1. Universidad Autónoma de Sinaloa
Facultad de Agronomía
José Refugio García Quintero
Jacobo Enrique Cruz Ortega
Raymundo S. García Estrada
José Armando Carrillo Fasio
Carlos R. Morales Cazares
Sostenes Montoya Angulo
Culiacán, Sinaloa. Julio del 2002

2. PROLOGO
Uno de los problemas fundamentales expuestos por los alumnos que reciben la
cátedra de Virología con Laboratorio “es que la gran mayoría de libros que versan
sobre este tema, se encuentran en un idioma que no es el Español y por lo tanto,
esto genera graves problemas en el proceso enseñanza-aprendizaje. Debido a lo
anterior, un grupo de maestros que en diversas ocasiones hemos tenido la
satisfacción de impartir este curso en la Facultad de Agronomía de la Universidad
Autónoma de Sinaloa, conjuntamos esfuerzos para la elaboración de este manual de
prácticas.
En este manual se integran las diversas formas de cómo los virus pueden
transmitirse para causar la enfermedad en los diferentes cultivos, además de conocer
las técnicas, por medio de las cuales podemos observar las alteraciones que causan
a nivel celular, así como conocer la forma y tamaño de estos fitopatógenos, que son
características importantes para el diagnóstico e identificación.
Es importante señalar que el presente es un compendio de diversas
publicaciones selectas que hablan sobre el tema de los virus y parte del curso que
los autores recibieron durante su estancia en la Universidad Autónoma de Chapingo
y Colegio de Postgraduados, en donde realizamos nuestros estudios de postgrado;
también es importante aclarar que esta es la primera vez que se presenta de una
manera formal un manual de prácticas en esta área.
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3. OBSERVACIÓN DE SÍNTOMAS EXTERNOS CAUSADOS POR VIRUS
Algunos cientos de virus de plantas fanerógamas se han descrito, lo cual no
sorprende ya que hay un gran número de síntomas atribuidos a estos patógenos. Un
amplio rango de anormalidades es causado por los virus y casi nunca las
características de la planta pueden ser cambiadas por la infección del virus, ya que la
mayoría de los efectos por ejemplo, parecen en ocasiones escapar a la infección.
Las relaciones entre la multiplicación de los virus y sus consecuentes
síntomas, aún es poco entendido, pero es conveniente señalar que depende de gran
medida de algunos factores como: medio ambiente, la relación virus-hospedante,
condiciones fisiológicas, edad de los tejidos del hospedera y el tiempo que estos
queden infectados.
Los síntomas originados por el ataque del virus fitopatógenos se dividen en
dos grupos: primarios y secundarios; los primarios son las manifestaciones iniciales
de la planta y resultan frecuentemente mediante inoculaciones mecánicas artificiales
y en algunos casos de infecciones naturales (transmisión a través de la semilla de
plantas infectadas). Los síntomas secundarios ocurren posteriormente, y, se
presentan en parte no inoculadas de las plantas como es el caso de las infecciones
sistémicas.
El rango de hospedantes de un virus y los detalles de los síntomas que este
causa son características específicas del propio virus y estas características pueden
ser después usadas, juntas con otras, en la identificación de los virus.
Dentro de los principales síntomas que pueden causar los virus podemos citar:
los cambios de calor (mosaicos, amarillamientos, necrosis, etc.), deformaciones
(enrollamientos, tumores, proliferación de ramas, etc.), reacciones de
hipersensibilidad o locales, entre otros.
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4. OBJETIVO: Familiarizarse con los diferentes tipos de síntomas causados por virus;
Así como también demostrar la influencia que tienen los factores ambientales en el
desarrollo de la sintomatología y para no confundir los síntomas causados por virus
con los que causan otros patógenos (bióticos y abióticos).
MATERIALES: Plantas de calabaza mostrando síntomas del virus mosaico de la
sandía; fríjol con el virus mosaico común del fríjol; tabaco con el virus mosaico del
tabaco; papayo con el virus mancha anular de la papaya; sandía con virus mosaico
de la sandía, calabaza con virus mosaico de la calabaza y diversas plantas
diferenciales mostrando lesiones locales y sistémicas con diferentes virus.
METODOLOGÍA:
• Observar cuidadosamente los materiales colocados en las mesas del
laboratorio y los encontrados en campo.
• Describir de acuerdo a su apreciación los síntomas causados por virus.
• Recuerde que la apreciación de los síntomas más característicos es una de
las herramientas más importantes para un diagnóstico acertado.
Síntomas locales en G. globosa y D. metel Síntomas sistémicos en C. pepo y N. Tabacum
RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Registrarlo en su cuaderno de prácticas.
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5. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
De la Isla M.L. 1987. Fitopatología Centro de Fitopatología. Chapingo, México. 384 p.
Matthews, R.E.F. 1981. Plant Virology. Ed. Academic Press, New York (London). 859 p.
Bos, L. 1978. Symptom of virus diseases in plants. Ed. Academic Press, New York. 125 p.
5

