الكامل في أقوال الصحابة والأئمة في آية ( ماء دافق يخرج من بين الصلب والترائب ...
صبغ والكشف المجهري للبكتيريا
1. صبغ والكشف المجهري للبكتيريا
Microscopy and Staining
01
دكتور يوسف الشريك
2. فحص الشرائح تحت المجهر •
• الهدف من فحص الشرائح تحت المجهر: -
• للكشف عن الميكروبات التي ال تري بالعين المجردة لضآلة حجمها:
1. تعتبر خلية البكتيريا من نوع وحيدة الخلية prokaryoticبحيث أنها أصغر
من نوع متعددة الخاليا .Eukaryotic
2. للكشف عن الخاليا البكتيرية تحت المجهر الضوئي بالطرق التالية.-
• طريقة Wet mount
• صبغ اللطخة البكتيرية، وتعتبر هذه الطريقة أكثر استعماال، للكشف عن
البكتيرية تحت المجهر، ومن عيوبها يمكن أنها تبين البكتيريا الحية
والميتة، ومن أهم مميزاتها يمكن التفريق بها بين أشكال البكتيريا
عصوية أو كروية وتنظيماتها (شكل )وغيرها، ويمكن بهذه الطريقة
التفريق بين البكتيريا الموجبة، أو السالبة لصبغة الجرام
3. للكشف على خاليا البكتيرية تحت المجهر يستعمل عدسة مكبرة مع زيت
خاص بالكشف .Oil immersion
3. النواة غير الحقيقية
• pro·kar·y·ote
• [proh-kar-ee-oht, -ee-uh t] Show IPA
• nounany cellular organism that has no nuclea
r membrane, no organelles inthe cytoplasm e
xcept ribosomes, and has its genetic material
in theform of single continuous strands formi
ng coils or loops, characteristicof all organism
s in the kingdom Monera, as the bacteria and
blue-green algae.
4. النواة الحقيقية
• Eukaryote
• An organism whose cells contain a nucleus surrounded by me
mbrane and whose DNA is bound together by proteins (histo
nes)into chromosomes
• The cells of eukaryotes also contain anendoplasmic reticulum a
nd numerous specialized organelles not
present in prokaryotes, especially mitochondria, Golgi bodies,
and lysosomes.
• The organelles are enclosed in a threepart membrane(called a
unit membrane) consisting of a lipid layer sandwichedbetween
two protein layers.
• All organisms except for bacteria andarchaea are eukaryotes. C
ompare prokaryote.
5. هناك طريقتان لتجهيز الكشف عن البكتيرية الحية وهما:- •
طريقة الرطبة أو المبتلة .Wet mount 1.
طريقة النقطة المعلقة Hanging drop 2.
• طريقة الرطبة أو المبتلة Wet mountتطبق هذه الطريقة لدراسة شكل وترتيب
الخاليا البكتيرية، واختبار قدرة البكتيريا على الحركة، ومن ها الطرق التالية:-
1. ينقع التبن في 006 مل من الماء، لمدة أسبوع قبل إجراء التجربة، مع التخلص من
الفقاقيع الهوائية.
2. يعمل إطار مربع في منتصف الشريحة النظيفة، من الهالم النفطي ، بحيث تكون
أبعاده، نفس أبعاد الشريحة الزجاجية الرقيقة.
3. توضع قطرة واحدة، من محلول نقع التبن، في منتصف الشريحة الزجاجية الرقيقة.
6. تقلب الشريحة الزجاجية، التي تحتوي على اإلطار ، ويلصق 4.
األخير بغطاء الشريحة الزجاجية الرقيق، المحتوية على قطرة
ماء التبن بحذر.
تقلب الشريحة بحيث يصبح غطاء الشريحة الزجاجية إلى 5.
أعلى.
توضع الشريحة تحت المجهر، لدراستها، مع تقليل كمية 6.
الضوء الساقط ،على العدسة العينية.
تحديد األحياء الدقيقة، في العينة بعدسة قوتها (01 ، ) Xثم 7.
بعدسة قوتها (04 ، ) Xمع تعديل قوة اإلضاءة، عند كل
تغيير العدسة .
يالحظ وجود أنواع مختلفة، من األحياء الدقيقة، في عينة 8.
