Histologie du Tube Digestif (Chapitre 2/3 de l'Histologie du l'appareil diges...
Chevaliez s virus hcv+marqueurs2014
1. Hépatite C
Virus & Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil
2. Hépatite C : virus et marqueurs
Virus de l’Hépatite C
• Découvert par Houghton en 1989
• 1ère cause d’hépatite chronique et de cirrhose en
Europe et en Amérique du Nord
• 1ère indication de transplantation hépatique dans les
pays industrialisés
Afdhal, NH. 2004; Sem Liv Dis, 24(Supp 2): 3-8.
3. Hépatite C : virus et marqueurs
Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
4. Hépatite C : virus et marqueurs
Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
• Tropisme : Hépatocyte
5. Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Structurale
Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
6. Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Structurale
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700; Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
7. Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Génomique des
Flaviviridae
0
1800
3600
5400
7200
9000
10800
C
E1
E2
NS2
NS3
NS4B NS5A
4A
5’UTR
p7
Hepatitis C virus
NS5B
3’UTR
Pestivirus
NS2
NS3
4A
E2
p7
C E0 E1
Npro
5’UTR
NS4B
NS5A
NS5B
3’UTR
5’UTR
Cap C
prM
Yellow fever virus
E
NS1
2A 2B
NS3
NS4A 4B
NS5
3’UTR
8. Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Génomique
Scheel TK, Rice CM. Nat Med. 2013;19(7):837-49.
9. Hépatite C : virus et marqueurs
Réseaux d’Interactions
Park et al, BMC Bioinformatics 2010, 11(Suppl 1): S23.
10. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine de Capside
Domaine d’interaction avec l’ARN viral
Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-11365.
Domaine d’interaction
avec LD
12. Hépatite C : virus et marqueurs
Capside et Lipides
Bartenschalger et al., Trends Microbiol 2011 Feb;19(2):95-103.
13. Hépatite C : virus et marqueurs
Interaction entre la Capside et DGAT-1
*Diacylglycérol diacyltransférase-1
Herker et al., Nat Med 2010, 16(11): 1295-1298.
14. Hépatite C : virus et marqueurs
Glycoprotéine E2
• Hétérodimère avec E1
• Régions hypervariables
– HVR1
– HVR2
– igVR
• Rôles
– HVR2 et igVR
indispensables au “folding“
E1-E2
– Étapes précoces
(interaction avec CD81,
peptide de fusion)
Krey et al., PLoS Pathog. 2010, 6(2): e1000762; McCaffrey et al., J Gen Virol 2011, 92: 112-121.
15. Hépatite C : virus et marqueurs
Étape Précoce : Entrée du VHC
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700.
16. Hépatite C : virus et marqueurs
HVR1
Région HVR1 (27 amino-acides)
80% de divergence nucléotidique entre génotypes
Epitope majeur de neutralisation
Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-4817.
17. Hépatite C : virus et marqueurs
Transmission du VHC
19. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine p7
• Viroporine dont la
structure 3D a été
récemment déterminée par
ME
• Rôle(s) in vivo ?
• Cible thérapeutique
potentielle
Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-68.
20. Hépatite C : virus et marqueurs
Rôle in vivo ?
Scheel TK, Rice CM. Nat Med. 2013;19(7):837-49.
21. Hépatite C : virus et marqueurs
Activité Antivirale du BIT225
• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV
• Activité synergique
Luscombe et al., Antiviral Res 2010 May;86(2):144-53.
22. Hépatite C : virus et marqueurs
Activité Antivirale in vivo
• Phase II
- Patients VHC
- Patients VIH (inhibiteur de Vpu)
- Patients coinfectés
• Activité antivirale chez les patients G1 naïfs de traitement
- 200 à 400 mg en combinaison avec SOC pendant 4
semaines suivi de la bithérapie pendant 44 semaines
- Réduction de l’ARN VHC
. S4 : -4 Log (400 mg) vs -3 Log (groupe contrôle)
. RVS : 100% (7/7) vs 75% (6/8)
Tanwandee et al., AASLD 2012.
23. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine NS2
• NS2 (région N-ter)
– Rôle dans l’organisation
de la formation des
nucléocapsides
• NS2pro (région C-ter)
Jirasko et al., PLoS pathog 2010 Dec 16;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-835.
24. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine NS3-4A
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.
25. Hépatite C : virus et marqueurs
Inhibition de la Production d’IFN par NS3
Rehermann B., J Clin Invest. 2009 Jul;119(7):1745-54.