6. TRANSMISIÓN MECANICA
Los virus no tienen un mecanismo propio para ingresar a las células de las plantas,
ni tampoco, para poder salir de ellas al exterior, los virus no se diseminan por el
viento o a través del agua como en el caso de otros patógenos, por lo que los virus
fitopatógenos se transmiten de una planta enferma a una planta sana por distintos
métodos. La inoculación mecánica incluye la introducción de un virus hacia una
planta sana, este método de transmisión es de gran importancia en muchos aspectos
de la virología experimental, particularmente, en las pruebas de virus y la
susceptibilidad que presentan las células hospedantes contra éstos. Todos los virus
pueden ser transmitidos a algunas plantas por inoculación mecánica, pero no todos
pueden incitar y establecer infección efectiva.
En teoría, las partículas de virus pueden ser introducidas a las células vivas
por inoculación mecánica, pero para que el virus llegue a ser funcional depende de
diversos factores dentro de los cuales podemos mencionar; el grado de
susceptibilidad de la célula receptora, funcionamiento del genoma viral dentro de
dicha célula, condiciones necesarias para la maduración del virus, etc.
La transmisión de virus de una planta enferma a una sana puede realizarse
por simple contacto y por el roce de una planta con otra, en la mayoría de los casos
de inoculación mecánica es necesario que exista una herida o abrasión de células
durante la inoculación para el establecimiento de la infección; la finalidad de usar
abrasivos en esta inoculación es para alterar la susceptibilidad de la hospedera
mediante la producción: la fuente de inóculo, preparación del inóculo, método de
inoculación, planta prueba, luz, temperatura, nutrición, entre otros.
OBJETIVO: Demostrar la inoculación mecánica sobre distintas plantas indicadoras y
las reacciones que estos producen como consecuencia del ataque de distintos virus.
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7. MATERIALES: Plantas indicadoras: Gomphrena globosa, Chenopodium quinoa, C.
Amaranthicolor, Datura stramonium, D. metel, Physalis floridana, Capsicum annum,
Lycopersicon esculentum, Cucurbita pepo, Citrullus vulgaris, Cucumis spp.,
Phaseolus spp., Nicotiana glutinosa, Nicotiana tabacum, Var. Samsum, N. Xanthi, N.
tabacum Var. Hicks, N. clevelandi, entre otras, carborundum de 600 mallas,
etiquetas colgantes, morteros, solución amortiguadora (Buffer Ph. 7.0), cotonetes,
picetas con agua y plantas enfermas con distintos virus.
METODOLOGÍA:
• Macerar trocitos de hojas, tallos y frutos enfermos en mortero con dos mililitros
de solución amortiguadora con un ph de 7.0.
• Espolvoree carborundum de 600 mallas por pulgada cuadrada en el lugar de
la inoculación (hojas).
• Impregne el cotonete de savia infectiva sumergiéndolo en el mortero.
• Talle ligera y uniformemente las hojas espolvoreadas con carborundum.
• Conserve suficiente extracto infectivo en el cotonete para que la hoja quede
humedecida, evitando el exceso de líquido y que no seque rápido en la hoja.
• Elimine el exceso de abrasivo lavando las partes inoculadas con agua de la
llave.
• Etiquétese y déjese en observación por un período de 15-20 días.
Maceración de tejido e inoculación, mediante la técnica de frotis.
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8. RESULTADOS:
Observar a las 24 h después de la inoculación para registrar posible daño por
frotación excesiva del abrasivo y posteriormente cada tercer día durante tres
semanas para detectar la aparición de síntomas en las plantas inoculadas.
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
Alvizo U., H.F. 1982. Identificación del virus mosaico de la calabaza en Cucurbita spp. Y sus
vectores, Tesis de Maestría en Ciencias, C.P., Chapingo, México.
Matthews, R.E.F. 1981. Plant virology. Ed. Academic Press, New York (London). 859 p.
Pinto C., B. 1981, Virología Agrícola. Departamento de Parasitología. U.A.Ch., Chapingo,
México. 175 p.
Rosenkranz, E., and G.E. Scott. 1987. Comparison of inoculation with maize dwarf mosaic
virus on the abaxial leaf surfaces of corn.
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9. INHIBIDORES DE LA TRANSMISIÓN MECANICA
Uno de los problemas que se enfrentan durante el estudio de las inoculaciones
mecánicas con virus transmitidos a través de la savia es la no-transmisión de dichos
patógenos, esto se debe a la presencia en la savia de las plantas infectadas de
ciertas sustancias que no permiten la infección, tales substancias se encuentran
naturalmente en algunos hospedantes y se les conoce con el nombre de inhibidores
y no son muy comunes en ciertas plantas, sino solamente en algunas especies.
Es importante distinguir inactivadores de virus, inhibidores de infección;
muchas sustancias inhiben la infección, estas incluyen algunas proteínas de las
plantas y otros compuestos de la savia, enzimas, sueros de proteínas, polisacáridos
y varios compuestos de bajo peso molécular. Los inhibidores los podemos distinguir
dentro de tres categorías: 1) inhibidores que tienen efecto sobre el virus (taninos,
polisacáridos); 2) inhibidores que tienen efecto sobre la planta que se va infectar
(polisacáridos, proteínas, glucoproteínas); y, 3) inhibidores de efecto indirecto sobre
el virus (quinonas, fenoles). La familia de plantas que contiene mayor cantidad de
inhibidores es la Rosaceae.
OBJETIVO: Demostrar el grado de interferencia que puede ocurrir en la infección y
multiplicación de los virus debido a la presencia de inhibidores.
MATERIALES: Extractos sanos de chile, pepino, higuerilla y chual, plantas con
síntomas de virus mosaico del tabaco (VMT), plantas indicadoras de Nicotiana
tabacum var. Xanthí, pipetas de un mililitro, tubos de ensaye de 5 ml de capacidad,
solución buffer, agua destilada, manta de cielo, mortero con su mazo, carborundum
de 600 mallas, cotonetes, savia del V. M.T.
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10. METODOLOGÍA:
• Macerar tejido de la planta enferma con VMT, y fíltrelo a través de una manta
de cielo.
• Extraer y filtrar por una manta de cielo las plantas que se van estudiar con
respecto a los inhibidores, colocar por separado en un tubo de ensaye 0.5 ml,
de la savia de cada planta y el otro 0.5 ml de agua destilada.
• Mezclar 0.5 ml, de savia infectiva en cada uno de los tubos de ensaye que
contienen savia a probar y agua destilada.
• Inocular mediante frotis de hojas de Nicotiana tabacum var. xanthi
(previamente espolvorearlas con carborundum) e incubar a temperatura
ambiente.
RESULTADOS:
1- Anote el número de lesiones locales que se observan en las hojas inoculadas para
cada uno de los tratamientos y compárelos con el testigo.
2- Comprare sus resultados con los demás compañeros.
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
Gibbs, A. And H. Bryan. 1976. Plant virology the principles. Editorial Edward Arnold, London.
292 p.
Ragleti, H. W. 1957. Behavior and nature of a virus inhibitor occurring in Dianthus
cargophyllus L. (English summary) 63: 245-344 p.
Smith, K.M. 1974. Plant viruses, Ed. Chapman and Hall. London. 211 p.
10

11. TRANSMISIÓN POR INJERTO
La transmisión por medio de injerto se ha utilizado desde el siglo XVII para la
obtención de plantas de tulipanes con síntomas de variación; la práctica del injerto es
esencialmente como una forma de propagación vegetativa en la cual la parte de una
planta crece sobre otra planta y para que este tipo de transmisión tenga efectividad
debe establecerse una continuidad funcional entre el tejido injertado y la planta
receptora aunque sea por poco tiempo. Los virus son transmitidos por injerto más
eficientemente cuando este se une perfectamente lo cual sucede solo cuando el
cambiúm está en contacto y los tejidos son compatibles; sin embargo, no siempre es
necesario tener una buena unión entre la planta donadora y la receptora para que
exista transmisión del virus, y estos puedan ser transmitidos por medio de
aproximaciones entre especies distintas.
Existen diferentes tipos de injerto y algunos de los más usados son de tipo
bisel, silla, aproximación, lengüeta, yema, implantación, entre otros. En virología no
es tan importante que el injerto prenda sino poner en contacto los tejidos vasculares
de la planta enferma con los de la planta sana.
OBJETIVO: Conocer los tipos de injertos más usados para la transmisión de virus
fitopatógenos.
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12. MATERIALES: Plantas sanas y enfermas (tabaco, chile y tomate), navajas de
rasurar, parafilm, bolsas de polietileno.
METODOLOGÍA: (CUÑA)
• Corte una púa de la parte donante.
• Etiquete cada una de las plantas receptoras.
• Corte el tallo del patrón o parte receptora a una altura cuyo diámetro sea igual
al del extremo de la púa.
• Inserte la púa en el patrón y ligarlo con parafilm.
• Cubra con una bolsa de plástico la planta injertada para evitar la
deshidratación,
• Haga agujeros pequeños en la bolsa para adaptar la planta a las condiciones
del medio.
• Observe periódicamente el desarrollo de los síntomas.
Planta de papa injertada con la técnica de cuña.
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13. RESULTADOS: Registre sus resultados, mencione las ventajas y desventajas de
esta técnica y discútalo con los compañeros de su grupo.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Gibbs, A. and H. Bryan. 1976. Plant virology the principles. Edit. Edward Arnold. London. 292
p.
Matthews, R.E.F. 1970. Plant virology. Academic Press. New York, London. 759 p.
Pinto C.B. 1981. Virología Agrícola. Departamento de Parasitología Agrícola. UACH.,
Chapingo, México. 175 p.
Smith, K.M. 1980. Introduction to virology. Ed. Chapman and Hall, London and New York.
212 p.
TRANSMISIÓN POR SEMILLA
Aunque los virus infectan a los vegetales en forma sistémica y se encuentra en toda
la planta, no es frecuente encontrarlos en la semilla. El primer reporte de que un virus
se podía transmitir por este medio, fue en 1919 por Reddick y Stewart, estos
Investigadores encontraron que el Virus Mosaico común del Fríjol se transmite desde
un 10 a un 80% por medio de la semilla infectada.
Alrededor de una quinta parte de los virus fitopatógenos conocidos a la fecha
se transmiten por semilla; sin embargo, es muy posible que el número de virus que
se transmite por este medio sea mayor al que se ha estimado, debido a lo siguiente:
Las plantas provenientes de semillas infectadas pasan desapercibidas debido a que
en algunos casos éstas no presentan síntomas severos.
El porcentaje de transmisión por semilla es bajo y se necesita una población muy
grande de plantas para poder detectarlo.
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14. Para explicar la transmisión por semilla de algunos virus se han propuesto varias
hipótesis: Crowley en 1959; citado por Fernándes, 1969; estudió el comportamiento
de tres virus que se transmiten por éste medio: Virus mosaico común del frijol
(BCMV), Virus mancha anular del tabaco (VMAT) y el Virus mosaico estriado de la
cebada (BSMV), comprobando que todos ellos pueden infectar los embriones de la
semilla de su hospedante, ya sea por infección de gametos o por la infección del
embrión en las primeras etapas de desarrollo.
Otra hipótesis supone que la transmisión se lleva a cabo por contaminación de la
semilla en la parte externa.
Por otra parte, se ha pensado que el virus al moverse en los tejidos vasculares y no
tener conexión con el embrión el virus no puede infectarlo; la infección del virus en la
semilla es tal, que ésta en ocasiones pierde su capacidad germinativa.
Un virus que se transmite por semilla puede invadir el polen o el óvulo, es capaz de
sobrevivir en el gameto, al almacenaje y deshidratación de las semillas y no puede
ser inactivado durante el desarrollo de la semilla. Algunos virus pueden durar
“Viables” en la semilla por muchos años como: el Virus Mosaico Común del Fríjol (30
años), el Virus Mosaico del Pepino (2.2 años), Mosaico de la Soya (2 años), Mosaico
de la Calabaza (3 años), etc.
OBJETIVO: Determinar el porcentaje de transmisión de virus por semilla.
MATERIALES: Suelo desinfestado, vasos de polietileno, etiquetas, semillas de fríjol
infectadas con virus.
METODOLOGÍA
• Llene 100 vasos con suelo desinfestado.
• Siembre 100 semillas de fríjol y etiquete.
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15. • Observe periódicamente el desarrollo de la planta para determinar si se
muestran los síntomas de la enfermedad.
RESULTADOS: Anote el porcentaje de plantas con síntomas durante 30 días.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Agarwal, K.U. and J.B. Sinclair. 1987. Principles of seed Pathology. Volume I and II, CRC.
Press INC. Boca Ratón, Florida. 352 p.
Bowers, G.R. Jr., and Goodman, R.M. 1979. Soybean mosaic virus: Infection of soybean
seed parts and seed transmisión. Phytopathology, 69:569-572.
Fernández V., M. 1969. Introducción a la Fitopatología. Colección Científica. INIA. Tomo III.
Virus. México. D.F. 860 p.
Johansen, F., Edwards, M.C., and Hampton, R.O. 1994. Seed transmisión of viruses: Current
perspectives. Ann. Rev. Phytopathology, 32:363-386.
TRANSMISIÓN POR CUSCUTA
Se sabe que muchas especies de cuscuta (Cuscuta spp.), una planta parásita
superior perteneciente a la familia convolvuláceae, pueden transmitir virus
fitopatógenos. Estas plantas difieren en su rango de hospedantes y por lo menos 20
especies han sido usadas en los trabajos de investigación relacionados con virus
fitopatógenos, algunas de las especies más comúnmente utilizadas son: Cuscuta
europea, C. Ephitymun, C. Epilium, C. Gromovi, C. Chinensis, C. Americana, C.
Japónica, C. Lupiliformes y C. Pentogena, sobresaliendo no obstante, C. Campestris
y C. subinclusa. Puesto que los haustorios de estas plantas parásitas llegan
directamente al sistema vascular del hospedante, este tipo de transmisión es muy
similar a la que se realiza por injertos, con la ventaja adicional de que es menos
especifica. Esta forma de transmisión resulta sumamente útil en el caso de aquellos
virus que no pueden transmitirse por otros medios o cuando se quiere separar dos
virus de un hospedante como por ejemplo cuando se tiene la mezcla de los virus
moteado del chícharo y el virus de la marchitez del chicharo: El primero se transmite
únicamente por cuscuta y el segundo no lo hace, algunos virus se multiplican dentro
15

