バイオインフォマティクスによる遺伝子発現解析

バイオインフォマティクスによる
遺伝子発現解析
東京工業大学大学院情報理工学研究科計算工学専攻
瀬々潤
sesejun@cs.titech.ac.jp
第２回数理生物サマーレクチャーコース
@ RIKEN CDB

目次
• イントロダクション
• 遺伝子発現の取得と意味
• データ解析の流れ
• 前処理
• 正規化
• 特徴選択，群間差のある遺伝子群の抽出
• データ解析（データマイニング，機械学習）
• クラス分類手法
• クラスタリング
• 結果の解釈
• 解析結果と生物学的・医学的な知識との関連付け
• 新型シーケンサのデータ解析に関して
2

目次
• 前処理
• 正規化
• 結果の解釈
3

DNA(ゲノム)
mRNA
遺伝子
タンパク質
細胞
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under a Creative Commons 表示 2.1 日本 License
4

遺伝子発現
• 細胞が異なれば，遺伝子の転写量が異なる
• 遺伝子の転写量を調べることは，細胞の個性を知るための，そ
れなりに良い指標になるだろう．
• 実験が比較的容易
• 網羅的解析も可能：マイクロアレイ, RNA-seq
• 今後は大規模にたんぱく質や代謝物質が取れるようになると思う
のが，現時点では，規模・定量性の面で不十分なので，mRNAを
用いている． 5
ゲノム
mRNA
遺伝子 1 遺伝子 2 遺伝子 1 遺伝子 2

何が比較できるか
6
ゲノム
mRNA
遺伝子 1 遺伝子 2 遺伝子 1 遺伝子 2
Aさんの心臓 Bさんの心臓
Aさんの血液 Aさんの大脳
同一個体，組織が異なる
朝の血液夜の血液
同一個体，同一組織，採取時期が異なる
組織は同一だが，個人が異なる

7
wound healing genes
cholesterol biosynthesis genes
Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns
Eisen et al. PNAS 95:14863, 1998
An integrated encyclopedia of DNA
elements in the human genome.
The ENCODE Project Consortium
Nature 489:57, 2012
cell cycle
Removed
Removed

発現量大規模取得法の歴史
• 大きく分けて2通り
• タグ（シーケンス）を利用
• 遺伝子の特定箇所をシーケンス．これをタグと呼ぶ．
• その配列がどの遺伝子由来であるかを調べる
• BodyMap, SAGE, MPSS, CAGE, RNA-seq
• ハイブリダイゼーションを利用
• Microarray
• 採取できるのでは大量の遺伝子の発現「スナップショット」
制限酵素等で切断
切断した端を読む（タグ）
Gene X
タグが由来する
ゲノム上（遺伝子上）の
位置を特定する．
各遺伝子に由来するタグが
何個あったかを数える
＝発現量 8

マイクロアレイ
• 遺伝子発現を大規模に観測（ほぼ全遺伝子 or 全exon）
• Agilent社の場合，各遺伝子60塩基のプローブ
• 相補鎖の配列を持つ遺伝子が観測できる
M
icroarray
ATGCCAG ATGCCAG
CATGTACGGTCGATCAG
Probes in a spot
A probe
Cells
mRNAs

Golub et al. Science,
286 (5439), 531-537, 1999.
10
Removed

目次
• 前処理
• 正規化
• 結果の解釈
11

遺伝子発現解析の流れ
異なる組織，異なる刺激，異なる時間
細胞間の働きの違いの同定 (刺激等に対する)応答の理解
観測対象
12

発現の観測（定量化）異なる組織，異なる刺激，異なる時間
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
観測対象
13

発現差のある遺伝子群の抽出
(Diﬀerential Expressed Genes)
データマイニング，機械学習
手法を用いた解析
(Clustering, Classiﬁcation)
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
観測対象
14

Gene Ontology,
Pathway
Phenotype，
疾患
転写制御領域
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
観測対象
15

Gene Ontology,
Pathway
Phenotype，
疾患
転写制御領域
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
観測対象
16

Gene Ontology,
Pathway
Phenotype，
疾患
転写制御領域
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
観測対象
観測（データ）
前処理
解析
パタン抽出
知識
17