التبن، مثل: وجود بكتيريا عصوية، أو كروية وغيرها، كما هو
موضح في جدول (2 ) و ( 3 ) وشكل (34 ).
7.
8.
9.
10. • طريقة النقطة المعلقة الختبار قدرة البكتيريا على الحركة
• هدف ومبادئ هذه الطريقة مثل الطريقة الرطبة، ومن أهم
مميزاتها التالية:-
1. مراقبة حركة البكتيريا في نقطة معلقة داخل تجويف
زجاجي مغلق
2. نادراً ما يحدث جفاف للشريحة.
3. بقاء الخاليا في حالة نشطة لمدة أطول من الطريقة
الرطبة.
طريقة العمل
1. تنظف الشريحة ذات التجويف تنظيفا ً جيداً
Depression Slideمع غطائها بالماء الساخن
والصابون إلزالة المواد الدهنية العالقة بها.
11. 2. توضع أربعة نقط من الماء أو الفازلين أو الهالم النفطي
على كل زاوية من غطاء الشريحة بواسطة ناقل البيئة.
3. توضع قطرة من البيئة البكترية في وسط غطاء الشريحة
الزجاجية الرقيقة.
12. 4. توضع الشريحة على غطاء الشريحة الزجاجية الرقيقة ،
بحيث يكون التجويف مقابال للقطرة في وسط التجويف،
بحيث يكون الغطاء ملتصقا مع الشريحة.
5. تقلب الشريحة بسرعة مع الحفاظ على وجود نقطة البيئة
البكتيرية في منتصف التجويف.
13. 6. تفحص النقطة المعلقة تحت المجهر، مستعمال العدسة
الصغيرة القوة ، ثم يخفض المكثف قليال، ويقفل الحجاب
جزئيا ً لتقليل اإلضاءة للتمكن من رؤية العينة بوضوح.
7. تعدل حافة الشريحة لوضع حافة النقطة في وسط مجال
المجهري.
14. 8. تغير العدسة الصغيرة إلى كبيرة القوة، ثم إلى الزيتية، بعد
وضع نقطة زيت السيدر، على غطاء الشريحة.
9. تفحص حافة العينة، مع تحريك الضابط الدقيق ببطء، مع
تعديل اإلضاءة، بواسطة المكثف، حتى ترى البكتيريا
بشكل واضح.
01.الحظ حركة البكتيريا، عند حافة النقطة المعلقة.
11.تدون المالحظات برسم شكل البكتيرية، وطريقة تجميع
الخاليا البكتيرية ونوعية حركتها.
15. طريقة صبغ البسيطة Simple Stain
• طريقة تحضير اللطخة البكتيرية
• الهدف من تحضير اللطخة:-
1. هو تحضير غشاء رقيق متجانس من البكتيريا النامية على
شريحة زجاجية، ثم إضافة صباغات معينة لصبغها والكشف
عليها تحت المجهر.
2. ومن المعروف بأن البكتيريا عديمة اللون، ولتحديد نوعية
خالياها، يجب إجراء عملية صبغها بأحد الطريقة التالية:-
3. تحضير اللطخة البكتيرية.
4. إضافة بعض األصباغ إلى اللطخة لتحديد نوعيتها من ناحية
سالبة أو موجبة لصبغة الجرام.
16. طريقة تحضير اللطخة البكتيرية
تنظف الشريحة الزجاجية جيدا ، بالماء والصابون، 1.
وتجفف.
تمسك الشريحة من إحدى طرفيها؛ وترسم دائرة قطرها 2.
5.1 سم، على الوجه األسفل من الشريحة.
توضع قطرة من الماء على وجه الشريحة المرسوم 3.
عليها الدائرة بداخلها، لغرض عمل لطخه بكتيرية.
تعقم عقدة الحلقية( اللوبي) ، في نهاية اإلبرة الناقلة 4.
،على لهب موقد بنزن،حتى درجة االحمرار،وتبرد لمدة
01 ثواني.
تؤخذ كشطة من البيئة البكتيرية، بعقدة اإلبرة المعقمة. 5.
خلط الكشطة بالماء، داخل الدائرة على سطح. 6.