16. de esta planta parásita y se sabe que son transmitidos más eficientemente
transmitidos que aquellos que no lo hacen.
OBJETIVO: Conocer la técnica de transmisión de virus por cuscuta.
MATERIALES: Plantas de calabacita sanas e infectadas con el virus mosaico del
pepino, plantas de cuscuta.
METODOLOGÍA
• En una planta de calabaza infectada con el virus Colocar la planta parásita
(cuscuta) enredándola.
• Establecer un puente con una planta de calabaza sana.
Plantas de calabaza sana y enferma conectadas mediante un puente de la planta parasita
(Cuscuta sp.), para obtener la transmisión de virus.
RESULTADOS: Realice observaciones cada tercer día, para registrar la aparición de
síntomas.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Bennet, C.W. 1967. Plant viruses: transmission by dodder, In Methods in Virology Vol.1.
Maramorosch, K. and. Koprowski, H. eds. Academic Press, London, p. 393-401.
Walkey, D.G.A. 1985. Applied plant virology. Chapman and Hall. London p.203.
16

17. FORMACIÓN DE UNA COLONIA DE ÁFIDOS LIBRES DE VIRUS
Dentro de la clase insecta, el principal grupo de vectores son los áfidos, en este
grupo existen formas sexuales y partenogenéticas; vulgarmente se les conoce como
pulgones, piojos de las plantas y áfidos. Los pulgones son parásitos específicos de
las plantas que han logrado realizar numerosas adaptaciones que le permiten
aprovechar con mucha efectividad el medio en que viven.
Los áfidos causan daños de manera directa en las plantas al succionar la
savia y aunque su daño no llega a ser importante en algunos cultivos agrícolas; los
daños que causan indirectamente al transmitir algunas enfermedades sobre todo de
etiología viral son los considerados de mayor importancia por los agricultores.
Aproximadamente alrededor de 200 especies de pulgones han sido reportados
como verdaderos o al menos como posibles vectores del virus en las plantas.
Basándose en la transmisión por insectos se pueden clasificar a los virus en:
“No persistentes” y “Persistentes”. Los no persistentes se caracterizan por que el
vector los adquiere y transmite rápidamente; mientras que en los persistentes dichos
períodos son más prolongados y este tipo de virus puede permanecer infectivo
durante un período largo de tiempo. Entre los pulgones más eficientes en la
transmisión de virus podemos citar a Myzuz persicae Sulzer ya que transmite más de
100 virus de plantas; Aphis gossiipii Glover con alrededor de 60 virus.
OBJETIVO: Determinar que los virus no persistentes no se transmiten a la progenie y
obtener áfidos que estén libres de virus para efectuar las pruebas de transmisión.
17

18. MATERIALES: Jaulas, plantas de chile sanas, pinceles, agua destilada, cajas de
petri, papel filtro, etiquetas adhesivas y recolectar pulgones del campo.
METODOLOGÍA:
• Humedecer un papel filtro y depositarlo en el fondo de la caja petri.
• Depositar un foliolo de chile sobre un papel filtro.
• Transferir 10 áfidos al foliolo con un pincel usándolo con sumo cuidado, cerrar
la tapa y etiqueta.
• Guardar la caja a temperatura ambiente.
RESULTADOS: Registrar el número de ninfas obtenidas a las 24, 48 y 72 horas.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Coronado R., y A. Márquez. 1983. Introducción a la Entomología. Edit. Herrera.
Holman, J. 1974. Los áfidos de Cuba. Instituto de Entomología de Praga, Checoslovaquia.
Instituto Cubano del Libro. La Habana, Cuba.
Lambers, R.H. 1972. Aphids Their Life cycles and their roles virus vectors. In viruses J.A.
Bory Wegeningen centrel for agricultural Publishing and Dorohatation, 325 p.
18

19. TRANSMISIÓN POR ÁFIDOS
La relación de los virus de vegetales con sus insectos vectores es uno de los temas
más importantes de las investigaciones sobre virus. Todos los grupos de vectores
llevan a cabo la transmisión de los virus mediante el proceso de alimentación, pero
algunos insectos, sólo transmiten virus específicos, de ahí la importancia de
reconocer a los insectos vectores y saberlos diferenciar.
Los áfidos, insectos pertenecientes al orden Homóptera, súper familia Aphidoidea
y principalmente los de la familia Aphididae, constituyen el grupo de vectores más
importantes de virus de plantas. La importancia de estos insectos es que se agrupan
en colonias formadas por numerosos individuos que poseen una amplia capacidad
para reproducirse y de adaptarse a condiciones climáticas extremas, teniendo la
facultad de volar a grandes distancias, ayudados por corrientes de aire, con esto
diseminando a los virus, ya que tienen una capacidad infectiva muy grande.
Los virus transmitidos por este tipo de insectos son conocidos comúnmente como
“NO PERSISTENTES” o de “ESTILETE”, debido a que el vector se vuelve
óptimamente infectivo después de alimentarse de una planta enferma por sólo unos
19