目次
• 前処理
• 正規化
• 結果の解釈
18

• 各Sampleが1点．遺伝子が次元．
• 細胞の分類
• 疾患の分類
19
Genes
Sam
ple
1
Sam
ple
2
Sam
ple
3
• 各遺伝子が1点．サンプルが次元．
• 遺伝子の分類，機能予測
Sample
Gene 1
Gene 2
Gene 3
...
解析手法としては，どちらも多次元上の点
（ベクトル）が多数ある状態なので，
変化なし．
行列

前処理
• 正規化←「単位」を合わせる
• 特徴選択←信頼に足らないデータを除く
• サンプル，遺伝子共に
20
Genes
Samples
Genes
Samples

正規化(Nomalization)
• 異なるサンプル間（replicateも含む）は独立した実験
• 抽出溶液の濃さ，等に依存した「ズレ」が生じているかも
• 互いに比較がしたいので，なるべく妥当な比較ができるように変換
を行う
• 良く行われるのは，平均や四分位点を合わせるように平行移動．
• ただし，外れ値の影響を除くため，上位＆下位 x%は除いて計算
される事も多い (trimmed mean)．
• スケート等の採点でみられる方法と同様．
発現量
個数 21

目次
• 前処理
• 正規化
• 結果の解釈
22

特徴選択
• 必ずしもデータ全てに意味があるわけではない．
• 無関係なデータは省いてから，解析を行いたい．
• 健常者50名とガン患者50名から，遺伝子発現を観測
• 患者の分類に関係無さそうな遺伝子を除外して解析
• 各遺伝子に関して，その発現量と{健常，患者}に相関が
あるかを調べる（t-検定，Mann-Whitney U，級間分
散，情報量等）
• 無関係の無いものを除外し，解析をスタート
• 「特徴選択」と呼ばれる
• 特徴選択をすると，データの「ノイズ」が減るので，解
析性能が向上するケースがある
• 逆に，本当は必要だった情報を削ぎ落してしまうことも
あるので，注意． 23

(似て非なるもの) 特徴抽出
• 代表的なものとして，PCA(主成分分析)やICA(独立成分分析)
• 特徴を選択するのではなく，新しい特徴を創りだす
• 前処理として行われることもあるが，可視化が目的の場合も多い
• 高次元のデータを，低次元に落として，様子を観察できる
• 改めて，「次元の解釈」をする必要あり．
x1
x2
y1
y2
24

その他の前処理
• 必要に応じて行う（実験計画に依存）
• （基準となる細胞があれば）基準に比べて何倍発現量が上
がった or 下がったか，に変換する．
• その後，必要に応じて Z変換
• 各遺伝子毎の発現量が，平均0, 分散1になるように変
換を行う．
• 取得したいずれのサンプルでも発現量の低いものを除く
• 本当に発現していないのかもしれないし，遺伝子領域やプ
ローブが誤っているのかもしれない
• 目的とは異なる変動を示すと予想されている遺伝子群を除く
• 例えば日変動を見たい時に，日内変動が大きい事が知られ
ている遺伝子は除外するなど．
25

目次
• 前処理
• 正規化
• 結果の解釈
26

蓄積から解析へ
• データベースにデータが蓄積されている
• 蓄積されたデータは，有効活用したい！
• データを有効活用して，解析を行う
データマイニング＋αの例
• Amazonの推奨システム
• GoogleやYahooの検索ランキングや広告配信
• ここでは
• 疾患予測や遺伝子機能予測に向けた技術を考える 27

データ解析は
シミュレーションとは異なる
• シミュレーション
• 観測できないデータの物理法則・モデルによる補完
• 例：気象予報
• 予測
• 物理法則の詳細はわからないけど，精度良く当てる
• 例：ガン発症予測，余命の予測，商品の購入予測，顔認識
• 分析
• データ内に潜む傾向を調べる．
• 例：同時に購入した商品を調べる
• シミュレーションは物理法則を必要とする
• 予測，分析は多様かつ信頼の出来るデータを必要とする
• ここでは，「予測」と「分析」を行います
28