17. 7. بعد ذلك عقم العقدة المعدنية، مرة أخرى.
8. تعمل لطخه بكتيرية من البيئة السائلة، على شريحة
أخرى، بحيث يكون حجمها العقدة المعدنية مرتين إلى
ثالثة مرات( وفي كل مرة يجب تعقيم العقدة وسلكها)،
وتنقل إلى داخل الدائرة، مع توزيعها فيها توزيعا جيدا.
9. تعقم الحلقة مرة أخرى.
01.تترك اللطخة لتجف، عند درجة حرارة الغرفة، دون نفخ
أو إمرار الهواء عليها.
18. 11.تثبت اللطخة بإمرار الشريحة على اللهب مرتين أو ثالثة
مرات.
شكل (44) طريقة تحضير اللطخة البكتيرية على شريحة زجاجية من بيئة سائلة وبيئة صلبة
19. • صبغ اللطخة البكتيرية:
• تعتبر الصباغات Dyesالتي تصبغ البكتيريا مواد كيميائية،
أما أن تكون حامضية مثل :-
1. Fuchsin Acidو Eosinالتي تتفاعل مع المكونات
القاعدية في الخلية مثل:- سيتوبالزم،
2. أو قاعدية مثل سفرانين أو البلورات البنفسجية Crystal
violetالتي تتفاعل مع مكونات الخلية الحامضية.
• يتم تحضير اللطخة كما هو موضح في الشكل(44 )
20. 1. وضع الشريحة على حامل الصبغ (شكل 54)، أو تمسك بملقاط معدني.
شكل(54) كيفية إضافة الصبغة إلى اللطخة البكتيرية
2. تغمر اللطخة بأزرق المثيلين، لمدة 03 – 06 ثانية
3. تغسل الشريحة بالماء المقطر، بعناية إلزالة الصبغة الزائدة،
بواسطة أنبوب قنينة الماء المقطر.
4. تجفف اللطخة برفق، بورق ماص للرطوبة، وتترك لتجف.
21. فحص اللطخة تحت المجهر •
تفحص اللطخة المصبوغة، •
تحت المجهر بواسطة عدسة
قوتها 01 ، Xوبعدها تفحص
بالعدسة الزيتية التي قوتها
001.X
عند الفحص بالعدسة الشيئية •
(الزيتية)؛ يوضع الزيت
مباشرة على اللطخة، دون
غطاء زجاجي رقيق.
تسجل المالحظات مع الرسم أو •
التصوير، لكل ما يشاهد تحت
المجهر( شكل 64).
22. • تجفف الزيت من العدسة الشيئية، بأوراق خاصة بذلك.
• يرجع المجهر داخل صندوقه، أو المكان المناسب له.
• تنظف الشرائح جيدا، ويتخلص الموجود الزيت من عليها،
وتحفظ في الصندوق المخصص لحفظها .
23. • صبغ البكتريا بصبغة جرام
• اكتشف هذه الطريقة هانس جرام في 4881، عندما الحظ أن
البكتيريا تفقد لون الصبغة، عند التخلص من الزائد منها. وتستعمل
هذه الطريقة في تشخيص وتصنيف البكتيريا، وتقسيمها إلى
مجموعتين، سالبة ، وموجبة لصبغة الجرام. ويرجع الفرق بين
الصفتين الموجبة والسالبة، لمكونات الجدار الخلوي البكتيري.
• وتعتمد هذه الطريقة على أربعة خطوات هي:-
استخدام الصبغة الرئيسية ( ،)Crystal violetلصبغ جميع البكتيريا 1.
باللون البنفسجي.
يستخدم األيودين ،Iodineلزيادة الروابط األيونية بين الصبغة الرئيسية 2.
والبكتيريا.
يستخدم الكحول األثيلي، أو األسيتون كمادة مزيلة للصبغة من بعض 3.
البكتيريا، بينما تحتفظ البعض منها بلونها.
تستخدم مادة السفرانين ،Safraninفي صبغ البكتيريا التي فقدت صبغتها 4.
بالكحول أو األسيتون، باللون األحمر.