20. segundos, adquiriendo el virus pero pierde su capacidad de transmisión después de
que deja de alimentarse al menos que vuelva a adquirir el virus de la planta enferma.
Para la transmisión de virus persistentes los áfidos requieren de un período mayor de
alimentación para establecer la infección, además un período de incubación que
varía de unas cuantas horas a días; el insecto usualmente permanece infeccioso por
períodos prolongados y a veces el resto de su vida; se ha determinado que cuando
existe un período de ayuno por lo menos de 30 minutos tiene una mayor eficiencia en
la transmisión y que las formas ápteras son los vectores más importantes en el
ámbito experimental.
Son numerosos los virus transmitidos por pulgones dentro de los cuales
podemos mencionar el virus mosaico de la sandía (VMS), virus mosaico del pepino
(VMP), virus mosaico de la soya (VMS), virus mancha anular de la papaya (VMAP),
entre otros.
OBJETVOS: a) Determinar la importancia de transmisión de virus por áfidos y que
el alumno conozca la técnica de transmisión por estos insectos.
b) Que el alumno compare la eficiencia de transmisión de virus por áfidos, con
ayuno y otros sin ayuno.
MATERIALES: Cajas de petri, pinceles, plantas de calabaza enfermas con virus
mosaico de la sandía, plantas de calabaza sanas, etiquetas colgantes, navajas de
rasurar, pulgones (Myzus persicae). Jaulas.
METODOLOGÍA:
• Coloque 10 pulgones en una caja de petri y déjelos en ayuno por un período
de 30 minutos.
• Una vez transcurrido dicho tiempo, transfiéralos de manera individual a la
fuente del virus mosaico de la sandía.
20

21. • Manténgalos por un período de 30 y 60 segundos (5 y 5) y deposítelos en las
plantas de calabaza sanas, posteriormente confínelos a la jaula.
• Elimine los áfidos 60 minutos después de haberlos colocado en la planta sana.
• Etiquete cada una de las plantas usadas en la prueba.
• Observe periódicamente las plantas.
Transmisión por áfidos Myzuz persicae
RESULTADOS: Describa los síntomas que observe y discútalo con sus compañeros.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Carter, W. 1973. Insects in relation to plant disease. Wiley 2da. Ed. London. 759 p.
Corbett, M.K. and H.D. Sisler. 1967. Plant virology. University of Florida. Press Book. 151 p.
Fernández, V. M. V. 1969. Introducción a la Fitopatología. Colección científica I.N.I.A.
Volumen I Virus.
Matthews, R.E.F. 1981. Plant Virology. Ed. Academic Press, New York (London). 859 p.
21

22. TRANSMISIÓN POR CHICHARRITAS
Las chicharritas (Homóptera: Cicadellidae) es uno de los grupos biológicos que
transmiten virus circulativos y propagativos. En la actualidad se estima que existen
alrededor de 130 especies que son vectores de virus y que se encuentran repartidos
en 58 géneros. El primer reporte de que una chicharrita podría ser transmisora de
enfermedades virales fue hecho por Hasimoto; este investigador demostró que
Nephottetix apicalis transmite el virus del enanismo del arroz.
Las chicharritas son buenos insectos voladores y requieren de un período de
adquisición prolongado para la obtención de virus de las plantas hospedantes, pero,
una vez adquirido, estos insectos permanecen virulíferos, inclusive, por el resto de
sus días. El período de incubación es de una a dos semanas cuando menos y el
proceso replicativo de los virus en el vector ocurre principalmente en el intestino,
hemolinfa, células epiteliales, tubos de malpighi, órganos reproductivos.
Existen varios virus que son transmitidos por este grupo de vectores alguno de
los cuales son de gran importancia en México, dentro de ellos podemos mencionar el
virus rayado fino del maíz (VRFM) el cual es transmitido por Dalbulus maydis y D.
Elimatus disminuye de un 50 a un 70% la producción; el virus mosaico del maíz
(VMM) transmitido por Peregrinus maydis, reduce hasta en un 50% la producción de
22

23. maíz en el sureste de México. Otros virus transmitidos por chicharritas son el virus
causante del tumor y heridas del trébol, el virus “curly top” de la remolacha, entre
otros.
OBJETIVOS: Determinar la transmisión de virus por chicharritas.
MATERIALES: Aspirador, pinceles, plantas con síntomas del virus rayado fino del
maíz, etiquetas, plantas sanas de maíz, jaulas de madera, jaulas de unicel,
chicharritas (Dalbulus maydis)
METODOLOGÍA:
• Colectar con un aspirador bucal cinco chicharritas de la colonia libre de virus
para que se alimenten de plantas de maíz enfermas con el virus rayado fino
del maíz por un período de cinco días.
• Efectúe transferencias de sus chicharritas a plantas sanas de maíz cada dos
días.
• Observe sus plantas continuamente para detectar la presencia de síntomas y
tome en cuenta el período de incubación de la enfermedad.
Chicharritas transmisoras de virus
RESULTADOS:
Elabore un cuadro de los resultados obtenidos y compárelos con sus compañeros.
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24. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
Agrios, N.G. 1985. Fitopatología. Editorial Limusa, México. D.F. 756 p.
Salas T.,V. 1986. Técnicas de la inoculación del rayado fino del maíz. Tesis de Maestría en
Ciencias. C:P: Montecillo, México. 99p.
Delgadillo S.,F.1984. Virosis en Maíz. Memoria XI Simposio Nacional de Parasitología
Agrícola. I:A:P, Querétaro, Qro. 225-228 pp.
TRANSMISIÓN POR COLEOPTEROS
Los escarabajos pueden llegar a ser infectivos después de alimentarse de una planta
durante tres a cinco minutos, sin embargo, la eficiencia en la transmisión puede
incrementarse con períodos de adquisición de uno o dos días, al removerlos de
plantas enfermas a plantas sanas, la habilidad para transmitir los virus por estos
coleópteros de clima de días a semanas. Son varios los virus que se han reportado
que se transmiten por coleópteros, destacando dentro de estos, el virus mosaico de
la calabaza (VMC), el cual es transmitido por Acalyma thieme, A. trivittata, Diabrotica
balteata, y D. Undecimpuntacta: También se reporta que el período de adquisición
del virus por A. trivittata es no menos de cinco minutos y que el período de latencia
es más de 10 horas.
Los grupos TYMOVIRUS, COMOVIRUS y BROMOVIRUS, cuyos miembros
se caracterizan por poseer partículas isométricas, fáciles de transmitirse
mecánicamente y muy termoestables son transmitidos por estos grupos de
coleópteros.
OBJETIVO: Determinar la importancia de la transmisión del virus mosaico de la
calabaza por coleópteros.
24

25. MATERIALES: Plantas de calabaza infectadas con el virus mosaico de la calabaza,
jaulas de madera, jaulas de unicel, plantas de calabaza sanas, Diabrotica balteata y
pinceles.
METODOLOGÍA:
• Transfiera cuatro insectos de Diabrotica balteata de la colonia libre de virus de
• las plantas de calabaza enfermas Zuchinii gray y dele un período de 24 horas
de alimentación.
• Transcurrido el tiempo de alimentación, paselos a plantas de calabaza sanas y
déjelos por 24 horas.
• Elimine los insectos.
• Guarde las plantas inoculadas a temperatura ambiente y observe el desarrollo
de síntomas.
RESULTADOS: Registre el número de plantas enfermas para así determinar el
porcentaje de transmisión.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Alvizo, V.H. 1982. Identificación del virus mosaico de la calabaza en Cucurbita spp. Y sus
vectores. Tesis de Maestría en Ciencias C.P., Chapingo, México, 57 p.
Gibbs, A. and B. Harrison. 1975. Plant virology, the principles Edward Arnold, Camberra. 292
p.
Matthews, R.E. 1981. Plant virology. Second Edition. Academic Press New York. 598-601 pp.
25

26. PROPIEDADES DE LA SAVIA INFECTIVA
PUNTO FINAL DE DILUCIÓN
El punto final de dilución es el punto en el cual la savia de las plantas infectadas que
son inoculadas mecánicamente fracasan en la infección cuando las diluciones se
incrementan; esto obviamente depende de la concentración del virus; pero también
del diluyente (agua o fosfato) (buffer al 0.01 molar y con un PH de 7.0) , las
condiciones de las plantas probadas, el virus (razas) y el abrasivo usado para facilitar
la infección. El punto final de dilución es muy variable y depende en gran medida del
virus que se trate, en forma general podemos comentar que el rango promedio para
virus de plantas fluctúa entre 10 –1 a 10 –7.
OBJETIVO. Determinar el punto máximo de dilución del virus en estudio.
MATERIALES. Tubos de ensaye, plantas enfermas con el virus en estudio, pipetas,
morteros, vasos de precipitado de 50 mililitros, rejillas para tubos de ensaye,
carborundum, plantas sanas de distintas variedades, agua destilada estéril, manta de
cielo, etiquetas y cotonetes.
26