医学系の例
患者さんから採取した発現量とその後の追跡結果から
新たに来た患者の疾病を予測したい．
5.1. クラス分類問題 123
サンプル番号遺伝子 1 遺伝子 2 遺伝子 3 遺伝子 4 発病
A -0.43 1.39 0.87 0.79
B -0.4 -0.45 1.07 0.87 ×
C 0.63 0.23 -2.56 0.45
D -0.42 1.59 -0.15 -0.74 ×
E 0.23 -0.86 0.39 -0.55 ×
F -0.43 -0.7 1.69 0.25 ×
G 0.26 0.21 0.29 0.34
H 0.42 -0.27 0.86 0.58 ×
I -0.63 -0.58 -0.25 -0.19 ×
J -0.92 0.51 0.64 -0.32 ×
K -0.53 0.25 -0.23 0.3
L 0.21 -0.12 -0.28 -0.46
表 5.1 クラス分類問題の訓練データ
M -0.43 1.39 0.87 0.79 ?
N 0.63 -0.45 1.07 0.87 ?
O -0.4 0.23 -2.56 0.45 ?
A -0.43 1.39 0.87 0.79
B -0.4 -0.45 1.07 0.87 ×
C 0.63 0.23 -2.56 0.45
D -0.42 1.59 -0.15 -0.74 ×
E 0.23 -0.86 0.39 -0.55 ×
F -0.43 -0.7 1.69 0.25 ×
G 0.26 0.21 0.29 0.34
H 0.42 -0.27 0.86 0.58 ×
I -0.63 -0.58 -0.25 -0.19 ×
J -0.92 0.51 0.64 -0.32 ×
K -0.53 0.25 -0.23 0.3
L 0.21 -0.12 -0.28 -0.46
M -0.43 1.39 0.87 0.79 ?
N 0.63 -0.45 1.07 0.87 ?
O -0.4 0.23 -2.56 0.45 ?
P 0.42 1.59 -0.15 -0.74 ? 29

量の採取 5
サンプルの時間 10 分 20 分 30 分 40 分
遺伝子 1 0.74 0.76 1.34 1.75
遺伝子 2 2.01 2.62 0.87 0.69
遺伝子 3 0.87 0.60 1.83 1.90
遺伝子 4 1.73 1.83 0.96 0.93
遺伝子発現量データの例．各行が一つの遺伝子，各列が採取
した時間を表している．値は 0 分のサンプルに対して，何倍
の発現を有しているかを示す．
遺伝子の使われ方を調べる
遺伝子2,4 が類似．
遺伝子1,3も類似
株価や為替の変動なども同様
30

データマイニング・機械学習
• 教師あり学習 (Supervised Learning, クラス分類,
Classiﬁcation)
• 予測をする
• 遺伝子発現から患者の病態，術後経過を予測
• 遺伝子発現から遺伝子の機能を予測
• 教師なし学習 (Unsupervised Learning)
• 分析（分類）をする
• クラスタリング (Clustering)
• 「似ている」グループを発見する
• 刺激に対して同様に応答する遺伝子群の発見
• 相関ルール (Association Rule)
• 84塩基目と98塩基目のSNPが同時に起こりやすい
31

利用方法
• 最近は，様々な環境で実装されている
• R
• Numpy/Scipy (Python)
• Weka (Java)
• Matlab
• いずれも，ほぼGUIでは操作できないが，データを入力し，手
法を選択した後，パラメータを調整すれば，計算してくれる
• 手法がどのようなもので，パラメータは何であるかを知るこ
とが重要．
• 発現解析に特化したソフトウエアではGUIで使える場合もある
• GeneSpring
• Spotﬁre
• とはいえ，手法やパラメータは自分で選択する必要あり
32