24. • تسمممى البكتيريمما التممي فقممدت لممون الصممبغة الرئيسممية بكتيريمما
سمممالبة لصمممبغة الجمممرام، أمممما التمممي احتفظمممت بلمممون الصمممبغة
الرئيسية تعرف باسم بكتيريا الموجبة لصبغة الجرام.
• نظرية آلية صبغة الجرام :
تعتمد هذه النظرية على النقاط التالية:- •
1. تختلف البكتيريا لتقبلها الصبغة الرئيسية والصبغة
الثانوية.
2. جدار الخلية الموجبة لصبغة الجرام؛ أكثر سمكا
من جدار خلية البكتيريا السالبة لصبغة الجرام ،
من حيث التركيب الكيميائي.
25. • يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام ،على طبقة
ً
سميكة من بيبتدوجلوكان ، أكثر سماكة من جدار البكتيريا
السالبة لصبغة الجرام أنظر الشكل (74).
26. • وبناء على النظرية، يمكن تفسير آلية الصبغة السالبة أو
الموجبة لصبغة الجرام كالتالي:-
• يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام، على طبقة
سميكة من بيبتيدوجلوكان ( متعدد السكريات مرتبطة مع
البيبتيدات)، التي يسبب لها الكحول إزالة وانكماش جدارها،
بحيث يخفض من معدل فقد الصبغة الرئيسية، ومن ثم تصبغ
باللون األساسي البنفسجي.
• يحتوي الغشاء الخارجي، لجدار بكتيريا السالبة لصبغة الجرام،
على طبقات محتوية على البروتين، ومتعدد السكريات ودهون
مرتبطة بعديد السكريات، وطبقة غير سميكة من
بيبتيدوجلوكان، محاطة بغشاء خارجي، ومن تم يقوم الكحول
بإزالة، أو إذابة الدهون، مما يزيد من فقد الصبغة األساسية ،
ويتلون جدارها بلون الصبغة الثانوية (األحمر).
27. • طريقة العمل
• يجب تحضير اللطخة البكتيرية من بيئة حديثة عمرها أقل من 42
ساعة.
– تنظف ثالث شرائح تنظيفا جيداً.
– يرسم دائرة على السطح السفلي، على كل شريحة من الشرائح
الثالثة ،مع كتابة أسماء البيئات على كل منها.
– تحضر لطخة لكل من البيئات، بالطريقة التي سبق شرحها.
• طريقة الصبغ وهي كاآلتي:-
1. تغمر اللطخة بصبغة ،Crystal violetوتتركها لمدة نصف
دقيقة.
2. تغسل الشريحة بعناية بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، بطريقة غير
المباشرة فوق اللطخة ( عدم تسليط الماء مباشرة على اللطخة).
28. بدون تجفيف الشريحة، تغمر اللطخة بمحلول اليود لمدة 3.
دقيقة.
بدون غسيل الشريحة، يضاف 59% كحول إثيلي إلى 4.
الشريحة، ويترك لينساب على اللطخة، لمدة ما بين
01- 02 ثانية، إلى حين توقف خروج كميات كبيرة من
الصبغة األساسية (غالبا بعد بضع ثوان)، وتعتمد مدة إزالة
الكحول على العوامل كثيرة، أهمها سمك اللطخة، والخبرة
العملية في تحضير اللطخة وصبغها.
تغسل الشريحة مباشرة بالماء المقطر، لمدة دقيقتين. 5.
تضاف الصبغة الثانوية السفرانين، وتترك لمدة 02 ثانية. 6.
تغسل الصبغة الزائدة بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، وتجفف 7.
بورق نشاف.
تترك لتجف. 8.
30. • الصبغة السالبة Negative Stain
• يمكن استخدام الصبغ السالب لمعرفة شكل، وترتيب الخاليا
البكتيرية، التي ال تتحمل التثبيت الحراري، الذي يشوه خالياها،
ولصبغ السبورات البكتيرية ( الحافظة) .Capsule
• في حالة إجراء الصبغ السالب، تظهر البكتريا واضحة جدا،
بالنسبة للخلفية الملونة التي حولها.
• تستعمل األصباغ الحامضية، التي ال تستطيع صبغ مكونات
الخلية البكتيرية، ولكنها تصبغ الخلفية حول الخلية فقط، بحيث
تصبح الخلفية ملونة ،وفي نفس الوقت ال تتلون الخلية، بحيث
تظهر البكتيريا كأجسام شفافة، في محيط معتم.