27. METODOLOGÍA:
• Macere los tejidos de la planta con problemas de virus y filtre el extracto a
través de una manta de cielo.
• Agregue en ocho tubos de ensaye nueve mililitros de agua destilada estéril.
• Con una pipeta graduada agregue en uno de los tubos de ensaye un mililitro
de extracto infectivo para formar una dilución de 10-1; agite con el fin de
homogenizar dicha solución y adicione a un segundo tubo para formar la
dilución de 10-2, repita el proceso hasta formar las diluciones de 10-6 y 10-7.
• Empezando con la máxima dilución inocule hojas de la planta indicadora.
• Etiquete sus plantas inoculadas y colóquelas en el invernadero a temperatura
ambiente.
Hojas de Chenopodium amaranthicolor inoculadas mecánicamente, con savia de planta enferma a
diferentes diluciones.
RESULTADOS: Anótelos en el siguiente cuadro:
DILUCIONES No. DE LESIONES LOCALES
-1
10
27

28. 10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
Testigo sin diluir
PUNTO DE INACTIVACIÓN TÉRMICA
La mayoría de los virus son muy sensibles a las altas temperaturas de tal manera
que los que afectan a las plantas ninguno cruza de 100°C durante 10 minutos, que
es el tiempo universalmente aceptado para la determinación de su resistencia al
calor en los jugos extraídos; de tal manera que podemos definir al punto final térmico
como la temperatura máxima que soporta un virus sometido a diferentes
temperaturas durante un período de exposición de 10 minutos. Esta prueba junto con
el punto final de dilución y la longevidad “In vitro” (propiedades físicas de la
savia)constituye uno de los parámetros más importantes utilizados para la
identificación de los virus sobre todo en aquellos laboratorios donde se carece de
microscopios electrónicos y centrifugas y otros accesorios importantes para la
identificación de estos patógenos.
OBJETIVO: Conocer el punto de inactivación térmica del virus en estudio.
MATERIALES: Termómetros, vasos de precipitado, tubos de ensaye, cronómetro,
pipetas, mecheros, soporte, agua destilada, baño maría, cotonetes, manta de cielo,
carborundum, mortero con su mazo, rejilla, plantas infectadas con virus, planta que
reaccione con lesiones locales y un recipiente que contenga hielo o en su defecto
agua helada.
28

29. Inocule la savia de cada tubo en una planta indicadora (de preferencia que reaccione
con síntomas locales), empezando por los tratamientos mayores hasta llegar al
menor con el fin de evitar posibles contaminaciones.
METODOLOGÍA:
• Depositar dos mililitros de savia natural, sin diluir procedente de plantas
infectadas con el virus en tres tubos de ensaye.
• Colocarlos en baño maría a una temperatura de 30,35,40, 45, 50, 55, 60, 65 y
70 grados centígrados durante 10 minutos respectivamente.
• Inmediatamente enfriarlos en agua con hielo e inocular con cada una de las
muestras dos hojas de la planta indicadora.
• Evaluar el número de lesiones locales una semana después de la inoculación.
Hojas de Chenopodium amaranthicolor inoculadas mecánicamente, con savia de planta enferma
sometida a diferentes temperaturas.
RESULTADOS: En el cuadro siguiente enumere las lesiones locales obtenidas para
cada tratamiento y compare los resultados con los de sus compañeros.
GRADOS CENTÍGRADOS No. DE LESIONES LOCALES
30
35
40
45
29

30. 50
55
60
65
70
LONGEVIDAD “IN VITRO”
Con este término se hace alusión a la savia extraída de las plantas enfermas con
virus que se mantiene bajo condiciones de laboratorio a temperatura de alrededor de
18 grados centígrados. Para la mayoría de los virus el envejecimiento “In vitro” es de
unas cuantas horas y esto parece estar relacionado con la oxidación de los juegos y
sus propiedades intrínsicas. Algunos investigadores han reportado que la savia del
virus mosaico del tabaco puede permanecer infectiva después de 50 años de
almacenamiento.
OBJETIVO: Familiarizarse con la prueba de longevidad in vitro la cual nos ayuda en
la caracterización de los virus.
MATERIALES: Pipetas, plantas enfermas con virus, vasos de precipitado de 50
mililitros, manta de cielo, cotonetes, carborundum, tubos de ensaye, gradilla para
tubos de ensaye.
METODOLOGÍA:
• Macere hojas con síntomas del virus problema y filtre el extracto en manta de
cielo.
30

31. • Deposite un mililitro de extracto de la savia infectiva en tubos de ensaye
chicos y séllelos con parafilm.
• Inocule la savia a las 24, 48 y 72 horas; posteriormente hágalo semanalmente
hasta no detectar infectividad de preferencia en una planta que reaccione con
síntomas locales y contabilice el número de lesiones locales.
RESULTADOS: Anótelos en su cuaderno de prácticas.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Fernández V., M.V. 1969. Introducción a la Fitopatología. Volúmen I: Virus. Colección
Científica INTA. Buenos Aires, República de Argentina. 1013 p.
Gibbs, A., and B. Harrison. 1975. Plan Virology. The principles. Edward Arnold, Camberra,
292 p.
31

32. RELACIÓN SEROLÓGICA DE LOS VIRUS (SEROLOGÍA)
La serología es un método de gran utilidad en la fitopatología ya que por medio
de esta prueba se pueden caracterizar y determinar las relaciones existentes
entre el agente causal y la enfermedad que ocasionan en el vegetal.
El valor de las relaciones antígeno-patógeno es debido a su alta
especificidad ya que el anticuerpo sólo se relaciona con un antígeno que
contenga una secuencia similar de aminoácidos (sitios antigénicos); además es
un método rápido y muy preciso para el diagnóstico de virus fitopatógenos, esta
técnica tiene actualmente gran relevancia en los programas de mejoramiento
genético y los de programación de plantas.
Aunque las técnicas de producción de antisueros se conocen desde hace
más de 50 años, últimamente han adquirido un valor muy importante de tal
manera que se han generado una gran cantidad de técnicas serológicas dentro
de las cuales podemos mencionar; la precipitación en tubo, aglutinación
serológica, anillo interfásico, doble difusión en agar y ELISA, entre otras.
DOBLE DIFUSIÓN EN AGAR
La técnica de doble difusión en agar es una de las más usadas comúnmente, ya
que además de ser confiable, prácticamente resulta un poco económica
(comparada con la de ELISA que es la más confiable). Lo esencial de esta
32

33. técnica es que ambos reactantes (antígeno y antisuero) se difunden uno hacia el
otro en el medio de agar, se forma una banda de precipitación en el sitio donde se
encuentran las óptimas concentraciones y su localización depende principalmente
de la capacidad de difusión de los reactantes y de su concentración.
La técnica de doble difusión en agar es muy útil para virus de forma
poliédrica y de varilla (principalmente rígida), también nos da la información para
encontrar relación entre variantes de virus, para saber que tan puro está el
antisuero y para la identificación de los virus.
OBJETIVO: Observar la prueba de doble difusión en agar con el virus
mosaico del tabaco.
MATERIALES: Virus mosaico del tabaco purificado, plantas con síntomas
aparentes del virus mosaico del tabaco, cajas de petri chicas, sacabocados, agar
purificado, asida de sodio al 0.5%, manta de cielo, mortero con su mazo, pipetas
estériles, charolas de plástico, agua destilada, olla de presión.
METODOLOGÍA
• Prepare 96 mililitros de agar purificado al 1% y esterilice a 15 libras de
presión durante un período de 15 minutos.
• Cuando la temperatura del recipiente baje a unos 60 grados centígrados
agregue 4 ml de ácido de sodio al 0.5% como preservador.
• Por medio de un sacabocados, perforar el medio de agar evitando rupturas
en los alrededores de los orificios.
33

