura por esgotamento – descarregar o material na área 1 (podendo passar o próprio swab ou se for liquido
tocar com a alça flambada no material e espalhar na área 1), com a mesma alça tocar na área 1 e fazer estrias (área
2), em seguida tocar na área 2 e fazer estrias na área 3 de maneira bem ampla para se ter um bom is
                                                                                                  isolamento
bacteriano.




Semi-quantitativa                                                      Cultura Qualitativa
Resumo de microbiologia Diagnostica   7

IDENTIFICAÇÃO

   •   MACROSCOPIA E MICROSCOPIA DAS COLÔNIAS

   •   IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA

   •   IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA

   •   MÉTODOS MOLECULARES




Pag 58 do livro escanear
Resumo de microbiologia Diagnostica       8




Provas bioquímicas

Identificação laboratorial de Streptococcus
Características: são cocos gram positivos, que podem se apresentar isolados, aos pares ou
em cachos.

   •   Catalase – verifica a produção da enzima que cataliza a reação de transformação
       do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio gasoso. Deve se colocar uma gota
                                                              Deve-se
       de H2O2 3% na lamina + 1 colonia. Se houver formação de bolhas o teste é
       positivo.




   •   DNAse – verifica a produção da enzima que degrada DNA ou RNA. DDeve-se semear uma colônia em spot em
                                                                            se
       uma placa com DNA. Incubar a 35º - 37º por 24h em aerobiose. Revelar com HCL 1N.




   •   Coagulase – há duas formas ligada e livre

                                                      A forma livre é secretada extracelularmente e catalisa a
                                              conversão de fibrinogênio em fibrina solúvel, promovendo
                                              aglutinação dos estafilococos.

                                              Colocar um inoculo denso em um tubo contendo plasma de coelho.
                                              Incubar por 4h a 37ºC em aerobiose. Resultado positivo – formação
                                                                                  .
                                              de coagulo, resultado negativo – incubar por mais 18
                                                                                                18-24h a
                                              temperatura ambiente (pq na estufa pd haver produção de
                                                       ura
                                              hemolisinas que dissolvem o coagulo).

           •   A forma ligada (“clumping factor”) esta na parede bacteriana e transforma fibrinogênio em fibrina
               insolúvel diretamente.

Colocar uma gota de plasma de coelho + 1 suspensão densa. Observar aglutinação em 10seg. após esse tempo falso
                                         suspensão
+.
Resumo de microbiologia Diagnostica   9

   •    Sensibilidade a novobiocina – verifica a sensibilidade ao
                                      verifica-se
        antibiótico

Deve-se preparar uma suspensao na escala 0,5 de M.F. com um swab
     se                                                     swab,
semear em placa de Agar sangue e acrescentar um disco de novobiocina.
Incubar a 35º-37ºC por 18-24h em aerobiose. Medir o halo.
                          24h



Resultado:      - Se o halo for >16mm sensível

               - Se o halo for <16mm resistente -> S. saprophyticus




                           Sensibilidade
                                  ilidade            resultado
 Catalase     Coagulase
                           a novobiocina         staphylococcus
    +             +           sensível               S. aureus
    +             -           sensível            S. epidermides
    +             -           sensível           S. haemophylos
    +             -          Resistente          S. saprophyticus


Obs.: Teste de DNAse positivo para s. aureus formação de halo
Resumo de microbiologia Diagnostica        10

Identificação laboratorial – Streptococcus
Características : São cocos gram +. Dispostos aos pares, catalase –, possuem algumas necessidades nutricionais: 35-
37ªC, 5 a 10% de CO2.



                                                          Apresentam hemólise em Agar sangue de carneiro (AS):

                                                          Alfa hemólise- lise parcial das hemácias – meio de cultura
                                                          fica esverdeado

                                                          Beta hemólise- lise completa das hemácias – meio de
                                                          cultura com halo transparente em torno da colônia.

                                                          Gama hemólise – ausência de hemólise – meio de cultura
                                                          sem alteração de cor.




TESTE BIOQUIMICOS:



    •   Teste de CAMP – faz a identificação presuntiva de estreptococos do grupo
        beta hemoliticos (S. agalactiae).

Utiliza-se uma cepa de S.aureus produtora de beta hemolisina, faz um risco no
meio da placa.

Pega-se a bactéria a ser testada e faz se um risco horizontal sem encosta no risco
vertical de S. aureus. Alguma bactérias produzem uma prot extracelular (fator
camp) que age em sinergismo com a beta hemolisina gerando uma hemolise em
forma de seta.




    •   Prova PYR (pirrolidonil arilamidase) – identifica microrganismos que fazem hidrolise do pyr



                                                                                     Estreptococos do grupo A e
                                                                                     enterococcus.

                                                                                     Em caso +, a cor do meio fica
                                                                                     vermelha/Pink
Resumo de microbiologia Diagnostica   11


   •   Hidrólise de hipurato de sódio – capacidade da bactéria de
       hidrolisar o hipurato de sodio em glicina e acido benzoico.

   Revelação glicina – add reativo de ninhidrina – se + cor azul
   escuro/roxo

   Revelação de acido benzoico – add cloreto férrico – se + formação
   de um precipitado abundante.




   •   Prova de bile-esculina – identificação de bactérias capazes de
       crescer em meio contendo 40% de bile e hidrolizar a esculina em
       esculetina.

   A esculetina reage com os íons férricos presentes no meio e forma um
   precipitado escuro (enterococcus faecalis)




   •   Prova de tolerância ao sal ou crescimento em NaCl 6,5% - o microrganismo é semeado em caldo NaCl 6,5% e
                               al
       incubado por 18-24h. se houver crescimento teste é positivo.
                       24h.




   •   Prova de Sensibilidade à optoquina – diferencia S. pneumoniae
       de outros estreptococcus do grupo viridans. Realiz
                                                   Realizado em AS
       mede-se o halo de inibição

Resultado      halo >14mm sensível – S. pneumoniae

               Halo < 14mm resistente – outros provas de identificação
Resumo de microbiologia Diagnostica   12
Resumo de microbiologia Diagnostica   13

Pag 88 e 89 do livro escanear




TABELA 5.3
Resumo de microbiologia Diagnostica   14




TABELA 5.4
Resumo de microbiologia Diagnostica   15
Resumo de microbiologia Diagnostica   16
Resumo de microbiologia Diagnostica       17

ENTEROCOCCUS




Identificação de enterobacterias
As características iniciais que uma bactéria pertence a família Enterobacteriaceae é a presença de hemólise e
colônias de tamanho variável.

São bacilos ou cocobacilos gram negativos e são anaeróbios facultativos.

Caldos para enriquecimento: selenito (inibe coliformes e algumas cepas de shigella) e tetrationato (inibe gram + e
coliformes).