教師あり(教師つき)学習
• データが訓練データとテストデータに分けられる．
• 各訓練データにはクラス（＝答え）が存在している．
• テストデータのクラスを当てたい
A -0.43 1.39 0.87 0.79
B -0.4 -0.45 1.07 0.87 ×
C 0.63 0.23 -2.56 0.45
D -0.42 1.59 -0.15 -0.74 ×
E 0.23 -0.86 0.39 -0.55 ×
F -0.43 -0.7 1.69 0.25 ×
G 0.26 0.21 0.29 0.34
H 0.42 -0.27 0.86 0.58 ×
I -0.63 -0.58 -0.25 -0.19 ×
J -0.92 0.51 0.64 -0.32 ×
K -0.53 0.25 -0.23 0.3
L 0.21 -0.12 -0.28 -0.46
M -0.43 1.39 0.87 0.79 ?
N 0.63 -0.45 1.07 0.87 ?
O -0.4 0.23 -2.56 0.45 ?
A -0.43 1.39 0.87 0.79
B -0.4 -0.45 1.07 0.87 ×
C 0.63 0.23 -2.56 0.45
D -0.42 1.59 -0.15 -0.74 ×
E 0.23 -0.86 0.39 -0.55 ×
F -0.43 -0.7 1.69 0.25 ×
G 0.26 0.21 0.29 0.34
H 0.42 -0.27 0.86 0.58 ×
I -0.63 -0.58 -0.25 -0.19 ×
J -0.92 0.51 0.64 -0.32 ×
K -0.53 0.25 -0.23 0.3
L 0.21 -0.12 -0.28 -0.46
M -0.43 1.39 0.87 0.79 ?
N 0.63 -0.45 1.07 0.87 ?
O -0.4 0.23 -2.56 0.45 ?
P 0.42 1.59 -0.15 -0.74 ?
クラス
訓練データ
(Training Data)
テストデータ
(Test Data)
属性（特徴量）
33

教師あり(教師つき)学習
• 患者の疾患を予測
• データ＝患者，属性＝遺伝子，クラス＝疾患の有無
• 遺伝子の機能を予測
• データ＝遺伝子，属性＝サンプル，クラス＝機能
A -0.43 1.39 0.87 0.79
B -0.4 -0.45 1.07 0.87 ×
C 0.63 0.23 -2.56 0.45
D -0.42 1.59 -0.15 -0.74 ×
E 0.23 -0.86 0.39 -0.55 ×
F -0.43 -0.7 1.69 0.25 ×
G 0.26 0.21 0.29 0.34
H 0.42 -0.27 0.86 0.58 ×
I -0.63 -0.58 -0.25 -0.19 ×
J -0.92 0.51 0.64 -0.32 ×
K -0.53 0.25 -0.23 0.3
L 0.21 -0.12 -0.28 -0.46
M -0.43 1.39 0.87 0.79 ?
N 0.63 -0.45 1.07 0.87 ?
O -0.4 0.23 -2.56 0.45 ?
A -0.43 1.39 0.87 0.79
B -0.4 -0.45 1.07 0.87 ×
C 0.63 0.23 -2.56 0.45
D -0.42 1.59 -0.15 -0.74 ×
E 0.23 -0.86 0.39 -0.55 ×
F -0.43 -0.7 1.69 0.25 ×
G 0.26 0.21 0.29 0.34
H 0.42 -0.27 0.86 0.58 ×
I -0.63 -0.58 -0.25 -0.19 ×
J -0.92 0.51 0.64 -0.32 ×
K -0.53 0.25 -0.23 0.3
L 0.21 -0.12 -0.28 -0.46
M -0.43 1.39 0.87 0.79 ?
N 0.63 -0.45 1.07 0.87 ?
O -0.4 0.23 -2.56 0.45 ?
P 0.42 1.59 -0.15 -0.74 ?
クラス
訓練データ
(Training Data)
テストデータ
(Test Data)
属性（特徴量）
34

k-最近点分類 (Nearest Neighbor)
• 最も近いk点のクラスを調べ，多数決を取る．
• 下図では，Qの点のクラスが丸か四角かを予想したい
• 3-最近点分類であれば，E,F,Jが最も近い3点で，丸が
2点含まれるので，Qは丸と予測する．
遺伝子1の
発現量
遺伝子2の発現量
3-ＮＮ
遺伝子1の
発現量
遺伝子2の発現量
(A) 訓練データ (B) サンプルのクラス予測
A
B
C
Ｄ E
F
G
I
L
J
K
H
Q
A
B
C
Ｄ E
F
G
I
L
J
K
H
Q
35