31. خطوات العمل •
تستعمل الشرائح النظيفة، والخالية من •
المواد الدهنية.
توضع قطرة صغيرة من الصبغة •
الحامضية، النيكروسين، على إحدى
طرفي الشريحة.
تؤخذ عينة من المزرعة الصلبة، ملء •
العقدة المعدنية ، مع قطرة من صبغة
نيكروسين، وتترك لتجف بدون توزيعها.
تلمس القطرة بأحد طرفي شريحة أخرى •
، وتحرك األخيرة يمينا ً ويساراً، يجب
توزع البكتيريا والصبغة،لتغطي اللطخة
ً
بالتدريج من لون المعتم إلى لون
الرمادي (94).
32. • تترك اللطخة لتجف عند درجة حرارة الغرفة.
• تفحص الشريحة تحت المجهر شكل (05).
• تغسل الشرائح، وتخلص من زيت من العدسة الشيئية
• تحفظ األدوات في مكانها المناسب بعد تنظيفها جيدا.
33. • صبغ الثابت للحامض Acid-fast stain
،Differential stain • تستخدم طريقة الصبغ التفريقية
في تحديد قدرة الخاليا البكتيرية من جنس
،Mycobacterium tuberculosisوالتي تسبب مرض
السل، و M. lepraeالتي تسبب مرض الجذام، واللتان
لهما القدرة على الحفاظ على الصبغة الرئيسية، عند
معالجتها بالكحول األثيلي، وحامض الكبريتيك،
• وقد وجد بأن أغلبية البكتيريا تفقد الصبغة الرئيسية، عند
عائلتي أعضاء عدا بالكحول، معاملتها
Mycobacteriaceaeو Norcardiaceaeمن الرتبة
،Actinomycetalesاللتان تحتوي جدران خالياهم على
مادة دهنية تشبه الشمع ( ،)Mycotic acidوالتي ال تقبل
جدرانها الصبغ من معظم الصبغات.
34. • طريقة العمل
• وتعتمد طريقة )(Ziehl-Neelsen methodبغمر اللطخة
كاربولفوكسين باسم تعرف بصبغة البكتيرية،
،Carbolfuchsinلتسهيل دخول الصبغة في البكتيريا، ويتم
بعد ذلك غسل اللطخة بمحلول الحامض – الكحول األثيلي،
إلزالة الصبغة من جميع الخاليا، ما عدا المقاومة لفعل ذلك
المحلول، وفي نفس الوقت، تستخدم صبغة أزرق المثيلين، بدال
من الصبغة األولى .
• هذا وقد وجد أن صبغة كاربولفوكسين أكثر ذوبانا ، في حامض
الكربوليك( الفينول) من الماء، وتذوب أيضا ً في الدهون أكثر
من الحامض – الكحول األثيلي، ويعطي كاربولفوكسين اللون
األحمر لمادة الدهن.
35. • وتتم خطوات العمل كالتالي:-
تحضر اللطخة البكتيرية ، والتي أخذت من بيئات 1.
Mycobacterium phleiو . ، .E. coliوتجفف هوائيا ً
تضع الشريحة المحتوية على اللطخة، على حامل ،Rackفوق 2.
حوض الغسيل.
توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح، لتثبيت الشريحة فوق 3.
الحامل.
تضاف كميات كبيرة من صبغة كاربولفوكسين. 4.
تسخن اللطخة والصبغة على بخار مائي يغلى لمدة 5 دقائق ، 5.
ويضاف مزيدا من الصبغة، كلما تطلب األمر ذلك، وال يسمح
بغليان الصبغة.
يتخلص من ورق الترشيح، وتغسل الشريحة جيداً بالماء 6.
المقطر.
ً
36. 7. يتخلص من الصبغة، بمعالجة اللطخة المصبوغة، بمحلول
الحامض – الكحول األثيلي لمدة 51 – 02 ثانية.
8. تغسل بالماء المقطر.
9. تضاف صبغة أزرق المثيلين، وتترك لمدة نصف دقيقة.