 “Os micro-organismos do genero Enterococcus são cocos Gram- e apresentam necessidades nutricionais variáveis e
o crescimento pode requerer meios complexos, contendo soro ou sangue. A temperatura ótima de crescimento e de
35ªC, porem, a maioria das amostras tolera temperaturas que variam de 10oC a 45oC. Os enterococos sao
distribuídos em ambientes diversos. Nos seres humanos fazem parte da microbiota do trato gastrintestinal, da
cavidade oral e do trato geniturinario. Estes microorganismos podem tolerar temperaturas equivalentes a 60oC por
ate 30 minutos e são capazes de crescer em meios contendo cloreto de sodio a 6,5% . E. faecalis e capaz de colonizar
os sistemas de canais radiculares, utilizando- se provavelmente dos substratos oriundos dos fluidos dos tecidos
conjuntivos subjacentes (osso alveolar e ligamento periodontal). Dentre os fatores de virulência destacam-se as
enzimas líticas, citolisinas, substancias de agregação, feromonios e acido lipoteicoico. E. faecalis tambem pode
interferir com a ativação dos linfócitos e outros grupos celulares, contribuindo para o insucesso da terapêutica
endodontica. Alem da sua habilidade para invadir e permanecer no interior dos túbulos dentinarios apresenta
elevada resistência aos curativos de demora utilizados entre sessões, inclusive aqueles a base de hidróxido de cálcio.
Foi descrito que as cepas de E. faecalis possuem uma bomba de prótons capaz de proteger o citoplasma bacteriano
do elevado pH conferido pelos produtos contendo hidróxido de cálcio. A espécie também e capaz de formar
Resumo de microbiologia Diagnostica           18

biofilmes onde as células bacterianas formam estruturas multicelulares coesas de difícil remoção pelo sistema
imunológico, alem de dificultar a atividade dos agentes antimicrobianos. Tais propriedades conferem aos E. faecalis
grande poder agressivo aos tecidos perirradiculares e maior resistência ao controle das infecções endodontias”.
(Artigo disponível em -> http://revista.aborj.org.br/index.php/rbo/article/viewFile/245/212)




Identificação de enterococcus




   •   Morfologia – bacilos ou cocos

   •   Propriedades tintoriais de gram – Gram negativos

   •   Característica morfológica da colônia em Agar
           o Hemólise variável
           o Colônias de tamanho variável, podendo se dispersar no meio



Meios de cultura
   •   Meio não seletivo Ricos – Agar sangue de carneiro – (E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, serratia
       marcescens)

   •   Meio seletivo e diferencial

           o   MC (Mac conkey) composto de lactose, sais biliares e cristal violeta, indicadores de pH (vermelho
               neutro) – impede o crescimento de bactérias gram positivas – (E. coli, citrobacter SP, serratia
               marcescens).

           o   SS (salmonella-shigella) – Altamente seletivo – Salmonella e Shigella, Lactose – único açúcar, [ ] de
               sais biliares e citrato de sódio – inibem G+ e coliformes, Indicador de pH – vermelho neutro,
               Tiossulfato de sódio/citrato férrico – detecção H2S.
Resumo de microbiologia Diagnostica   19




o   EMB (“Eosina Metileno Blue”) - é um meio de cultura diferencial que
    inibe o crescimento de bactérias Gram positivas e indica se a bactéria é
    fermentadora ou não de lactose. Bactérias fermentadoras
    de lactose apresentam-se em colônias com o centro preto. Colônias
    de Escherichia coli são facilmente identificáveis por apresentarem
    coloração verde metálico no meio EMB.




o   VB – Verde Brilhante - Meio seletivo/diferencial – isolamento de
    Salmonella (exceto Salmonella Typhi), Lac e sac – CH, [ ] de verde
    brilhante – inibe G+ e alguns G(-), inclusive Shigella e Salmonella
    enterica Typhi , Indicador de pH – vermelho de fenol, Salmonella - pink
Resumo de microbiologia Diagnostica     20




   •   Caldos para enriquecimento

       o   Selenito - o selenito de sódio inibe coliformes e pode inibir algumas cepas de Shigella

       o   Tetrationato - sais biliares inibem G+, tetrationato (formado após adição de solução de iodo) inibe
           coliformes




Como diferenciar as Enterobacteriaceae ?



       Metabolismo – fermentativo/oxidativo
   o   Teste de oxidase – Prova da citocromo-oxidase - Este sistema enzimático está relacionado com os
       citocromos da cadeia respiratória de alguns microrganismos. A prova consiste em colocar uma gota do
       reagente incolor tetrametil p-fenileno de amina, recém preparado e protegido da luz, em um papel de filtro.
       Em seguida, várias colônias do microrganismo em estudo são espalhadas sobre a área do papel de filtro
       contendo o reagente, utilizando uma alça de platina ou um bastão de vidro. A prova é considerada positiva
       quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor púrpura em até 1 minuto. Na
       reação negativa não há desenvolvimento de cor púrpura. As enterobactérias são oxidase negativas e podem
       ser diferenciadas de outros bacilos Gram negativos. A prova pode ser feita também em culturas em meios
       sólidos, adicionando-se o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reação inicia-se com o
       desenvolvimento de cor rósea, marrom e finalmente uma coloração negra na superfície das colônias é
       indicativa da produção de citocromo-oxidase, representando um teste positivo. O teste é negativo se não
       ocorrer alteração da cor ou houver o desenvolvimento de uma cor rósea pálida.




                                                                          E. coli     Pseudomonas




   o   Sorotipagem (caracterização antigênica)
Resumo de microbiologia Diagnostica      21



   o   Prova bioquímica de TSI (Tríplice Açúcar Ferro – para verificar se a bactéria é uma fermentadora de glicose
                                Tríplice        Ferro)




TSI - Meio nutricionalmente rico com inibidores que permite o crescimento da maioria das espécies bacterianas, só
não cresce as mais exigentes e anaeróbios.
O TSI só pode ser realizada com amostras já isoladas em placas com meio seletivo para bacilos gram negativos
entéricos. O indicador de pH é vermelho de fenol (pH ácido indicador fica amarelo; pH alcalino o indicador fica
vermelho).Um ponto importante é a proporção entre os açucares sendo que esse meio apresenta a proporção de
Glicose : Lactose : Sacarose 1:10:10 (g/L), há também tiossulfato de sódio, sulfato ferroso e peptona.
                                                                            sulfato
Resumo de microbiologia Diagnostica       22


Fermentação dos Açucares




Produção de H2S
Se a bactéria produzir a enzima tiossulfato redutase ela ira degradar o tiossulfato de sódio presente no meio
produzindo H2S, este reage com o sulfato ferroso formando um precipitado preto de sulfeto ferroso. Para que esta
reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido, assim se a base do tubo estiver negra deve ser lida como que a
                                                                                      negra
                                                                                  bactéria é fermentadora de glicose.




                 Produção de Gás
                 Há bactérias que degradam o ácido fórmico proveniente da fermentação da glicose produzindo H2
                 ;CO2 devido a ação da enzima formiase. A produção de gás é evidenciada pela formação de bolhas
                                                 formiase.
                 e ou o meio pode rachar. Se houver muita produção de gás com o deslocamento do meio pode
                 seer indicativo de Klebsiela e Enterobacter.

                 Para prosseguir com as outras provas Bioquímicas devemos usar as colônias de bactérias que
                 cresceram na parte superior do TSI. Entretanto devemos ter certeza que no TSI só tem uma
                 espécie, isso é obtido a partir de meios seletivos e caldos nutritivos.