34. • Por medio de una pipeta colocar una gota de agar en cada orificio, tratando
de que solamente cubra la superficie de la caja sin llenar el orificio.
• En las perforaciones distribuya el antisuero y la savia de la planta sana y la
planta que se va analizar.
• En la superficie de la charola de plástico poner papel húmedo y colocar las
cajas, la charola se debe cubrir o meter en una bolsa de plástico grande.
• Observar la caja durante un período de 12 a 72 horas.
Bandas mostrando la reacción serológica
RESULTADOS: Regístrelo en su cuaderno de prácticas.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Kado, I.C. and H.O. Agrawall. 1982. Principles and Techniques in plant virology. Van
Nostrands Reinhold’s Company. 466.472 pp.
Morhead, B.E, 1961. Serological test for the identification of plant viruses. The American
Phytopathological Society, Cornell, University. New York.
34

35. Slogeren, V.E. 1957. Serological identification of plant viruses and serological diagnosis of
plant virus diseases in plant. Ann. Rev. Of Phytopathological. 149-164 pp.
PRUEBA DE ELISA (ENZIME-LINKED INMUNOSORBENT ASSAY)
El nombre de esta técnica deriva del uso de conjugados para la detección de
antígenos. Mediante el proceso de conjugación es posible la unión usando
glutaraldehido o éster de biotina, de una enzima a una proteína (enizime-linked). En
el caso de serología, la proteína a conjugar es un anticuerpo específico a un
antígeno, mientras que las enzimas normalmente utilizadas para el marcaje o
conjugación de estos anticuerpos son la fosfatasa alcalina Y la peroxidasa. La
combinación anticuerpo-enzima (u otro marcador) recibe el nombre de conjugado
Otros marcadores utilizados además de las enzimas antes mencionadas son la
biotina, ciertas fluoresceínas, digoxigenina, productos radiactivos o algunos metales
como oro Y fierro. La presencia (revelado) de estos conjugados se detecta con el uso
de sustratos enzimáticos,. sustratos fluorogénicos (o iluminación ultravioleta),
contador de centelleos de radiación emitida o un electroimán si se utilizaron como
marcadores enzimas, fluoresceína, isótopos radioactivos y fierro, respectivamente.
En un inicio se utilizaban tubos de poliestireno, instancia con alta afinidad
hacia proteínas, para la realización de la prueba hasta que en 1974 se sustituyeron
estos tubos por micropl2- que actualmente son de uso general. Otro material que
posee alta afinidad hacia proteínas es el papel (membrana) de nitrocelulosa que se
emplea en la técnica dot-blot en la que también se usan conjugados ("anticonejos" en
este caso). "Los materiales en los que se fijan o adsorben anticuerpos, o proteínas
en general, reciben el nombre de inmunoadsorbentes. Fase insoluble o fase sólida.
Algunas -variantes de Las técnicas que emplean conjugados son Las siguientes:
35

36. Técnicas directas.- Primeramente se adsorbe el antígeno sobre la fase sólida y
posteriormente se añade el conjugado.
Técnicas indirectas.- Primeramente se adsorbe el antígeno sobre la fase sólida,
posteriormente se añade el anticuerpo especifico a este antígeno y finalmente se
agrega un conjugado especifico al anticuerpo añadido previamente, típicamente un
anticonejo (técnica clásica).
Doble sándwich de anticuerpos (DAS).- en este caso primeramente se añade el
anticuerpo a la fase sólida, después se agrega el antígeno y finalmente se coloca el
conjugado especifico a dicho antígeno (técnica clásica).
Doble sándwich de anticuerpos indirecto (DASI).- de manera similar al caso anterior,
primeramente se añade el anticuerpo a la fase sólida, a continuación de agrega el
antígeno.. Posteriormente se coloca nuevamente el anticuerpo y finalmente se añade
un conjugado especifico a este anticuerpo (anticonejo) (técnica clásica).
OBJETIVO: Que el alumno conozca Y aplique los principios de la técnica de DAS-
ELISA para el estudio de virus fitopatógenos.
METODOLOGÍA
Distribución de las muestras.- Se realiza la distribución de las muestras en un
esquema previamente realizado sobre una hoja de papel en la que se indica la
ubicación de los pozos de una placa típica de ELISA. Esta placa consiste de doce
columnas (numeradas de la 1 a la 12) y ocho hileras (de la 'A' a la 'H') cuya
combinación forma un conjunto de 96 cuadrados que corresponden a los pozos de la
placa. Sobre esta cuadrícula se hace la asignación de las muestras y se sugiere
colocar al menos dos repeticiones por cada una de ellas. Debe incluir además un
testigo positivo (tejido infectado por el virus a probar), testigo negativo (tejido de
planta sana) y un blanco (consistente típicamente en solución amortiguadora).
36

37. Colocación del anticuerpo de cobertura- En primer lugar debe calcularse el volumen
a utilizar de amortiguador en el que se va a diluir el anticuerpo (amortiguador de
cobertura), mismo que depende del número de pozos a cubrir. Generalmente se
añaden 100ml por pozo por lo que se multiplica el número de pozos a utilizar por
100. Posteriormente se calcula la cantidad de antisuero a diluir en ese volumen de
antisuero. Los antisueros empleados son los comúnmente distribuidos por AGDIA
Inc. La cual recomienda una dilución de 1:200. En diferentes análisis se ha
observado que una dilución 1:500 da resultados similares, por lo que en esta práctica
se utilizará esta última dilución. Para ello se divide el volumen de amortiguador
previamente calculado entre 500 y el resultado será la cantidad de anticuerpo a diluir
en amortiguador. El anticuerpo debe tomarse con micropipeta utilizando una punta
estéril y, de preferencia, en cámara de cultivo, o bien, cerca de una flama para evitar
su contaminación. Una vez diluido el anticuerpo en el amortiguador se agregan 100ul
por pozo. La placa con anticuerpo (sensibilizada) se mantiene en cámara húmeda
durante 4 h a temperatura ambiente.
Preparación de las muestras.- Se toman 2 gr de tejido de cada una de las muestras a
evaluar Y se introducen en una bolsa de polietileno gruesa. Se añade amortiguador
de extracción en una relación 1:1 (plv) y se macera perfectamente con un pistilo. El
líquido sobrenadante del macerado debe diluirse en solución amortiguadora de
extracción para obtener una dilución final de 1: 1 0 (pív). Para ello, se toman 200 g
del sobre nadante del macerado y se agregan a otra bolsa de polietileno que
contiene 800 DI de solución amortiguadora de extracción. Las muestras así diluidas
deben mantenerse en refrigeración para evitar la oxidación excesiva del tejido. En
este caso por lo general se utiliza un recipiente con hielo picado sobre del cual se
colocan las bolsas con las muestras diluidas hasta el momento de su utilización.
Colocación de las muestras.- Una vez transcurridas las 4 h de incubación. La placa
sensibilizada se saca de la cámara húmeda v se lava perfectamente con solución
amortiguadora PBST (PBS-Tween). Por lo común la placa se lava tres veces.
37

38. Después del lavado se colocan 100 ul/pozo de cada una de las muestras diluidas
según la disposición asignada en un inicio. La placa con las muestras se mantiene en
cámara húmeda durante 24 h a 4"C.
Preparación del conjugado.- El conjugado consiste en anticuerpo más un marcador,
enzima en este caso (fosfatasa alcalina). El volumen de conjugado a utilizar es el
mismo al calculado para el antisuero de cobertura. Asimismo, el volumen de
amortiguador en el que se va a diluir este conjugado (amortiguador de conjugado) es
el mismo que el calculado para el anticuerpo de cobertura De manera similar que en
el caso del anticuerpo, el volumen de conjugado debe tomarse con una micropipeta
con punta estéril en una cámara de aislamiento o cerca de alguna flim2 para evitar su
contaminación.
Colocación del conjugado.- Después de las 24 h de incubación a 4 oC, se saca la
placa de la cámara húmeda y se lava tres veces con solución amortiguadora PBSt.
Se colocan 100ul por pozo del conjugado preparado anteriormente de acuerdo con el
esquema realizado al inicio. La placa con el conjugado se mantiene en cámara
húmeda durante 2 h a temperatura ambiente.
Preparación del sustrato.- El sustrato utilizado para la fosfatasa alcalina es el p-
nitrofenil fosfato de sodio (PNP) el cual se adquiere, en la mayoría de los casos, en
pastillas de 5 MG Este sustrato debe diluirse en un amortiguador específico
que es fotodegradable por lo que su preparación debe mantenerse en un recipiente
ámbar y de preferencia cubierto con algún material, papel aluminio por ejemplo, que
evite al máximo su exposición a la luz. Se añade una pastilla de PNP por 10 mi de
amortiguador de sustrato. El sustrato debe prepararse el día de su utilización,
preferentemente treinta minutos antes de cumplirse el tiempo de incubación de la
placa con el conjugado.
Adición del sustrato.- Después de las 2 h de incubación, se saca la placa con el
conjugado de la cámara húmeda y se lava tres veces con solución amortiguadora
38