01.تغسل الشريحة بالماء المقطر، وتجفف بورق الترشيح.
11.تحضر شريحة أخرى، من البيئة البكتيرية الثانية بنفس
الطريقة.
21.تفحص الشريحتان تحت المجهر، وتدون المالحظات
31.البكتيريا التي تصبغ باللون األحمر، موجبة لصبغ البكتيريا
الثابت للحامض، أما البكتيريا التي تصبغ بلون األزرق
فهي سالبة لصيغ البكتيريا الثابت للحامض.
37.
38. • صبغ الكبسوالت Capsule Stain
• يمكن استخدام الصبغ السالب، لتوضيح الكبسولة ( عندما يكون
بيضاويا ً أو دائريا ً) حول الخلية البكتيرية، والذي يلتصق بسطحها،
مكونا ً طبقة لزجة، وتعطي طبقة مخاطية في حالة كون الكبسولة
غير منتظمة الشكل.
• من أهم أساسيات لصبغ الكبسوالت البكتيرية ما يلي:-
من الصعب صبغ الكبسوالت البكتيرية، ألنها تتكون من عديد 1.
السكريات، وعديد البيبتيدات.
معظم الكبسوالت ال تذوب في الماء، وال تحمل شحنات كهربائية، 2.
وبسبب لذلك فإن هذه الصبغات البسيطة ال ترتبط معها.
أغلبية طرق الصبغ التي تستعمل في الكشف عن الكبسولة؛ تصبغ 3.
البكتيريا والوسط المحيط بها، وال تصبغ الكبسولة.
ال تعامل اللطخة بالحرارة لتثبيتها، ألن الحرارة تسبب فقدان 4.
الكبسولة.
39. طريقة العمل: •
تنظف الشريحة بمطهر وتجفف بالهواء، ثم تمسك ، من أحد •
زواياها.
،K. pneumoniaeبواسطة تؤخذ عينة من بيئة بكتيرية •
عقدة الناقل، وتضع على سطح الشريحة لتجهيز اللطخة.
تترك اللطخة لتجف بالهواء، بدون استعمال الحرارة. •
تغمر اللطخة بصبغة crystal violetلمدة 5 – 01 دقائق. •
تغسل اللطخة بلطف بمحلول كبريتات النحاس 4 ،CuSOللتخلص •
من الصبغة crystal violetالزائدة .
تجفف محتويات الشريحة. •
تفحص الشريحة تحت المجهر، وتالحظ الخاليا لونها بنفسجي، •
محاطة بهالة زرقاء باهتة اللون، أو عديمة اللون، ويكون لون
الخلفية( األرضية) بنفسجي لذلك أيضا ً (الشكل 25).
40.
41. صبغ األبواغ( السبورات) الداخلية •
يستخدم الصبغ السبورات ، لتحديد مواقع األبواغ، داخل خلية •
البكتيرية، ومن أكثر األنواع المكونة لألبواغ الداخلية هي
بكتيريا كلوستيريديوم، والباسيليس، لألسباب التالية:-
األبواغ الداخلية غير نشطة، ومقاومة للظروف غير مناسبة •
للبكتيريا، سواء من الحرارة أو الكيماويات ، أو أي ظروف بيئة
أخرى.
األبواغ ليست وسيلة للتكاثر، وتبقى البكتيريا في حالة سكون، •
طالما استمرت الظروف غير مواتية.
تستخدم األبواغ في عملية تصنيف البكتيريا. •
األبواغ غير منفذة لمعظم الصبغات. •
تستعمل الحرارة لتثبيت الصباغات. •
42. شكل(35) الحظ DNAمحاط بغالف البوغ. ويظهر البوغ داخل الخلية الخضرية
وسوف تفقد الخلية جزء الخضري منها مع مرور الوقت
43. • طريقة العمل
1. تنظف شريحتان زجاجيتان.
2. جهز لطخه من بيئتين بكتيريتين، لباسيليس سابتيلس،
عمر أحدها 81 – 42 ساعة، واألخرى 27ساعة،
3. تجفف بالهواء، وتثبت بالحرارة.
4. توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح على اللطخة،
قبل إضافة صبغة أخضر مالكايت، لمنع التبخر الكامل
للصبغة، وجفافها قبل تسربها إلى األبواغ، وعليه في
جميع األحوال، يساعد التسخين على تمدد غشاء
األبواغ ، ويسمح بدخول الصبغة إلى الداخل، وتبقى
الصبغة داخل البوغ بالتبريد.
44. تغمر اللطخة بصبغة أخضر مالكايت MALACHITE •
.GREEN
تسخن على البخار لمدة 5 دقائق ، ويضاف مزيد من •
الصبغة، كلما أحتاج األمر لذلك.
ترمى الورقة في مكان مناسب ، وتغسل اللطخة بالماء •
المقطر جيداً.
تضاف صبغة السفرانين لمدة نصف دقيقة. •
تغسل الشريحة بالماء المقطر وتجفف. •
تفحص الشرائح تحت المجهر( شكل 45). •
45.
46. • تقارن النتائج مع شرائح الجاهزة، ويالحظ مواقع األبواغ
في الخاليا المختلفة شكل(55) .
شكل (45) طريقة صبغ السبورات، ومثال على مواقع المختلفة للسبورات كما
هو موضحه في الدائرة أسفل الشكل .
47.
48. • صبغ أسواط البكتيرية
• من أهم أهداف صبغ األسواط ما يلي:-
1. مشاهدة األسواط.
2. ترتيب األسواط وموقعها.
3. تستعمل األسواط للتعرف على أنواع البكتيريا.
4. ومن أهم أساسيات صبغ أسواط البكتيرية التالية:-
5. تعتبر األسواط رفيعة جدا، وسريعة الكسر، ال يمكن صبغها
بالصباغات العادية.
6. تحتاج األسواط إلى تقنية وصبغة معينة، لتزيد من قطرها.
7. يمكن مالحظة حركة البكتيريا، عن طريقة القطرة المعلقة، أو
عن طريق صبغ األسواط،.
49. طريقة العمل: •
يجب أخذ الحيطة والعناية الفائقة؛ لمنع فقد األسواط ، بتنظيف •
الشرائح جيداً، مع تداول البيئة البكتيرية بعناية كبيرة.
تؤخذ قطعة من وسط بيئة اآلجار الصلبة ، حيث تنمو البكتيريا، •
مع عدم لمس المزرعة باليد.
توضع قطعة اآلجار برفق على الشريحة بحيث تكون مواجهة •
للنمو، ترفع تلك القطعة وتعاد إلى الطبق.
تترك البكتيريا الملتصقة بالشريحة. •
تجفف بالهواء، دون استعمال الحرارة. •
تغمر الشريحة بحامض التانيك Tannic acidالمثبت لمدة •
عشر دقائق.
تغسل الصبغة برفق بالماء المقطر. •
51. • حركة البكتيريا في أوساط النمو شبه صلبة
• تستخدم األوساط النمو شبه صلبة، المحتوية على كميات قليلة من
مادة اآلجار ويحقن الوسط النمو بالبكتيريا المراد اختبار حركتها،
داخل الوسط النمو، بواسطة إبرة حقن(بدون عقدة في نهايتها
شكل75) في أنابيب النمو ، وتحضن األنابيب لمدة زمنية معينة،
وتؤخذ المالحظات مباشرة بمجرد المالحظة التغيرات التي حصلت
في الوسط الغذائي .
شكل(75) إبرة الحقن الحظ أنه ال توجد في نهايته حلقة دائرية
52. • تسمح التركيزات القليلة من اآلجار في الوسط الغذائي،
بتحرك البكتيريا بحركة محدودة من خالل منطقة الطعن،
وتحدد الحركة نتيجة حدوث تفرع النمو في منطقة
الطعن، ويمكن إضافة صبغة معينــــة مثل أمالح
تترازيوليوم) ، Tetrazolium salt (TTCلمالحظة تفرع
النمو بلون األحمر الفاتح (فجلي اللون).
يجب حقن اإلبرة بطريقة مستقيمة، وتسحب بنفس •
الطريقة، للحصول على نتائج جيدة (شكل85).
53.