                 Indol

                 O indol é produzido a partir do tríptofano existente no meio de cultura sob a ação da triptofanase,
                 há também a produção de ácido pirúvico e amônia.
                 O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa “pink” na parte superior do tubo após a
adição p-dimetilaminobenzaldeído (reativo de kovacs).
         dimetilaminobenzaldeído
Resumo de microbiologia Diagnostica         23




VM (Vermelho de Metila)
Teste que avalia se as bactérias que fermentam a glicose pela via ácida mista, com isso há a produção de vários
ácidos (ácido fórmico, lático, acético) que faz com que o pH do meio fique abaixo de 4,4 que é o limite de viragem do
indicador de pH.
O indicador de pH é o vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 é vermelho e acima de 6 é amarelo.




VP (Voges Proskauer)

Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica, fermentam a glicose produzindo acetil
                                                                                            acetil-metil- carbinol
(acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos.Quando é adicionado KOH e na presença de O2
                  noglicol
atmosférico a acetoína é convertida em diacetila a adicição de alfa naftol nesta reação cataliza a produção de um
                                                               alfa-naftol
anel vermelho.
Resumo de microbiologia Diagnostica        24




Citrato

Este teste determina se a bactéria é capaz de o citrato de sódio como única fonte de carbono para o seu
                              éria
metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, composto por citrato de sódio, fosfato
de amônia e por azul de bromo fenol.Com o uso de citrato há a produção de hidróxido de amônia que eleva o pH
fazendo que a reação se torne azul.
Resumo de microbiologia Diagnostica     25

Urease


Há bactérias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uréia presente no meio
liberando amônia, CO2 e H2O. A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio.O indicador de
                                                       carbonato
pH é o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a coloração “pink”.




Fenilalanina Desaminase (FAD)


Há bactérias que produzem enzimas que desaminam a fenilalanina presente no meio, originando o ácido
fenilpirúvico, que reage com o cloreto férrico adicionado ao meio, desenvolvendo cor verde.Essa prova é presuntiva
 enilpirúvico,
para Proteus, Morganela, Providencia.
Resumo de microbiologia Diagnostica       26



Lisina descarboxilase(LDC)


Há algumas bactérias que possuem a lisina descarboxilase que descorboxila a lisina produzindo a cadaverina mais
CO2, essa descaroboxilização alcaliniza o meio.O meio contém o indicador azul de bromocresol, que em pH alcalino
apresenta-se em cor roxo e em meio ácido a cor amarela. A reação se processa em anaerobiose deve-se cobrir o
          se
meio com óleo mineral ou cera de carnúba.




Mio (Motilidade, Indol e ornitina)


Se a bactéria produz a enzima ornitina descarboxilase, ela será capaz de descarboxilar a ornitina produzindo gás
carbônico e putrecina, isso eleva o pH do meio. O indicador de pH usado é o púrpura de bromocresol que e,
                                           meio.
condições alcalinas se torna roxo. É útil para diferenciar entre Klebsiella (negaivo) e Enterobacter (positivo).




A produção de Indol pode ser detectado colocando um papel filtro ou algodão umedecido com reativo de indol, na
                                                                                 umedecido
aula prática o indol foi feito separado para que ficasse de forma mais didática.
A motilidade é observada através do aspecto do meio, isso decorre do fato que o meio é semi
                                                                                         semi-sólido e permite o
crescimento bacteriano por todo o tubo. Se a motilidade é positiva o aspecto do meio será turvo enquanto que
Resumo de microbiologia Diagnostica        27

motilidade negativa só observaremos a picada. Fica mais fácil de observar a motilidade pondo os tubos contra um
folha de papel pautada, se conseguirmos observar as linhas através do tubo é motilidade negativa.
Resumo de microbiologia Diagnostica   28



Se a bacteria for indol + e citrato - pensar em E. coli

Se houver a presença de mto gás e citrato +, com lisina e ureia + e colônia mucoide:

        +indol – klebisella oxygoca

        - indol – klebisella pneumoniae

E. cloaceae – lisina neg e indol neg

E. aerogenes – lisina posi e indol neg

E. aglomerans – lisina neg e indol posit, motilidade neg

Serratia – lisina posit, sacarose neg, motilidade neg

Se a bactéria for sem gás ou com pouca produção, lisina posit, sacarose neg e motilidade neg – shigella

Meio inalterado – pseudômonas aeroginosa (indulto escuro) ou alcaligenes faecalis (induto esbranquiçado).




Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores


Pg 93 – figura 5.5
Resumo de microbiologia Diagnostica       29

2 grupos importantes:

    o   Enterobactérias

    BGN-F = Fermentadoras de glicose

    BGN-NF = Não-Fermentadores de glicose

    •   Maior importância clínica - Pseudomonas aeruginosa (Bacilo Gram-negativo aeróbio, móvel, não-esporulado,
        Com 1 a 3 flagelos polares, Desenvolve-se bem em diversos meios de cultura e em diversas temperaturas
        (temp. ótima: 37oC), Produz pigmentos solúveis: piocianina (azul-esverdeado) e fluoresceína (amarelo-
        esverdeado), Altamente patogênica: resistência a diversos antimicrobianos – provas bioquímicas Oxidase
        negativos, hidrólise de esculina positiva e catalase positiva)

    •   Vários gêneros – Acinetobacter SP (Utiliza várias tipos de fontes de carbono em seu metabolismo →
        expandindo seu habitat, Bacilo ou cocobacilo - Infecções: pneumonias, meningites, endocardites, infecções
        de pele e feridas e ITU), Burkholderia, Stenotrophomonas.



    •   Considerações gerais – Aeróbios, Não esporogênicos, Não utilizam a via fermentativa, Crescem na superfície
        dos meios de cultura, Nomenclatura constantemente alterada.

    •   Metabolismo - Metabolismo fermentativo e oxidativo.



    Fatores de virulência

•   Adesinas (pili e cápsula), cápsula de alginato (confere proteção à bactéria, cepas mucóides – biofilmes, alginato:
    atividade contra aminoglicosídeos), Produção de proteases e enzimas proteolíticas - inativam citocinas.

•   Produção de leucocidina: citotoxina que atua na membrana celular dos leucócitos

•   Produção de hemolisinas: contribui para invasão tecidual através de efeitos citotóxicos

•   secreção de pigmentos por P. aeruginosa como a piocianina: destruindo o epitélio respiratório

•   Lipopolissacarídeos (endotoxina)

•   Exotoxina A: potente inibidor de síntese proteica (necrose)

•   Exoenzima S: proteína de membrana celular com efeitos citotóxicos e de adesão



Mecanismos de Resistência

    •   β-lactamase

    •   Melato-β-lactamase

    •   Cefalosporinase

    •   Efluxo do antimicrobiano

    •   Alteração de proteínas da membrana externa
Resumo de microbiologia Diagnostica   30

Identificação Laboratorial

   •   Enzima Oxidase

   •   Motilidade

   •   Cocobacilos ou Bacilos Gram-negativos

   •   Não utilizam CBI na ausência de O2

   •   Aeróbios estritos

   •   Características que nos fazem suspeitar que estamos frente a um BGN NF - Falta de evidência de
       fermentação da glicose, Crescimento pobre ou ausência de crescimento em MC.