26. Hépatite C : virus et marqueurs
Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAs
Lange et al., EMBO Mol Med. 2013 Sep 16.
27. Hépatite C : virus et marqueurs
Caractéristiques des IP
Lange & Zeuzem., J Hepatol 2011;55(3):692-701.
28. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéase NS3
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.
29. Hépatite C : virus et marqueurs
Telaprevir
Telaprevir Dosing
8
Patient 1018
6
4
LOD
2
0
1
Days
Log10 HCV RNA (IU/mL)
Log10 HCV RNA (IU/mL)
8
Telaprevir Dosing
14
HCV RNA (>100 IU/mL)
Wild type
T54A
V36A/M
Kieffer et al. Hepatology 2007;46:631-639.
Patient 1002
6
4
LOD
2
0
1
R155K/T
36/155
A156V/T
36/156
Days
14
30. Hépatite C : virus et marqueurs
Inhibiteurs de Protéase
Telaprevir
Approved
First generation
Boceprevir
Approved
First generation
Simeprevir
Approved*
Second wave
Faldaprevir (BI1335)
Phase 3
Second wave
Asunaprevir
Phase 3
Second wave
ABT450/r
Phase 2
Second wave
Sovaprevir
Clinical hold
Second wave
GS-9451
Phase 2
Second wave
IDX-320
Phase 2
Second wave
Vaniprevir
Phase 2
Second wave
Danoprevir
Phase 2
Second wave
MK-5172
Phase 2
Second generation
ACH-2684
Phase 2
Second generation
*In US
Pawlotsky JM., Seminars in Liver Diseases, in press.
31. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine NS5A
• Protéine essentielle à la formation des complexes
de réplication
• Phosphoprotéine régulée par PI4KIII alpha
(enzyme localisé au niveau du RE)
– P56 et p58 (forme hyperphosphoryléee)
• Formée de 3 domaines
• Cible d’inhibiteurs spécifiques
Reiss et al., PLoS Pathog. 2013 May;9(5):e1003359.
32. Hépatite C : virus et marqueurs
Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAs
Lange et al., EMBO Mol Med. 2013 Sep 16.
33. Hépatite C : virus et marqueurs
Caractéristiques des IP
Lange & Zeuzem., J Hepatol 2011;55(3):692-701.
34. Hépatite C : virus et marqueurs
Inhibiteurs de NS5A
Daclatasvir
Phase 3
First generation
Ledipasvir (GS-5885)
Phase 3
First generation
ABT-267
Phase 3
First generation
ACH-2928
Phase 2
First generation
PPI-668
Phase 2
First generation
GSK 2336805
Phase 2
First generation
BMS 824393
Phase 2
First generation
Samatasvir
Phase 2
First generation
MK-8742
Phase 2
Second generation
ACH-3102
Phase 2
Second generation
GS-5816
Phase 2
Second generation
Link et al,. J Med Chem. 2013 Dec 9; Degoey et al., J Med Chem. 2014 Jan 8; Pawlotsky et al., Seminars in Liver Disease, in press.
35. Nouvelles Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine NS5B: RdRp
Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999, 7: 14171426.
36. Hépatite C : virus et marqueurs
Réplication Virale
– Modèle du poliovirus
. Virus à ARN monocaténaire de
polarité positive
Réplication
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
37. Hépatite C : virus et marqueurs
Variabilité Génétique
• Erreurs au cours de la réplication
– Fréquentes
• 10-4-10-4 mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
Spontanées
– Au hasard
–
• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’
("proofreading")
– Accumulation de mutations
• A l’origine de :
– La diversification des types et des sous-types
– La distribution en quasi-espèces
38. Hépatite C : virus et marqueurs
Diversification des Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
39. Hépatite C : virus et marqueurs
Distribution des Génotypes
1a,
Adapted from Fang J., et al. J. Clin Liver Dis. 1997.
40. Hépatite C : virus et marqueurs
Distribution en Quasi-espèce
Domingo, E. Cell 1978, 13 (4):735-744.
Core protéine est formée de 2 domaines D1 et D2.
L’analyse HCA (hydrophobic cluster analysis) montre la présence de 2 clusters hydrophobes (2 et 4) et 3 clusters fortement basiques (1, 3 et 5) au niveau du domaine D1.