39. PBSt. A continuación se agregan 1OOul/pozo de la solución de sustrato y se
mantiene la placa a temperatura ambiente durante 30 min en un recipiente opaco o
en un sitio totalmente oscuro para que se lleve a cabo la reacción enzima-sustrato.
RESULTADOS.- Una reacción positiva, en la que ocurrió la unión enzima-sustrato.
se presenta de color amarillo, el cual puede variar de intensidad en los diferentes
pozos. Esta observación puede, hacerse a simple vista o, si se desea una evaluación
más precisa. Mediante el uso del colorímetro a una longitud de onda de 405 nm. En
este último caso, una reacción se considerará positiva en el pozo cuya lectura del
colorímetro sea mayor de tres veces a la lectura del pozo del testigo negativo
Placa para la prueba de ELISA
BLIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Bar-Joseph, M., and Garnsey, S.M. 1981. Enzime-Linked inmunosorbent assay (ELISA):
principles and applications for diagnosis of plant viruses. Pág. 35-59 en: Plant diseases and
vectors: ecology and epidemiology. Maramorosch, K. And Harris, K.F. (eds). Academy press,
New York 368p.
Clark, M.F. 1981. Inmunosorbent assay in plant pathology. Annu. Rev. Phytopathology
19:83-106.
Lommel, S.A., McCain, A.H., and Morris, T.J. 1982. Evaluation of indirect enzyme-linked
inmunosorbent assay for the detection of plant viruses. Phytopathology 72:1018-1022.
Sutula, C.L., Gillet, J.M., Morrisey, S.M., and Ramsdell, D.G. 1986. Interpreting ELISA data
and establising the positive-negative threshold. Plant Disease 70:722-726.
39

40. INCLUSIONES VIRALES
Uno de los cambios más específicos inducidos por los virus a las células de las
plantas atacadas en la producción de cuerpos microscópicos que difieren de las otras
estructuras celulares. Estos cuerpos varían en morfología y composición y están
localizados en el citoplasma o en los núcleos. Para virus de plantas y animales las
inclusiones virales pueden servir como un diagnóstico de evaluación.
Las inclusiones intracelulares fueron reportadas por primera vez por Ivanowski
(1903) en plantas de tabaco infectadas con el Virus Mosaico del Tabaco (VMT); este
investigador descubrió dos clases de inclusiones, una amorfa y la otra cristalina.
Posteriormente, la inducción de estas estructuras por otros virus fueron también
descritas. Su composición, formación y significancia. No fueron conocidas y fueron
mal interpretadas como organismos vivientes o estados de desarrollo de algunos
microorganismos tales como protozoarios.
Las inclusiones se forman en las células de las plantas como resultado de las
infecciones producidas por los virus, están formadas por partículas de virus o por
sustancias producidas por los virus como las proteínas o por organelos celulares
normales y los degenerados y por una combinación de todo lo anterior, su
distribución es abundante en la epidermis de las hojas, pero también en tallos,
raíces, flores y frutos y no solo las podemos encontrar en células epidermales sino
de igual manera en el xilema y floema. Cada virus puede dar lugar a inclusiones de
formas muy características; por tal razón, estas partículas se usan como una
herramienta útil en el diagnóstico de las enfermedades virales, para determinar si
40

41. una infección viral es provocada por más de un virus, ayudan cuando la
sintomatología en el campo es muy incierta y en otros casos a identificar un virus
hasta nivel de grupo.
Las inclusiones virales tienen formas muy características que nos ayudan a
conformar dos grupos:
a.- AMORFAS: Granulosas, Fibrosas, Vacuoladas, Bandeadas, Laminadas, Cuerpos
densos, Irregulares, etc.
b)- CRISTALINAS: Hexagonales, Piramidales, Rectangulares, Isométricas,
Paracristalinas, etc.
Si las encontramos en el citoplasma se les denomina citoplasmáticas, si están
en el núcleo, nucleares y si se localizan en el nucleolo, nucleolares.
Una característica importante de las inclusiones virales es que su morfología
es específica para cada tipo de virus y es muy constante sobre un rango de
hospedantes lo cual es de gran valor al hacer un diagnóstico.
OBJETIVO: Observar mediante tinción de células de plantas infectadas con virus las
inclusiones intracelulares.
MATERIALES: Hojas de tabaco enfermas con el virus mosaico del tabaco, hojas de
tabaco sanas, vidrios de reloj, pinzas, hojas de rasurar, formalina al 8%, rosa de
bengala, azul de metileno al 5%, tritón X-100 al 5%, azul de bromofenol, rodamina,
verde de metilo, portaobjetos, cubreobjetos y microscopio compuesto.
METODOLOGÍA:
• Desprenda tiras de la epidermis por el envés de las hojas infectadas y sanas.
41

42. • Colocarlas en un porta objetos contenga unas gotas de colorante azul de
bromofenol mercurio o rodamina-verde metilo, por un período de cinco
minutos.
• Lavar el primer colorante con agua de la llave y el segundo con agua
destilada.
• Agregue una gota de glicerina y coloque el cubreobjetos.
• Observe al microscopio compuesto con el objetivo de 100X.
INCLUSIONES VIRALES
Inclusiones cristalinas:hexagonal y estriada del VMT Inclusión granulosa del VMMT y vacuolada del VMS
TOMADAS DE: CARDENAS-SORIANO, 1999.
RESULTADOS: Observe la forma de inclusión, realice dibujos de células sanas y
células enfermas y determine de que virus se trata.
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
Cárdenas S.E. 1986. Diagnóstico de virus mediante inclusiones virales. C.P., Montecillo,
México. 71 p.
Cárdenas S.E. 1999. Diagnóstico de virus mediante inclusiones virales, microscopía
electrónica y rango de hospedantes. C.P., Montecillo, México. 147 p.
Christie, R.G. 1967. Rapid staining procedures for differentiating plant virus inclusions in
epidermal strips. Virology 31; 268-271 p.
Christie, R.G. and J.R. Edwardson. 1977. Light and Electron Microscopy of plant virus
inclusions. Univ. of Florida, Florida Agric. Exp. Station. Monograph Series No. 9.
42

43. Pinto C.B., 1981. Virología Agrícola. Universidad Autónoma Chapingo, Chapingo, México.
175 p.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
El microscopio electrónico fue creado en 1930, sin embargo hasta los 40’s, empieza
ha ser utilizado en los diversos campos de la ciencia. En fitopatología especialmente
en virología, es un elemento necesario que nos permite obtener información
referente a la forma y tamaño de las partículas virales, para poder así llevar a cabo el
diagnostico e identificación de estos fitopatógenos.
OBJETIVO: Conocer la técnica de tinción negativa, empleada en microscopía
electrónica para observar partículas virales a partir de savia infectada.
MATERIALES: Vaso de Coplin, Solución formvar, porta objetos, Vaso de precipitado,
papel filtro, caja petri, rejillas de cobre, ácido fosfotungstico o fosfotungstato de
potasio.
METODOLOGÍA
Preparación de membranas formvar y tinción negativa.
• En un vaso de Coplin conteniendo la solución formvar (0.25% en
dicloroetano), introduzca un porta objetos, sáquelo lentamente y quite el
exceso de solución en un papel filtro.
• Introdúzcalo en un vaso de precipitado con agua, para que se desprenda la
membrana.
• En la membrana, coloque una rejilla cuidando que el contacto sea por la parte
opaca de la rejilla.
• Con la ayuda de papel filtro, saque la membrana conteniendo la rejilla,
deposítela en una caja petri.
• Seque a temperatura ambiente o en una estufa.
43