Teste de OF

   •   Oxidação-Fermentação

   •   BGN-NF X enterobactérias (BGN-F)

   •   Diversos açúcares

   •   Tubo aberto (com oxigênio)

   •   Tubo fechado (sem oxigênio)

   •   Base OF (Hugh & Leifson)

              •   [ ] peptonas diminuída

              •   [ ] CBI aumentada

              •   [ ] ágar diminuída

              •   Azul de bromotimol - p/ detecção de ácidos



Crescimento - Meios seletivos

              –   Agar Cetrimida (Pseudomonas sp.)

              –   BCSA (Burkolderia cepacia selective agar)

                      •   Antibióticos para inibir crescimento de outras bactérias

   •   Crescimento em MC a 42oC

              –   Identificar espécies de Acinetobacter



   Prova de oxidase e motilidade
Resumo de microbiologia Diagnostica   31

Produção de pigmentos

   •   Meio de Tech & Flo – contém peptonas espec
                                            especiais e [ ] de
          2+
       Mg e sulfato aumentada – aumentar a produção de
       pigmentos

           –   Bacto peptona (Tech) – piocianina (azul turquesa
               luz visível, sem fluorescência sob UV)

           –   Peptona-3-proteose (Flo) – pioverdina (amarela luz
                           proteose
               visível, com fluorescência sob UV)




Descarboxilação de AA

   •   Caldo Moeller

   •   Pequena quantidade de substrato + inóculo denso

   •   Reação positiva: intensificação da cor púrpura
Resumo de microbiologia Diagnostica   32

Diagnostico bacteriológico das infecções da C.S.

Bacteremia (presença de bactérias no sangue) pode ser:

- Transitoria – microrganismos da microbiota na C.S.

- intermitente – bactérias de um foco de infecção primário vai para a C.S

- Continua – acesso direto a c.s

- Escape – após 1 a 2 dias do inicio da antibioticoterapia supostamente adequada.



Septicemia – complexa reação inflamatória sistêmica a uma infecção, é uma condição toxica – sepse (LPS), o sangue
se apresenta com cels fagociticas e a multiplicação dos microrganismos é maior que a remoção pelos fagócitos.



Doenças do sistema vascular

Tipos de infecção

        Intravascular
            o Endocardites – anormalidade no endocárdio pela presença de microrganismos no sangue (coletar 3
                amostras, punção venosa de diferentes lugares, em intervalos de 15 a 30 min).
            o Bacteremia associada ao uso de cateter intravenoso – rotas de infecção superfície externa do
                cateter.

        Infecções da C.S. podem ser:
        o Infecçoes primarias do acesso vascular (por uso de cateter, tubos subcutâneos ) complicações – infecção
            da C.S, focos metastáticos em outros órgãos.
        o Cateter vascular – corpo estranho processo inflamatório, infecção por pqnos inoculos (que pode ser
            contaminação do cateter, do canhão, das soluções ou hematogênica – foco infeccioso a distancia).
        o Fatores do hospedeiro – idade, imunossupressão, seleção da microflora com antibióticos, gravidade da
            doença de base e etc.
        o Fatores relacionados ao acesso vascular – duração do cateterismo, habilidade de introduzir o cateter,
            forma de inserção, trocas e etc.



        Infecções extravasculares – multiplicação localizada microrganismos que são drenados para os vasos
        linfáticos e caem na C.S.
Resumo de microbiologia Diagnostica        33

Diagnostico

- Presença de drenagem purulenta no sitio vascular

- Sinais flogisticos locais: dor, calor, eritema.



    o   Hemocultura – numero de frascos coletados devera ser considerado de acordo com a condição clinica do
        paciente. Duas a três amostras de diferentes locais em intervalo de 30 min.
            o Cultura de cateter venoso central (CVC)- suspeita de colonização – presença de secreção purulenta

                 - CVC curta permanência (>15UFC) – retirar a ponta (semi quantitativa) + hemocultura (qualitativa) =
                 verificar se a hemo e a CVC de ponta for + tem o msm microrganismo.

                 - CVC longa permanência – não remover, cultura da secreção peri cateter + hemocultura.

Hemocultura         CVC                     Fazer
-                   Não cultivado           Cultivar CVC
-                   -                       Investigar outros focos
-                   + > 15 UFC              Não tratar observar evolução (colonização)
+                   + >15UFC                Tratamento para bacteremia




Coleta da amostra

                 - antissepsia local, volume da amostra, anticoagulograma, meio de cultura.
                 - preparo do sitio de coleta – lavar com sabão, enxaguar em água estéril, aplicar iodo e secar, aplicar
                 álcool e secar.
                 - Coleta – seringa e agulha sistema fechado diretamente do cateter


Meios de cultura utilizados – caldo rico (TSB, BHI) incubar a 35ºC.



Resultados – S. aureus, S. pneumoniae, p. aeroginosa, c. albicans e enterobacterias.