決定木
• 雑誌の裏にある「占い」の様な感じのもの
• データを与えると，決定木アルゴリズムは，訓練データでの正答率が高
くなるように決定木を作成する．
• テストデータを決定木に当てはめ，予測を決定する
• 決定木を複数組み合わせるランダムフォレストも利用される
• 利点：Gene signature (状況を表す遺伝子群)が見つかる．シンプル．
• パラメータ：木の作成時に利用する関数．木の高さの調整項目．
遺伝子1の発現は
5以上？
遺伝子3の発現は
7以上？
Yes No
発病する発病しない
Yes No
発病しない
例えば：
新たな患者の属性値
・遺伝子1: 8.2
・遺伝子2: 10.4
・遺伝子3: 9.5
・遺伝子4: 3.1
木を辿ってみると・・・
36

SVM (Support Vector Machine)
• 機械学習分野を席巻した手法
• 理論的な面白さと同時に，簡単に利用できるプログラムが出回
り，精度が高いことが実証されていった．
⃝と△の境界線を決めたい．色々な引き方が可能
・Fisherの線形判別（古典的な方法）
・重心が遠く，かつ，クラス内の分散が小さくなるような境界
・SVM
・「溝」が大きくなるような境界
37

カーネル化
• SVMの「線形分離可能」は非常に強い仮定
• 工夫１：ソフトマージン．誤分類している点があったら，その分
ペナルティを加える．Cで表される．
• 工夫２：カーネル化
• SVMの計算では「点の位置」より「点と点の距離」の方が本質
的．距離情報に変換することで，線形分離可能な空間を作る．
• 線形カーネル，ガウスカーネル，シグモイドカーネル等
• K-最近点分類も，基本的に距離しか使わない
• 距離は文字列間や化合物間も定義可能なので，より汎用的
38

その他の主なクラス分類手法
• ベイズの定理を用いたもの
• ナイーブベイズ等
• 複数のクラス分類手法を組み合わせるもの
• ブースティング
• ニューラルネットワーク
• ディープネット
39

クラス分類と回帰問題
• 2つのクラスがある時に，それらを分類する手法を紹介した．
• 紹介しなかった方法としてベイズの定理を用いた方法や，複数
の手法を組み合わせる方法（ブースティング）など．きりがな
い・・・
• 同様の方法は「３つ以上のクラスがある場合（他クラス分類）」
や「数値の予測の場合（回帰問題）」にも適用できる．
• 回帰問題は，（一般化）線形回帰などと繋がっていて，非線形
の回帰を可能にする．
• 冒頭に挙げた発現量予測は，回帰の一種．
40

クロスバリデーション・精度の検証
• クラス分類手法には，精度評価が必須．
• どの方法がよいのか？
• 同一の方法でも，どのパラメータが良いのか？
• どれくらい正解している見込みのある予測なのか？
• 予測できたとしても，正答率が高くないかもしれない．
• 答えの分かる「テストデータ」を用意して，予測結果の精度を
測れば良い
• 一般に「答えの分かるテストデータ」を用意することは出来な
いので，与えられた訓練データを擬似的な「訓練データ」と
「テストデータ」に分割して精度評価する．
• クロスバリデーション
41

n-fold cross validation
• サンプル全体を重ならないようにN分割する
• N回モデル作成を実行して，精度を測る
• 下記の例では，9個中何個正解するかを調べる
• 特にn=Nの時，leave-one-out cross validationと呼ぶ
1
2
3
4
5
6
7
8
9 1
2
3
4 5
6 78
9
A
B
C
訓練データテストデータ
24 5 A
6 78 B
139 C
13
6 78
9
B
C
24 5 A
24 5 A
139 C
6 78 B
3-fold cross validation の例
42

クラスタリング
• グループ＝クラスタを見つける
• 似ているものを同一グループに
• 異なるものを異なるグループに
• 点（サンプル）＝個体の場合
• 疾患の種類を分類（3種類の疾患がある，等）
• 近縁種のグループ分け
• 点（サンプル）＝遺伝子の場合
• 遺伝子を機能毎に分類
43