44. • En un porta objetos, ponga unas gotas del contrastante (ácido fosfotungstico o
fosfotungstato de potasio) a concentración de 2.5% y agregue unas gotas de
la savia.
• Introduzca las rejillas conteniendo la membrana, sáquelas y colóquelas en una
caja petri, con la membrana hacia arriba.
• Espere durante 20 min y obsérvelas al microscopio.
PARTICULAS VIRALES
Varilla rígida VMT Varilla flexible VXP Poliédricas PLRV y VMMT
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
Cárdenas S.E. 1999. Diagnóstico de virus mediante inclusiones virales, microscopía
electrónica y rango de hospedantes. C.P., Montecillo, México. 147 p.
Juniper, B.E., Gilchrist, A.U., Cox, G.C. and Williams, P.R. 1970. Techniques for plant
electron microscopy. Blackwell Scientific Publications.
Milne, R.G. 1993. Electron microscopy of in vitro preparations. In: Diagnosis of plant virus
disease. Matthews, R.E.F. ed. CRC Press, Boca Ratón FL. pp. 215-250.
44

45. PURIFICACIÓN DE VIRUS
Los problemas involucrados en la separación de un virus de los constituyentes
celulares de las plantas son numerosos y solamente pueden ser aclarados
parcialmente. Únicamente un pequeño porcentaje de un gran número de virus
conocidos transmitidos por savia han sido purificados. La purificación de un virus
implica el aislamiento en forma pura de dicho patógeno y son varios los puntos
importantes a considerar en dicha purificación; primero, es importante que los virus
estén presentes a suficientes concentraciones en la planta prueba.
Markham (1959) considera que la cantidad mínima necesaria de virus para
realizar este método es del orden de 5 a 10 miligramos de virus seco por kilogramo
de material fresco, por consiguiente la purificación con estas grandes cantidades es
deseable. Otro punto importante es la planta usada como fuente de virus.
Algunas plantas no son capaces de usarse como fuente de virus; por ejemplo,
aquellas que contienen grandes cantidades de látex, gomas o materiales
alquitrantes. Ciertas plantas como Tetragonia expansa, la cual contiene inhibidores y
no debe usarse, tampoco la fresa puede usarse por contener grandes cantidades de
taninos.
El proceso de purificación de virus de plantas incluye tres pasos importantes:
a) extracción de la savia; b) clasificación de la savia y c) aislamiento del virus.
OBJETIVO: Conocer la técnica de purificación del virus X de la papa.
MATERIALES: Plantas de Nicotiana glutinosa con síntomas del virus X de la papa
(PVX), centrífuga, solución buffer 0.2 molar y PH 8.0, ultracentrífuga, gradientes de
densidad (10,20,30 y 40%), cloroformo, mercaptoetanol, licuadora, manta de cielo,
agua destilada, balanza triple, potenciómetro, polietilenglicol, agitador magnético y
refrigerador.
45

46. METODOLOGÍA:
• Agregar en una licuadora 300 gramos del tejido enfermo diluidos en 360
mililitros de solución extractora, posteriormente,
• Pase la savia licuada a través de una manta de cielo.
• Centrifugar a 10,000 rpm durante 10 minutos; desechar el precipitado.
• Agregar al sobrenadante (parte con la que se quedó) una cuarta parte de
cloroformo.
• Centrifugar a 10,000 rpm durante 20 minutos y desechar el precipitado
donde irá incluido el cloroformo.
• Agregar al sobrenadante polietilenglicol (PEG) 8000 al 12% (p/v) y cloruro
de sodio (NaCl) al 10% (350 ml de savia - 35 ml de cada uno de los
componentes), dejar en reposo durante 24h a 4oC.
• Centrifugar durante 20 minutos a 10,000 rpm
• Deseche el sobrenadante y suspender el precipitado con solución
amortiguadora, centrifugar a 10,000 rpm durante 20 minutos.
• Deseche el sobrenadante.
• Suspender el precipitado en solución amortiguadora y centrifugar en la
ultracentrifuga a 28,000 rpm durante dos horas.
• Desechar el sobrenadante, el precipitado volverse a suspender con
amortiguador y centrifugar a 12,000 rpm durante 20 minutos.
• Desechar el precipitado.
• Pasar el sobrenadante a gradientes de sacarosa al 10,20,30 y 40%.
• En un tubo de ensaye añada 7 ml de sacarosa al 40% con una pipeta.
• En el mismo tubo añada 6 ml de solución de sacarosa al 30, 20 y 10%.
• Coloque cuidadosamente el sobrenadante, en la superficie del gradiente de
sacarosa.
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47. • Centrifugar a 24 rpm durante 90 min. a 12oC, posteriormente observará
una banda opalescente que corresponde al virus.
• Obtenga esa banda con la ayuda de una jeringa y observese en el
espectrofotómetro.
Clarificación de la savia Gradientes de sacarosa para la observación final
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Brakke, M.K. 1967. Density-gradient centrifugation. Miscellaneous problems in virus
purification. In: Methods in Virology Vol.II. Maramorosch, K. and. Koprowski, H. eds.
Academic Press, London, p. 93-136.
Francki, R.I.B. 1972. Purification of viruses. In: Principles and techniques in plant virology.
Kado, C.I. and Agravwal, H.O. eds. Van Nostrand Reinhold, Princenton pp. 293-335.
Rodríguez G., S. 1983. El virus X de la papa en tomate de cáscara. Physalis ixocarpa Broth.
Tesis de Mestría en Ciencias, C.P. Chapingo, México. 73 p
Walkey, D.G.A. 1985. Applied plant virology. Chapman and Hall. London p.203.
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48. CONTROL DE VIRUS MEDIANTE EL USO DE ACEITES
Salvo en muy raras ocasiones una vez introducidos los virus en los tejidos de las
plantas, sólo se pueden eliminar por la destrucción de estas fuentes de inóculo. De
esta condición se deriva la gran importancia de las enfermedades causadas por
estos fitopatógenos.
El hombre ha desarrollado métodos para limitar la acción destructiva de estos
patógenos, ya sea mediante el control de insectos vectores mediante distintos
métodos dentro de los cuales sobresalen: las barreras biológicas, el uso de plásticos
como repelentes, uso de tiras de aluminio patógeno en la planta hospedante (sobre
todo para virus no persistentes) y como última alternativa el uso de insecticidas para
controlar virus no persistentes.
Dentro de los aceites más comunes usados para el combate de virus se
encuentran los derivados del petróleo y principalmente la citrolina, la cual ha dado
resultados positivos en algunas regiones agrícolas del país.
El uso de aceites para el control de virus no persistentes en Sinaloa data
desde 1975 cuando se encontró que este tipo de compuestos eran muy importantes
para bajar la incidencia de virus mosaico de la sandía en el Valle de Culiacán,
Sinaloa (Urías, comunicación personal).
OBJETIVO: Observar el efecto de los aceites como agentes que actúan interfiriendo
el proceso de transmisión de los virus no persistentes.
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49. MATERIALES: Plantas de calabaza Zuchinii gray con síntomas del virus mosaico de
la sandía, aceite de cártamo, plantas sanas de calabaza, atomizador, áfidos de la
especie Myzus persicae.
METODOLOGÍA:
• Coloque 10 áfidos no viruliferos en plantas de calabaza con síntomas del virus
mosaico de la sandía durante 24 horas.
• Prepare una emulsión de aceite al 1.0% y agregue emulsificante hasta que la
emulsión sea completa.
• Asperje 5 plantas de calabaza sanas con la emulsión y deje dos como
testigos.
• Coloque dos áfidos viruliferos sobre cada una de las plantas asperjadas y
testigos y déjelos por un lapso de 30 minutos.
• Elimine los insectos.
RESULTADOS: Elabore un cuadro con los resultados obtenidos.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Fernández, V., M.V. 1969. Introducción a la Fitopatología. Colección Científica INTA.
Volúmen I: Virus. Buenos Aires, República de Argentina. 1013 p.
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