54. • اختبار قدرة البكتيريا على الحركة
• Motility Determination
تستخدم طريقة اختبار قدرة البكتيريا على الحركة، للتعرف على •
بكتيريا مجهولة النوع ( الجنس)، حيث يجرى لها اختبار على ذلك،
ويتم مالحظة مدى حركتها خالل الحقل المجهري، وهناك نوعان من
الحركة وهما:
– حركة حقيقة فعلية ( الحركة من مكان إلى آخر).
– حركة كاذبة على شكل اهتزازات أو ارتجاج (حركة برا ونية).
توجد عدة طرق يمكن بها معرفة قدرة البكتيريا على الحركة وهي •
كاآلتي:-
Wet-Mount الطريقة الرطبة •
Hanging Drop طريقة النقطة المعلقة •
Culture Method الطريقة المزرعية •
لقد سبق شرح طريقة الرطبة أو المبتلة وطريقة النقطة المعلقة •
55. • تسمح التركيزات القليلة من اآلجار في الوسط
الغذائي، بتحرك البكتيريا بحركة محدودة من خالل
منطقة الطعن، وتحدد الحركة نتيجة حدوث تفرع
النمو في منطقة الطعن، ويمكن إضافة صبغة
معينــــة مثل أمالح تترازيوليوم Tetrazolium
) ،salt (TTCلمالحظة تفرع النمو بلون األحمر
الفاتح (فجلي اللون).
يجب حقن اإلبرة بطريقة مستقيمة، وتسحب •
بنفس الطريقة، للحصول على نتائج جيدة (شكل85).
56. • تقنية عزل البكتيريا Isolation Techniques
• طريقة العزل بتخطيط األطباق Streak Plate Method
of Isolation
• الهدف من عزل البكتيريا بتخطيط األطباق:-
• تستخدم هذه الطريقة للحصول على مستعمرات نقية، من
بيئة محتوية على عديد من األنواع األخرى، وذلك لألسباب
التالية:-
1. تعتبر هذه الطريقة واسعة االنتشار
2. تستخدم لخفض أعداد وكثافة األحياء الدقيقة في البيئة،
ومن ثم سهولة عزلها من األنواع غير المرغوبة.
3. تعتبر كل مستعمرة معزولة مستعمرة نقية ( من المعروف
نظريا بأن كل مستعمرة تبدأ بخلية من نوع واحد فقط).
57. • طريقة العمل:
• طريقة التخطيط المتعامد:
1. تصب بيئة اآلجار المغذي في أطباق بيتري، عند
درجة 54 ºم، وتترك لتبرد وتتصلب.
2. تغمر عقدة الناقل المعدني المعقم، في بيئة بكترية
مختلطة ، أو من معلق المادة المراد العزل منها.
3. تخطط مساحة صغيرة على سطح اآلجار، عند حافة
طبق بيتري، بلمس السطح بعقدة الناقل المجففة،
بدون ضغط حتى ال يخرج سطح اآلجار
( المساحة1).
4. تعقم حلقة الناقل وتترك لتبرد لمدة 5 ثواني.
58. يحرك الطبق مع فتح الغطاء الزجاجي لطبق بيتري ، 5.
أخرى ، ويرسم على وتعاد عملية التخطيط مرة
سطح اآلجار خطوط على شكل حرف Sبواسطة الناقل
على المساحة 2 بعرض الطب
يعقم الناقل مباشرة ويترك ليبرد. 6.
يخطط سطح اآلجار تخطيطات( 6 – 7 خطوط)، بحيث 7.
تكون عمودية
يعقم الناقل ويترك ليبرد. 8.
تكرر عملية التخطيط في االتجاه 3 و4. (شكل 95). 9.
59.
60. • طريقة التخطيط المتشعع Radiant Streak Method
1. تعقم حلقة الناقل، وتبرد لمدة 5 ثواني.
2. ترسم بواسطة الناقل 7 –8 خطوط كما موضح في شكل (06).
61. يعقم الناقل مرة أخرى ويترك ليبرد. 3.
يخطط سطح اآلجار، بحث تكون الخطوط متقاطعة 4.
مع الخطوط التي سبق تخطيطها في السابق.
يعقم الناقل مرة أخرى، ويترك ليبرد. 5.
توضع األطباق مقلوبة في الحضانة عند درجة 6.
73ºم ،لمدة 42 – 84 ساعة.