クラスタリング
• グループ＝クラスタを見つける
• 主として2通り
• 非階層型クラスタリング
• クラスタを作る個数を指定して，クラスタを作成する
• 階層型クラスタリング
• 系統樹の様な階層構造と共に，クラスタを生成する
• いずれの方法でも，ポイントは点（クラスタ）の間の距離
の測り方．
44

点の間の距離の定義
• 各点はサンプルあるいは遺伝子
• それぞれ，次元は，遺伝子もしくはサンプル
• 一般的な距離の定義
• 直線距離，マンハッタン距離
• 点と点の間の類似度（類似度が高→距離が近い）
• コサイン角度，相関係数
• 情報量（Kullback-Leibler or Jensen-Shannon divergence等）
x
y
(A) 直線距離
（ユークリッド（ノルム）距離）
(B) マンハッタン距離
x1
x2
dx1
dx2
dx2
1 + dx2
2 |dx1| + |dx2|
x
y
x1
x2
dx1
dx2
x1
(C) コサイン距離
x2
θ
45

k-means クラスタリング
• 非階層型クラスタリング．
• k はクラスタの個数．予め決める必要あり．
• 初期値鋭敏性有り（初期値に依存して結果が変わる）
m(1)
m(2)
x
m(1)
m(2)
仮のクラスタの中心を適当に2点決める
（ここでは与えられた点から2点選んだ）
各点を，最も近い中心のクラスタに
所属すると考えて，割当を決める．
46

k-means クラスタリング (2)
• 最も近い点「だけ」に属するのではなく，距離に従った「属し度合い」を定義す
れば，1点が複数のクラスタに属するような「ゆるい」方法が作れる
• Soft k-means
現在のクラスタ割当を基に，
各クラスタの中心を求める．
クラスタの割当を解消する
・・・
収束する（or 一定回数終了）
まで繰り返す．
47

階層型クラスタリング
• 階層的にクラスタを生成するクラスタ生成手法
• クラスタ間の距離の測り方で，単連結法（最短距離法），
完全連結法（最長距離法），Ward法等がある．
• 系統樹作成法との関連を考えるのも良い
• 基本的な手順は全て同じ．
48
E
(A) B,C及びD,Fの併合 (B) 点A,Eのクラスターへの併合 (C) 単連結法で生成したデンドログラム
A
B
C
D
E
F
G
A
B
C
D
F
G
A B C DE F G
4
3
6
5
2
1
1
2
3
4

距離法
クラスタ X クラスタＹ
クラスタ間
の距離
クラスタ X クラスタＹ
クラスタ間
の距離
(A) 単連結法での距離
最も近い点の距離
(B) 完全連結法での距離
最も遠い点の距離
(C) 平均結合法
全点対間の距離の平均
(D) ウォード法(Ward s method)
クラスタ中心までの距離の和
49

階層型クラスタリング
Hierarchical clustering
k-means クラスタリング
D'haeseleer P. 2005. How does gene expression clustering work? Nature Biotechnology 23: 1499–1501. 50
Removed
Removed

NMF：非負行列因子分解
(Non-negative Matrix Factorization)
• 非負の行列から，頻出するパタンをまとめていく．
• 発現のクラスタリングの代わりに用いられることがある
• Kがクラスタ数．行と列の両方のクラスタが求まるのが嬉しい
J
I
J
I=
K
K
1 1 2 3 1
0 1 0 1 1
2 0 4 4 0
3 0 6 6 0
1 0 2 2 0
0 1 0 1 10 1
1 1
2 0
3 0
=
Lee DD, Seung HS. 1999. Learning the parts of objects by non-negative matrix factorization. Nature 401: 788–791.
電子情報通信学会誌 Vol.95 No.9 pp.829-833 2012年9月より例を転載
51

共発現ネットワーク
• 発現パタンの近い遺伝子に線を引いたネットワークを作る
• そのネットワークを可視化，（ネットワークの上で）ク
ラスタリング，クリークの発見，次数の解析などを行
なって，解析する
Nayak RR, et al. 2009. Coexpression network based on natural variation in
human gene expression reveals gene interactions and functions.
Genome Research 19: 1953–1962. 52
Removed

Gene Ontology,
PathwayPhenotype 転写制御領域
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
観測対象
53