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  • 1. Resumo de microbiologia Diagnostica 1 1 – Fundamentos laboratoriais do diagnostico microbiológico O diagnostico microbiológico : - Auxilia no diagnostico e tratamento das doenças infecciosas, avalia e monitora a terapêutica antimicrobiana, ajuda a controlar infecções hospitalares (determinando as medidas de controle das infecções). - Determina o perfil de sensibilidade e avalia o surgimento de resistência antimicrobiana. O medico deve: solicitar o exame qdo indicado, na requisição deve conter os dados que possam auxiliar o laboratório, interpretar corretamente os resultados para instituir a terapêutica mais adequada, e sempre que necessário comunicar-se com o laboratório. O laboratório deve: coletar e transportar o material de forma adequada, identificar as amostras, selecionar as técnicas mais adequadas para cada caso, emitir os laudos, auxiliar o medico na interpretação dos exames. O laboratório de microbiologia deve se estruturar adequadamente para isolamento, identificação e perfil de sensibilidade, avaliar a qualidade do material clinico coleta e ter critérios para rejeição das amostras. Procedimentos iniciais em microbiologia clinica Princípios – a semeadura primaria adequada é uma das mais importantes e fundamentais etapas da rotina na microbiologia. Qdo a coleta é realizada em outro lugar (hospitais e clinicas) se deve observar data e horário da coleta, natureza do material clinico, sitio anatômico da coleta. A escolha dos meios de cultura mais apropriados, temperatura, atmosfera e tempo de incubação garantem o sucesso do diagnostico.
  • 2. Resumo de microbiologia Diagnostica 2 Qualquer material pode ser processado para cultura: Urina, Fezes, Escarro, Lavado brônquico, Líquor, Esperma, Fragmento de tecido, Líquidos orgânicos , Secreções em geral. • COLETA E TRANSPORTE - os materiais devem ser coletados e enviados ao laboratório em meios de transporte e/ou frascos adequados para cada tipo de material, de acordo com o exame solicitado. Alguns exemplos são: - Frascos de coleta com boca larga e tampa de rosca para coleta de fezes, urina ou escarro. - Swab com meio Stuart ou AMIES para Isolamento de bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas - Swab com Meio de Stuart ou AMIES com carvão ativado – para isolamento de bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas, preferencialmente para isolamento de gonococos, hemófilos e pneumococos. - Meio Cary Blair – conservante de fezes para isolamento de enteropatógenos - Meio TSA em tubo – para o envio de cepas de microrganismos para exames complementares ou para confirmação da identificação laboratorial. Os meios de transporte são inertes, isto é, preservam a viabilidade dos microrganismos nas amostras e evitam a proliferação bacteriana, mantendo assim a proporção e a quantidade dos diversos microrganismos. Esses meios frequentemente contem Agar semi-solido que auxilia na preservação contra a dessecação dos microrganismos. Alguns contem carvão ativado ou outra substancia com a finalidade de adsorver e remover agentes tóxicos como ácidos graxos. O meio de transporte preconizado por Aimes é uma modificação do meio Stuart, no qual o glicerofosfato de sódio foi substituído por um fosfato inorgânico. A presença de glicerofosfato no meio Stuart possibilitava que espécies poucos exigentes se multiplicassem (microrganismos contaminantes) alterando a proporção dos microorganismos presentes, dificultando a recuperação dos microrganismos mais fastidiosos. O fosfato inorgânico elimina o eventual crescimento de contaminantes. Não há fonte de carbono nem de energia nos meios de
  • 3. Resumo de microbiologia Diagnostica 3 transporte, impossibilitando assim a multiplicação bacteriana durante o acondicionamento da amostra no meio, independente da temperatura. • Recebimento da amostra – Verificar identificação – Verificar o volume de amostra x exames solicitados – Verificar se amostra foi coletada em meio de transporte, swab e/ou frasco apropriado – Verificar se a amostra é adequada para o exame solicitado • RECOMENDA-SE QUE TODO O PROCESSAMENTO INICIAL DE AMOSTRAS CLÍNICAS SEJAM REALIZADOS EM CABINE DE SEGURANÇA BIOLÓGICA • O ideal é semear imediatamente ou até 2h após coleta após o recebimento da amostra. Técnicas microscópicas A microscopia é a técnica mais comum utilizada para detecção de microrganismos diretamente de amostra clinicas e para a melhor caracterização morfotintorial dos isolados em cultura. Coloração pelo método de gram - metodologia utilizada para classificar as bactérias com base na morfologia e na reação de coloração pelo método de gram. As bactérias podem ser gram positivas ou negativas de acordo com a diferença na composição da parede bacteriana. As bactérias gram positivas possuem uma parede espessa de peptideoglicano e grandes quantidades de acido teicoico, o qual retem o corante inicial (cristal violeta), não sendo afetadas pela descoloração com álcool-acetona. Com isso as células aparecem azul escuro. As bactérias gram negativas possuem parede celular constituída de uma camada delgada (fina) de peptídeoglicano que permite a descoloração do cristal violeta com álcool-acetona e posterior coloração com o corante de fundo, safranina ou fucsina. Resultado Cepa Resultado esperado Gram negativo Escherichia coli Bacilos corados em rosa Gram positivo Staphylococcus aureus Cocos corados em azul escuro ou violeta Cultura (isolamento e identificação) Os meios de cultura são preparações sólidas, semi-sólidas ou líquidas, simples ou complexas que se empregam no laboratório para cultivar micro-organismos, constituindo ambientes artificiais que se assemelham tanto quanto possível às condições naturais.
  • 4. Resumo de microbiologia Diagnostica 4 • Selecionar o meio de cultura adequado – Controle de qualidade do meio de cultura no uso • Aparência, validade e ausência de contaminação • Identificar os meios com informações de recuperação da amostra origem • Não ocultar o nome nem a validade dos meios usados
  • 5. Resumo de microbiologia Diagnostica 5 • Amostra em Swab – esfregaço e cultura – eluir swab em salina e utilizar para semear em esgotamento. • Amostra de aspirados e exudatos – em seringa transferir para tubo estéril, homogenizar semear por esgotamento, fazer esfregaço. • Amostra de escarro – selecionar a porção mais purulenta ou sanguinolenta, preparar o esfregaço pela coloração de gram, semear por esgotamento. • Amostra de líquidos orgânicos – centrifugar, remover o sobrenadante e semear o sedimento, preparar lamina. • Amostra de fragmentos de biopsia de tecidos – transferir a amostra para placa estéril, fragmenta-la com bisturi semear por esgotamento. • Amostra de urina Jato médio – homogenizar a amostra e semear com a alça, fazer esfregaço. Primeiro jato – centrifugar, retirar o sobrenadante, semear o sedimento, preparar a lamina para demarcação. • Amostras ósseas – remover tecidos moles, transferir para o meio thioglicolato (THIO) que é um caldo. • Amostra de fezes – semear em pequenas porções em meios apropriados por esgotamento. Transferir 4 a 5 porções para caldos enriquecidos. Isolamentos Técnicas de semeadura Semeadura quantitativa em estrias com alça calibrada – com alça calibrada e flambada, faz o inoculo inicial traçando uma linha central, em seguida são traçadas estrias verticalmente a esta linha central em zig-zag na superfície do meio.
  • 6. Resumo de microbiologia Diagnostica 6 Semeadura por esgotamento – descarregar o material na área 1 (podendo passar o próprio swab ou se for liquido tocar com a alça flambada no material e espalhar na área 1), com a mesma alça tocar na área 1 e fazer estrias (área 2), em seguida tocar na área 2 e fazer estrias na área 3 de maneira bem ampla para se ter um bom is isolamento bacteriano. Semi-quantitativa Cultura Qualitativa
