1. A multiplicação dos fragmentos de DNA
Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA, com o uso
das enzimas de restrição, e o seu reconhecimento pela técnica
de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar (clonar) o
fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA
recombinante. A técnica de multiplicação da fita de DNA é
chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase).
Na década de 1980, passou-se a utilizar a técnica do PCR para
fazer milhares de cópias de um único pedaço de DNA. Essa
técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais
alguns compostos necessários, como primers (DNAs
iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a
replicação do DNA).
Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T,
C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade
ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar. Quando
uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a
dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas
complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a
duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers
diferentes (veja a figura)

2. Técnica de PCR, passo a passo
Obtém-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana.
1. A amostra de
DNA, a
enzima que
faz a
replicação
(DNA
polimerase),
os
nucleotídeos
de DNA e os
primers
complementa
res a
sequência de
DNA são
colocados em

3. um tubo de
ensaio.
2. Coloca-se o
tubo de
ensaio em
uma máquina
de PCR
(máquina que
aumenta e
diminui a
temperatura
de acordo
com um
programa).
Os passos
seguintes, de
aquecimento
e
resfriamento,
acontecem
dentro da
máquina
controlados
pelo
programa.
3. Aquece-se o
tubo a 94ºC
para
desnaturar
(separar a
dupla fita) o
DNA.
4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de
molde para a síntese de novas cadeias
complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os
primers se anelam ao início das duas fitas simples,
servindo de iniciadores para a enzima polimerase.

4. 5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal
de funcionamento da DNA polimerase) para a
duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do
primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA
ligando-os por complementaridade, formando assim uma
nova fita dupla.
Separando fragmentos de DNA: eletroforese em gel

5. Como vimos no item anterior, os fragmentos de DNA formados
com a ação das enzimas de restrição possuem tamanhos
diferentes. A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais
utilizada é a eletroforese através de géis de agarose.
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que
dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria como a
gelatina. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é
preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e
então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como
oDNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo
positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA
deve migrar através do gel de agarose.
Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um
gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA
maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA
lineares através da agarose é inversamente proporcional a
log10 de seus pesos moleculares.
É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com
base na sua razão de migração. Após a eletroforese em gel, os
fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de
etídeo, que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se
visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta. Dessa
forma pode-se localizar as bandas que correspondem ao DNA.
Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados
a partir dos géis de agarose.

6. E agora? O que se faz com esses fragmentos de DNA?
Olhe a técnica do DNA recombinante
A tecnologia do DNA recombinante
Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do
material genético, contém um ou mais genes. Lembre-se
que cada gene origina uma proteína, portanto ao estudarmos o
gene estamos estudando a proteína que ele codifica.
Mas o que devemos fazer para estudar o gene?
Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um
hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em mRNA, e
a tradução em proteína.

7. O hospedeiro é um organismo que se multiplica (se reproduz)
rapidamente, como por exemplo, as bactérias. Quando as
bactérias se reproduzem por bipartição elas transmitem ao seus
“filhos” o seu material genético, portanto se neste material
conter o fragmento de DNA de estudo, em pouco tempo teremos
milhões de bactérias com o gene.
O plasmídio é o material genético circular não ligado ao
cromossomo que fica espalhado pelo hialoplasma das bactérias.
Ele sofre o mesmo processo do DNA cromossomal de
transcrição e tradução, além de, se multiplicar a cada divisão
celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.
O plasmídio é retirado das células bacterianas para que se
possa inserir o gene de estudo, para depois recolocá-lo na
bactéria.

8. Para entendermos melhor vamos conhecer esse processo passo
a passo (acompanhe na figura):
1. Os pesquisadores querem estudar um gene humano que
produz uma proteína que não se sabe a função.
2. Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de
restrição), do DNA humano, o gene de interesse.
3. Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado
por PCR para obtermos várias cópias do mesmo fragmento
(ou da mesma informação).
4. A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é
utilizada para clivar o plasmídio bacteriano. Lembre-se que
o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas
que são complementares ao plasmídio se este for clivado
com a mesma enzima.
5. A seguir o plasmídio clivado é misturado com os
fragmentos de DNA (contendo o gene) e uma enzima
chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio,

9. produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o
DNA recombinante é introduzido em uma bactéria
hospedeira.
6. A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo
seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA
recombinante crescem, formando colônias. Após muitas
gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes,
as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são
separadas das proteínas das bactérias).
Esse método produz uma grande quantidade de proteínas
humanas possibilitando assim, seu estudo.