目次
• 前処理
• 正規化
• 結果の解釈
54

クラスタ生成後の解析
• 状況
• 遺伝子のグループは求まった
• 疾患と相関高い遺伝子群は求まった
• 問題
• その遺伝子群が，どのように働いているのかを知りたい
• 遺伝子群と既存知識との対応付けを取りたい
• 解法
• その遺伝子群と，知られた機能との対応を順に取っていく
• 10遺伝子中 5遺伝子が膜タンパクに関連していること
は，よくあるだろうか？
• 10遺伝子中 9遺伝子がTCAサイクルに関わることは，
よくあるだろうか？
• そんなことはめったに起こらない対応を求める
• ＝その機能は，遺伝子群に関連深い 55

超幾何分布
• 全部で N個の玉が入った箱を考える．
• 内，N0個が赤，N-N0個が青だとする．
• n回引いた時に，x回以上赤を引く確率は？（非復元抽出）
• Nが十分大きいと，非復元と復元に差異がなくなるので，
二項分布(母比率p=N0/N)と一致．
• 全 N遺伝子中， N0 遺伝子が調べたい機能Fを有している．
• （着目する）クラスタに n遺伝子が入っている．
• x遺伝子以上が機能Fを有している確率は？
N0
x
N N0
n x
N
n
.
N0X
x0=x
N0
x0
N N0
n x0
N
n
.丁度x回の場合 x回以上なので
56

「機能」の種類
• 遺伝子の機能，そのたんぱく質の局在
• クラスタ内の遺伝子に共通する機能や局在があるか？もし存在
すれば，特定の機能が誘導されている事が分かる．あるいは，
特定の機能が，どのような発現パタンを取るかが分かる．
• パスウエイ
• クラスタ内の遺伝子が共通したパスウエイに関わっているか？
特定のパスウエイが使われている事が分かる．
• 転写因子結合モチーフ配列
• クラスタ内の遺伝子の上流に共通するモチーフ配列があるか？
もし存在すれば，上流の転写因子が予測できる
• たんぱく質ドメイン
• クラスタ内の遺伝子が共通して持つドメインがあるか？特定
の機能が誘導されている事が分かる．
57

Gene Ontology
• Term は全ての種で共通
• 各Termに種毎に遺伝子が関連付けられている
• なるべく下の階層に配置されていることに注意
http://www.yeastgenome.org/help/gotutorial.html
ADAMTS13
NCSTN
PPP4R2
RABGGTB
ICMT
BAP1
ARPC4
TTLL1
...
計60遺伝子
58

多重検定補正
• たくさん検定を行うと，偽陽性が高い確率で生まれる
• 例えば，p-value < 0.05 の検定を100個の機能に対して行えば 99.4%
の確率で，関連する機能が見つかってしまう
• 「うそ」の発見が起こる
• Natureの投稿規定にも，「（必要なときには）多重検定補正を行うこ
と」と触れられている
• よく使われる補正方法が２通り
• FWER: 1つでも偽陽性が生まれる確率を α以下にする
• 通常用いられる補正方法
• Bonferroni 補正，Holmの改良等
• Bonferroni: 元のp-value * 検定数を補正後のp-valueとする
• FDR: 検出された中で，擬陽性が α以下になるように補正する
• 生命科学のデータでは，FWERはキツすぎることがあるので，導
入された方法
• Benjamini-Hochberg, Storey-Tibshirani 等． 59

Gene Set Enrichment Analysis
High Low
High Low
理想
現実
統計的に有意
有意にならない，
結構変化あるのに・・・
High Low 高いところだけで判断したい．
ランダムに遺伝子ー機能の関係を入れ替えて，ESが，元のデータ以上になる確率を計算する
→これをp-valueとする．
Enrichment
Score (ES)
着目する機能に含まれている遺伝子に
はプラスポイントを与え，それ以外の
遺伝子にはマイナスポイントを与える
グラフを作る．この山の高さ（谷の深
さ）をEnrichment Score とする．
60
Subramanian et al. PNAS. 2005.