  • 7. Resumo de microbiologia Diagnostica 7 IDENTIFICAÇÃO • MACROSCOPIA E MICROSCOPIA DAS COLÔNIAS • IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA • IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA • MÉTODOS MOLECULARES Pag 58 do livro escanear
  • 8. Resumo de microbiologia Diagnostica 8 Provas bioquímicas Identificação laboratorial de Streptococcus Características: são cocos gram positivos, que podem se apresentar isolados, aos pares ou em cachos. • Catalase – verifica a produção da enzima que cataliza a reação de transformação do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio gasoso. Deve se colocar uma gota Deve-se de H2O2 3% na lamina + 1 colonia. Se houver formação de bolhas o teste é positivo. • DNAse – verifica a produção da enzima que degrada DNA ou RNA. DDeve-se semear uma colônia em spot em se uma placa com DNA. Incubar a 35º - 37º por 24h em aerobiose. Revelar com HCL 1N. • Coagulase – há duas formas ligada e livre A forma livre é secretada extracelularmente e catalisa a conversão de fibrinogênio em fibrina solúvel, promovendo aglutinação dos estafilococos. Colocar um inoculo denso em um tubo contendo plasma de coelho. Incubar por 4h a 37ºC em aerobiose. Resultado positivo – formação . de coagulo, resultado negativo – incubar por mais 18 18-24h a temperatura ambiente (pq na estufa pd haver produção de ura hemolisinas que dissolvem o coagulo). • A forma ligada (“clumping factor”) esta na parede bacteriana e transforma fibrinogênio em fibrina insolúvel diretamente. Colocar uma gota de plasma de coelho + 1 suspensão densa. Observar aglutinação em 10seg. após esse tempo falso suspensão +.
  • 9. Resumo de microbiologia Diagnostica 9 • Sensibilidade a novobiocina – verifica a sensibilidade ao verifica-se antibiótico Deve-se preparar uma suspensao na escala 0,5 de M.F. com um swab se swab, semear em placa de Agar sangue e acrescentar um disco de novobiocina. Incubar a 35º-37ºC por 18-24h em aerobiose. Medir o halo. 24h Resultado: - Se o halo for >16mm sensível - Se o halo for <16mm resistente -> S. saprophyticus Sensibilidade ilidade resultado Catalase Coagulase a novobiocina staphylococcus + + sensível S. aureus + - sensível S. epidermides + - sensível S. haemophylos + - Resistente S. saprophyticus Obs.: Teste de DNAse positivo para s. aureus formação de halo
  • 10. Resumo de microbiologia Diagnostica 10 Identificação laboratorial – Streptococcus Características : São cocos gram +. Dispostos aos pares, catalase –, possuem algumas necessidades nutricionais: 35- 37ªC, 5 a 10% de CO2. Apresentam hemólise em Agar sangue de carneiro (AS): Alfa hemólise- lise parcial das hemácias – meio de cultura fica esverdeado Beta hemólise- lise completa das hemácias – meio de cultura com halo transparente em torno da colônia. Gama hemólise – ausência de hemólise – meio de cultura sem alteração de cor. TESTE BIOQUIMICOS: • Teste de CAMP – faz a identificação presuntiva de estreptococos do grupo beta hemoliticos (S. agalactiae). Utiliza-se uma cepa de S.aureus produtora de beta hemolisina, faz um risco no meio da placa. Pega-se a bactéria a ser testada e faz se um risco horizontal sem encosta no risco vertical de S. aureus. Alguma bactérias produzem uma prot extracelular (fator camp) que age em sinergismo com a beta hemolisina gerando uma hemolise em forma de seta. • Prova PYR (pirrolidonil arilamidase) – identifica microrganismos que fazem hidrolise do pyr Estreptococos do grupo A e enterococcus. Em caso +, a cor do meio fica vermelha/Pink
  • 11. Resumo de microbiologia Diagnostica 11 • Hidrólise de hipurato de sódio – capacidade da bactéria de hidrolisar o hipurato de sodio em glicina e acido benzoico. Revelação glicina – add reativo de ninhidrina – se + cor azul escuro/roxo Revelação de acido benzoico – add cloreto férrico – se + formação de um precipitado abundante. • Prova de bile-esculina – identificação de bactérias capazes de crescer em meio contendo 40% de bile e hidrolizar a esculina em esculetina. A esculetina reage com os íons férricos presentes no meio e forma um precipitado escuro (enterococcus faecalis) • Prova de tolerância ao sal ou crescimento em NaCl 6,5% - o microrganismo é semeado em caldo NaCl 6,5% e al incubado por 18-24h. se houver crescimento teste é positivo. 24h. • Prova de Sensibilidade à optoquina – diferencia S. pneumoniae de outros estreptococcus do grupo viridans. Realiz Realizado em AS mede-se o halo de inibição Resultado halo >14mm sensível – S. pneumoniae Halo < 14mm resistente – outros provas de identificação
  • 12. Resumo de microbiologia Diagnostica 12
  • 13. Resumo de microbiologia Diagnostica 13 Pag 88 e 89 do livro escanear TABELA 5.3
  • 14. Resumo de microbiologia Diagnostica 14 TABELA 5.4
  • 15. Resumo de microbiologia Diagnostica 15
  • 16. Resumo de microbiologia Diagnostica 16
  • 17. Resumo de microbiologia Diagnostica 17 ENTEROCOCCUS Identificação de enterobacterias As características iniciais que uma bactéria pertence a família Enterobacteriaceae é a presença de hemólise e colônias de tamanho variável. São bacilos ou cocobacilos gram negativos e são anaeróbios facultativos. Caldos para enriquecimento: selenito (inibe coliformes e algumas cepas de shigella) e tetrationato (inibe gram + e coliformes). “Os micro-organismos do genero Enterococcus são cocos Gram- e apresentam necessidades nutricionais variáveis e o crescimento pode requerer meios complexos, contendo soro ou sangue. A temperatura ótima de crescimento e de 35ªC, porem, a maioria das amostras tolera temperaturas que variam de 10oC a 45oC. Os enterococos sao distribuídos em ambientes diversos. Nos seres humanos fazem parte da microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinario. Estes microorganismos podem tolerar temperaturas equivalentes a 60oC por ate 30 minutos e são capazes de crescer em meios contendo cloreto de sodio a 6,5% . E. faecalis e capaz de colonizar os sistemas de canais radiculares, utilizando- se provavelmente dos substratos oriundos dos fluidos dos tecidos conjuntivos subjacentes (osso alveolar e ligamento periodontal). Dentre os fatores de virulência destacam-se as enzimas líticas, citolisinas, substancias de agregação, feromonios e acido lipoteicoico. E. faecalis tambem pode interferir com a ativação dos linfócitos e outros grupos celulares, contribuindo para o insucesso da terapêutica endodontica. Alem da sua habilidade para invadir e permanecer no interior dos túbulos dentinarios apresenta elevada resistência aos curativos de demora utilizados entre sessões, inclusive aqueles a base de hidróxido de cálcio. Foi descrito que as cepas de E. faecalis possuem uma bomba de prótons capaz de proteger o citoplasma bacteriano do elevado pH conferido pelos produtos contendo hidróxido de cálcio. A espécie também e capaz de formar
  • 18. Resumo de microbiologia Diagnostica 18 biofilmes onde as células bacterianas formam estruturas multicelulares coesas de difícil remoção pelo sistema imunológico, alem de dificultar a atividade dos agentes antimicrobianos. Tais propriedades conferem aos E. faecalis grande poder agressivo aos tecidos perirradiculares e maior resistência ao controle das infecções endodontias”. (Artigo disponível em -> http://revista.aborj.org.br/index.php/rbo/article/viewFile/245/212) Identificação de enterococcus • Morfologia – bacilos ou cocos • Propriedades tintoriais de gram – Gram negativos • Característica morfológica da colônia em Agar o Hemólise variável o Colônias de tamanho variável, podendo se dispersar no meio Meios de cultura • Meio não seletivo Ricos – Agar sangue de carneiro – (E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp, serratia marcescens) • Meio seletivo e diferencial o MC (Mac conkey) composto de lactose, sais biliares e cristal violeta, indicadores de pH (vermelho neutro) – impede o crescimento de bactérias gram positivas – (E. coli, citrobacter SP, serratia marcescens). o SS (salmonella-shigella) – Altamente seletivo – Salmonella e Shigella, Lactose – único açúcar, [ ] de sais biliares e citrato de sódio – inibem G+ e coliformes, Indicador de pH – vermelho neutro, Tiossulfato de sódio/citrato férrico – detecção H2S.