Le domaine D1 est capable d’interagir avec l’ARN viral, tandis que le domaine D2 hydrophobe permet l’association de la protéine de capside avec les gouttelettes lipidiques intracytoplasmiques
Core protein, lipid droplets, and nuclei are stained in red, green, and blue, respectively.
Rôle crucial des gouttelettes lipidiques dans la formation des nucléocapsides: plusieurs modèles sont proposés
1- Les gouttelettes lipidiques assurent le transport des protéines de capside des sites de réplication vers les sites d’assemblage
2- L’assemblage des nucléocapsides est initié à la surface des gouttelettes lipidiques
A ce jour aucun argument scientifique ne permet de trancher entre ces deux modèles.
DGAT-1 est une des deux enzymes qui catalyse l’étape finale de la biosynthèse des TG et sont donc essentiel dans la constitution des gouttelettes lipidiques. L’inhibition de de la DGAT-1 à l’aide d’un mécanisme d’interférence à l’ARN affecte sévèrement la production de virus infectieux dans des cellules d’hépatomes.
La structure de la protéine récemment proposée fait apparaître 3 domaines DI, DII et DIII avec au total 9 ponts disulfure indiqués par des barres noires.
Trois régions hypervariables sont présentes au niveau de E2: HVR1 et 2 et la région variable intergénotypique
Ces deux dernières ont été récemment montrées indispensables au bon repliement de E2 au sein de l’hérérodimère E1-E2 et donc importantes pour l’infectiosité des virions
P7 s’organise sous forme d’hexamères d’un PM de 42 kDa avec 2 domaines transmembranbaires
In vitro en culture cellulaire, a été montré jouer un rôle dans la sécrétion des néovirions
P7 est requis au virus pour se répliquer chez le chimpanzé.
De plus en plus d’études suggèrent que p7 pourrait avoir des fonction similaires à M2 des virus grippaux de type A, c'est-à-dire un rôle dans les étapes précoces au cours de l’entré virale ainsi qu’un rôle dans les tapes tardives au cours de la sécrétion des particules virales protégeant ainsi les Gp des pH acides même si cette deuxième hypothèse est discuté car Gp HCV sont relativement stable à pH acide et on ne sait pas si p7 fait parti de la particule virale.
BVDV: bovine viral diarrhea virus
CMA and CMC are two nucloeside analogues
BVDV: bovine viral diarrhea virus
NS2 est une cysteine-protéase de 217 aa qui comprend un domaine N-ter hydrophobe permettant de se lier aux membranes et un domaine C-ter globulaire avec un sous-domaine cytosolique protéasique.
Le domaine protéasique est capable de former des homodimères afin de former un site catalytique actif permettant d’assurer en cis le clivage NS2-NS3.
La topologie du domaine hydrophobe NS2 a été récemment déterminé par RMN (résonance magnétique nucléaire) et fait apparaître 3 segments transmembranaires (TMS1, 2 et 3). De plus, il a été démontré que la région N-ter de NS2 apparaît indispensable dans l’organisation de la formation des nucléocapsides, mécanisme complexe, qui semble étroitement associé aux gouttelettes lipidiques et qui en plus de la protéine de capside requiert d’autre partenaires tel que E1, E2, p7 et NS2.
NS2 est capable d’interagir avec de nombreux partenaires p7, E2, NS3 et plus modérément NS5A
La protéine NS3 comprend deux domaines, un domaine protéasique (serine protéase qui assure la plupart des clivages en trans puis en cis) et un domaine hélicase qui represénte 70% de la protéine NS3 avec 444 amino acides.
En rouge est représenté le domaine protéasique en présence de son cofacteur la potéine NS4A en violet et son substrat. Le site actif est constitué d’une triade catalytique (His-57, Asp-81, Ser-139).
En gris sur votre droite le domaine hélicase avec le site catalytique/NTP
Sur cette diapositive, les acides aminées participant à la poche hydrophobe responsable de l’interaction avec le substrat.
Comme vous le savez, la protéase NS3 est une des cibles majeur des antiviraux en développement, dont le boceprevir et le telaprevir qui bénéficient de l’AMM depuis septembre 2011.
Les principlaes substitutions amino acidiques impliqués dans la résistance à ces composés, il s’agit des positions 36, 41, 43, 54, 155, 168, 170 et 156 qui peuvent être présentes seules ou en association et qui confèrent des degrés variables de résistance.
2nd wave: better dosing, improved tolerability, broader genotype coverage
2nd generation: pan-genotype, high barrier to resistance