まとめ
61
Gene Ontology,
Pathway
Phenotype，
疾患
転写制御領域
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
観測対象

目次
• 前処理
• 正規化
• 結果の解釈
62

RNA-seq
• 遺伝子の量をリードの数を数えることで定量化
DNA
mRNA
次世代シーケンサ
から得られるリード
（100塩基程度の塩基配列）
リードのマッピング
（リードをゲノムの
領域に対応付ける）
発現量
63

RNA-seqのワークフロー
• 基礎的な要素技術は作成された
• 実用面で，もう少し改良されても良い状況．
リード
・DESeq, EdgeR, Cuﬀdiﬀ
環境は2つ？それとも，3つ以上？
Splicingを見たいか？
発現差異のある遺伝子群の同定
・replicate が必須．
・正規化は必要なし
正規化
・RPKM, FPKM
クラス分類，クラスタリング
•基本的に，マイクロアレイと同じ
方法が利用可能
•RNA-seqの「タグ」を活かした
方法について，論文は出ている
が，広まって行くかは不明．
全遺伝子の発現量
64

RPKM
(Reads Per Kilobase per Million mapped reads)
• 遺伝子1と遺伝子2の発現量を求めたい
14本のリード 14本のリード
遺伝子1 遺伝子2
発現量は同一？ => No
単位長さあたりの発現量 RPKM が利用される [Montazavi et al., 2008 ]
RPKM=Reads Per Kilobase of exon model per
Million mapped reads
遺伝子(Exon)上の全リード
実験で読まれた全リード(100万単位) * 遺伝子(Exon)長(KB)
正規化
65

FPKM
(Fragments Per Kilobase per Million mapped
reads)
• 基本的にRPKMと同じ
• 配列をPaired-endで取得することが増えてきた
• 2本の配列が1本の配列に由来している
• 各readではなく，paired-end 1つで1個とカウントする．
• 利点：
• Paired-endの距離には目安がある（実験プロトコルに寄る
が，大体180-200bpを中心とする分布)ので，この距離から
誤ってmapされたものを発見し，取り除く事ができる．
• Alternative splicing の発現を求める方法も出ている
正規化
66

DESeq, EdgeR, Cuffdiff
• マイクロアレイの時同様，「発現が２倍以上の遺伝子」「半分
以下の遺伝子」等を求めたい．
• マイクロアレイと異なって，「タグ」が数えられる．
• 発現が100の遺伝子が200になるのは，必然性があるよう
に思えるが，発現が1の遺伝子が2になるのは，偶然の可能
性が高いかもしれない．
• 遺伝子の発現は，ランダムサンプリングとして統計的に定式
化できるだろう．
• ランダムにタグを取ってきたら，目的の遺伝子からのタ
グが取れる個数の分布を考える．
• Poisson分布に従うはず．
• Poisson分布は，平均＝分散
発現差異の同定
67

過分散 (Overdispersion)
• Poisson分布なら，得られた点は紫の線が中心になるまず
• 実際には，特に発現量の大きい遺伝子で，分散が大きい
• Poisson分布に分散を加えたモデル＝負の二項分布
(Negative Binomial Distribution) を利用
• p: 母比率，k: 観測回数，r: パラメータ
• r回失敗を許した時の，Poisson分布
NB(r, p) =
✓
k + r 1
k
◆
· (1 p)r
pk
pr
1 p
pr
(1 p)2平均分散
In Supporting text of
Anders S, Huber W. 2010. Differential expression analysis for
sequence count data. Genome Biology 11: R106. 68
Removed

その他
• マイクロアレイに比べての利点
• 費用は，恐らく同じくらいか，少し安いくらい
• 定量性は高いと考えられている
• Splicing variant を見ることが可能
• 非モデル生物でも利用可能
• 欠点
• 過去の蓄積が無いので，比較検討が難しい
• 解析に時間がかかる
• 今まで見えなかったものが見える．
• Splicing の問題，変異の問題，遺伝子領域以外の発現
• モデル生物で，単に発現が知りたい，かつ，周辺に設備が
整っているなら，現時点ではマイクロアレイの方がよいかも
• スプライシングが見たい，非モデル生物を扱いたい場合は，
RNA-seq
69

まとめ
70
Gene Ontology,
Pathway
Phenotype，
疾患
転写制御領域
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
観測対象

バイオインフォマティクスによる遺伝子発現解析

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