  • 19. Resumo de microbiologia Diagnostica 19 o EMB (“Eosina Metileno Blue”) - é um meio de cultura diferencial que inibe o crescimento de bactérias Gram positivas e indica se a bactéria é fermentadora ou não de lactose. Bactérias fermentadoras de lactose apresentam-se em colônias com o centro preto. Colônias de Escherichia coli são facilmente identificáveis por apresentarem coloração verde metálico no meio EMB. o VB – Verde Brilhante - Meio seletivo/diferencial – isolamento de Salmonella (exceto Salmonella Typhi), Lac e sac – CH, [ ] de verde brilhante – inibe G+ e alguns G(-), inclusive Shigella e Salmonella enterica Typhi , Indicador de pH – vermelho de fenol, Salmonella - pink
  • 20. Resumo de microbiologia Diagnostica 20 • Caldos para enriquecimento o Selenito - o selenito de sódio inibe coliformes e pode inibir algumas cepas de Shigella o Tetrationato - sais biliares inibem G+, tetrationato (formado após adição de solução de iodo) inibe coliformes Como diferenciar as Enterobacteriaceae ? Metabolismo – fermentativo/oxidativo o Teste de oxidase – Prova da citocromo-oxidase - Este sistema enzimático está relacionado com os citocromos da cadeia respiratória de alguns microrganismos. A prova consiste em colocar uma gota do reagente incolor tetrametil p-fenileno de amina, recém preparado e protegido da luz, em um papel de filtro. Em seguida, várias colônias do microrganismo em estudo são espalhadas sobre a área do papel de filtro contendo o reagente, utilizando uma alça de platina ou um bastão de vidro. A prova é considerada positiva quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor púrpura em até 1 minuto. Na reação negativa não há desenvolvimento de cor púrpura. As enterobactérias são oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outros bacilos Gram negativos. A prova pode ser feita também em culturas em meios sólidos, adicionando-se o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reação inicia-se com o desenvolvimento de cor rósea, marrom e finalmente uma coloração negra na superfície das colônias é indicativa da produção de citocromo-oxidase, representando um teste positivo. O teste é negativo se não ocorrer alteração da cor ou houver o desenvolvimento de uma cor rósea pálida. E. coli Pseudomonas o Sorotipagem (caracterização antigênica)
  • 21. Resumo de microbiologia Diagnostica 21 o Prova bioquímica de TSI (Tríplice Açúcar Ferro – para verificar se a bactéria é uma fermentadora de glicose Tríplice Ferro) TSI - Meio nutricionalmente rico com inibidores que permite o crescimento da maioria das espécies bacterianas, só não cresce as mais exigentes e anaeróbios. O TSI só pode ser realizada com amostras já isoladas em placas com meio seletivo para bacilos gram negativos entéricos. O indicador de pH é vermelho de fenol (pH ácido indicador fica amarelo; pH alcalino o indicador fica vermelho).Um ponto importante é a proporção entre os açucares sendo que esse meio apresenta a proporção de Glicose : Lactose : Sacarose 1:10:10 (g/L), há também tiossulfato de sódio, sulfato ferroso e peptona. sulfato
  • 22. Resumo de microbiologia Diagnostica 22 Fermentação dos Açucares Produção de H2S Se a bactéria produzir a enzima tiossulfato redutase ela ira degradar o tiossulfato de sódio presente no meio produzindo H2S, este reage com o sulfato ferroso formando um precipitado preto de sulfeto ferroso. Para que esta reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido, assim se a base do tubo estiver negra deve ser lida como que a negra bactéria é fermentadora de glicose. Produção de Gás Há bactérias que degradam o ácido fórmico proveniente da fermentação da glicose produzindo H2 ;CO2 devido a ação da enzima formiase. A produção de gás é evidenciada pela formação de bolhas formiase. e ou o meio pode rachar. Se houver muita produção de gás com o deslocamento do meio pode seer indicativo de Klebsiela e Enterobacter. Para prosseguir com as outras provas Bioquímicas devemos usar as colônias de bactérias que cresceram na parte superior do TSI. Entretanto devemos ter certeza que no TSI só tem uma espécie, isso é obtido a partir de meios seletivos e caldos nutritivos. Indol O indol é produzido a partir do tríptofano existente no meio de cultura sob a ação da triptofanase, há também a produção de ácido pirúvico e amônia. O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa “pink” na parte superior do tubo após a adição p-dimetilaminobenzaldeído (reativo de kovacs). dimetilaminobenzaldeído
  • 23. Resumo de microbiologia Diagnostica 23 VM (Vermelho de Metila) Teste que avalia se as bactérias que fermentam a glicose pela via ácida mista, com isso há a produção de vários ácidos (ácido fórmico, lático, acético) que faz com que o pH do meio fique abaixo de 4,4 que é o limite de viragem do indicador de pH. O indicador de pH é o vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 é vermelho e acima de 6 é amarelo. VP (Voges Proskauer) Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica, fermentam a glicose produzindo acetil acetil-metil- carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos.Quando é adicionado KOH e na presença de O2 noglicol atmosférico a acetoína é convertida em diacetila a adicição de alfa naftol nesta reação cataliza a produção de um alfa-naftol anel vermelho.
  • 24. Resumo de microbiologia Diagnostica 24 Citrato Este teste determina se a bactéria é capaz de o citrato de sódio como única fonte de carbono para o seu éria metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, composto por citrato de sódio, fosfato de amônia e por azul de bromo fenol.Com o uso de citrato há a produção de hidróxido de amônia que eleva o pH fazendo que a reação se torne azul.
  • 25. Resumo de microbiologia Diagnostica 25 Urease Há bactérias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio.O indicador de carbonato pH é o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a coloração “pink”. Fenilalanina Desaminase (FAD) Há bactérias que produzem enzimas que desaminam a fenilalanina presente no meio, originando o ácido fenilpirúvico, que reage com o cloreto férrico adicionado ao meio, desenvolvendo cor verde.Essa prova é presuntiva enilpirúvico, para Proteus, Morganela, Providencia.
  • 26. Resumo de microbiologia Diagnostica 26 Lisina descarboxilase(LDC) Há algumas bactérias que possuem a lisina descarboxilase que descorboxila a lisina produzindo a cadaverina mais CO2, essa descaroboxilização alcaliniza o meio.O meio contém o indicador azul de bromocresol, que em pH alcalino apresenta-se em cor roxo e em meio ácido a cor amarela. A reação se processa em anaerobiose deve-se cobrir o se meio com óleo mineral ou cera de carnúba. Mio (Motilidade, Indol e ornitina) Se a bactéria produz a enzima ornitina descarboxilase, ela será capaz de descarboxilar a ornitina produzindo gás carbônico e putrecina, isso eleva o pH do meio. O indicador de pH usado é o púrpura de bromocresol que e, meio. condições alcalinas se torna roxo. É útil para diferenciar entre Klebsiella (negaivo) e Enterobacter (positivo). A produção de Indol pode ser detectado colocando um papel filtro ou algodão umedecido com reativo de indol, na umedecido aula prática o indol foi feito separado para que ficasse de forma mais didática. A motilidade é observada através do aspecto do meio, isso decorre do fato que o meio é semi semi-sólido e permite o crescimento bacteriano por todo o tubo. Se a motilidade é positiva o aspecto do meio será turvo enquanto que
  • 27. Resumo de microbiologia Diagnostica 27 motilidade negativa só observaremos a picada. Fica mais fácil de observar a motilidade pondo os tubos contra um folha de papel pautada, se conseguirmos observar as linhas através do tubo é motilidade negativa.
  • 28. Resumo de microbiologia Diagnostica 28 Se a bacteria for indol + e citrato - pensar em E. coli Se houver a presença de mto gás e citrato +, com lisina e ureia + e colônia mucoide: +indol – klebisella oxygoca - indol – klebisella pneumoniae E. cloaceae – lisina neg e indol neg E. aerogenes – lisina posi e indol neg E. aglomerans – lisina neg e indol posit, motilidade neg Serratia – lisina posit, sacarose neg, motilidade neg Se a bactéria for sem gás ou com pouca produção, lisina posit, sacarose neg e motilidade neg – shigella Meio inalterado – pseudômonas aeroginosa (indulto escuro) ou alcaligenes faecalis (induto esbranquiçado). Bacilos Gram-Negativos Não Fermentadores Pg 93 – figura 5.5
  • 29. Resumo de microbiologia Diagnostica 29 2 grupos importantes: o Enterobactérias BGN-F = Fermentadoras de glicose BGN-NF = Não-Fermentadores de glicose • Maior importância clínica - Pseudomonas aeruginosa (Bacilo Gram-negativo aeróbio, móvel, não-esporulado, Com 1 a 3 flagelos polares, Desenvolve-se bem em diversos meios de cultura e em diversas temperaturas (temp. ótima: 37oC), Produz pigmentos solúveis: piocianina (azul-esverdeado) e fluoresceína (amarelo- esverdeado), Altamente patogênica: resistência a diversos antimicrobianos – provas bioquímicas Oxidase negativos, hidrólise de esculina positiva e catalase positiva) • Vários gêneros – Acinetobacter SP (Utiliza várias tipos de fontes de carbono em seu metabolismo → expandindo seu habitat, Bacilo ou cocobacilo - Infecções: pneumonias, meningites, endocardites, infecções de pele e feridas e ITU), Burkholderia, Stenotrophomonas. • Considerações gerais – Aeróbios, Não esporogênicos, Não utilizam a via fermentativa, Crescem na superfície dos meios de cultura, Nomenclatura constantemente alterada. • Metabolismo - Metabolismo fermentativo e oxidativo. Fatores de virulência • Adesinas (pili e cápsula), cápsula de alginato (confere proteção à bactéria, cepas mucóides – biofilmes, alginato: atividade contra aminoglicosídeos), Produção de proteases e enzimas proteolíticas - inativam citocinas. • Produção de leucocidina: citotoxina que atua na membrana celular dos leucócitos • Produção de hemolisinas: contribui para invasão tecidual através de efeitos citotóxicos • secreção de pigmentos por P. aeruginosa como a piocianina: destruindo o epitélio respiratório • Lipopolissacarídeos (endotoxina) • Exotoxina A: potente inibidor de síntese proteica (necrose) • Exoenzima S: proteína de membrana celular com efeitos citotóxicos e de adesão Mecanismos de Resistência • β-lactamase • Melato-β-lactamase • Cefalosporinase • Efluxo do antimicrobiano • Alteração de proteínas da membrana externa
  • 30. Resumo de microbiologia Diagnostica 30 Identificação Laboratorial • Enzima Oxidase • Motilidade • Cocobacilos ou Bacilos Gram-negativos • Não utilizam CBI na ausência de O2 • Aeróbios estritos • Características que nos fazem suspeitar que estamos frente a um BGN NF - Falta de evidência de fermentação da glicose, Crescimento pobre ou ausência de crescimento em MC. Teste de OF • Oxidação-Fermentação • BGN-NF X enterobactérias (BGN-F) • Diversos açúcares • Tubo aberto (com oxigênio) • Tubo fechado (sem oxigênio) • Base OF (Hugh & Leifson) • [ ] peptonas diminuída • [ ] CBI aumentada • [ ] ágar diminuída • Azul de bromotimol - p/ detecção de ácidos Crescimento - Meios seletivos – Agar Cetrimida (Pseudomonas sp.) – BCSA (Burkolderia cepacia selective agar) • Antibióticos para inibir crescimento de outras bactérias • Crescimento em MC a 42oC – Identificar espécies de Acinetobacter Prova de oxidase e motilidade
  • 31. Resumo de microbiologia Diagnostica 31 Produção de pigmentos • Meio de Tech & Flo – contém peptonas espec especiais e [ ] de 2+ Mg e sulfato aumentada – aumentar a produção de pigmentos – Bacto peptona (Tech) – piocianina (azul turquesa luz visível, sem fluorescência sob UV) – Peptona-3-proteose (Flo) – pioverdina (amarela luz proteose visível, com fluorescência sob UV) Descarboxilação de AA • Caldo Moeller • Pequena quantidade de substrato + inóculo denso • Reação positiva: intensificação da cor púrpura
  • 32. Resumo de microbiologia Diagnostica 32 Diagnostico bacteriológico das infecções da C.S. Bacteremia (presença de bactérias no sangue) pode ser: - Transitoria – microrganismos da microbiota na C.S. - intermitente – bactérias de um foco de infecção primário vai para a C.S - Continua – acesso direto a c.s - Escape – após 1 a 2 dias do inicio da antibioticoterapia supostamente adequada. Septicemia – complexa reação inflamatória sistêmica a uma infecção, é uma condição toxica – sepse (LPS), o sangue se apresenta com cels fagociticas e a multiplicação dos microrganismos é maior que a remoção pelos fagócitos. Doenças do sistema vascular Tipos de infecção Intravascular o Endocardites – anormalidade no endocárdio pela presença de microrganismos no sangue (coletar 3 amostras, punção venosa de diferentes lugares, em intervalos de 15 a 30 min). o Bacteremia associada ao uso de cateter intravenoso – rotas de infecção superfície externa do cateter. Infecções da C.S. podem ser: o Infecçoes primarias do acesso vascular (por uso de cateter, tubos subcutâneos ) complicações – infecção da C.S, focos metastáticos em outros órgãos. o Cateter vascular – corpo estranho processo inflamatório, infecção por pqnos inoculos (que pode ser contaminação do cateter, do canhão, das soluções ou hematogênica – foco infeccioso a distancia). o Fatores do hospedeiro – idade, imunossupressão, seleção da microflora com antibióticos, gravidade da doença de base e etc. o Fatores relacionados ao acesso vascular – duração do cateterismo, habilidade de introduzir o cateter, forma de inserção, trocas e etc. Infecções extravasculares – multiplicação localizada microrganismos que são drenados para os vasos linfáticos e caem na C.S.
  • 33. Resumo de microbiologia Diagnostica 33 Diagnostico - Presença de drenagem purulenta no sitio vascular - Sinais flogisticos locais: dor, calor, eritema. o Hemocultura – numero de frascos coletados devera ser considerado de acordo com a condição clinica do paciente. Duas a três amostras de diferentes locais em intervalo de 30 min. o Cultura de cateter venoso central (CVC)- suspeita de colonização – presença de secreção purulenta - CVC curta permanência (>15UFC) – retirar a ponta (semi quantitativa) + hemocultura (qualitativa) = verificar se a hemo e a CVC de ponta for + tem o msm microrganismo. - CVC longa permanência – não remover, cultura da secreção peri cateter + hemocultura. Hemocultura CVC Fazer - Não cultivado Cultivar CVC - - Investigar outros focos - + > 15 UFC Não tratar observar evolução (colonização) + + >15UFC Tratamento para bacteremia Coleta da amostra - antissepsia local, volume da amostra, anticoagulograma, meio de cultura. - preparo do sitio de coleta – lavar com sabão, enxaguar em água estéril, aplicar iodo e secar, aplicar álcool e secar. - Coleta – seringa e agulha sistema fechado diretamente do cateter Meios de cultura utilizados – caldo rico (TSB, BHI) incubar a 35ºC. Resultados – S. aureus, S. pneumoniae, p. aeroginosa, c. albicans e enterobacterias.