Chevaliez s hcv strat diag+suiv virol2014

Hépatite C
Stratégie Diagnostique & Suivi
Virologique
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil

Stratégie diagnostique & suivi virologique

Hepatitis C Worldwide
• 150 million people are chronically infected with
hepatitis C virus (HCV)
• 1st cause of cirrhosis and HCC in European
countries and in the US
• More than 350,000 deaths a year
• Curable disease by treatment
• Treatment is based on triple or dual therapy
according to HCV genotype


Marqueurs Virologiques
Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux

Marqueurs directs
Ag de capside (AgC)
ARN VHC
Génotype VHC
Profil de résistance


Tests Sérologiques
• Détection et quantification de l’antigène de capside
(AgC)
• Tests “Combo”
– Détection simultanée de l’AgC et des anticorps anti-VHC

• Détection of des anticorps anti-VHC par EIA de 3ème
génération
• TROD (test rapide d’orientation diagnostique)


Antigène de Capside : un Marqueur
de la Réplication
Genotype 1
Genotype 2
Genotype 3
Genotype 4
Genotype 5
Genotype 6

r=0.903; p<0.001

HCV RNA level in m2000 (Log IU/mL)
Chevaliez et al., submitted.

r=0.888; p<0.001

HCV RNA level in CAP/CTM v2.0 (Log IU/mL)


Antigène de Capside en Fonction des
Génotypes
5

4

3

2

1

0
Genotype 1
(n=162)

Chevaliez et al., submitted.

Genotype 2
(n=14)

Genotype 3
(n=29)

Genotype 4
(n=52)


Intérêts Cliniques de la Quantification de
l’AgC
• Diagnostic de l’infection
– Trousses commerciales
– Facile à utiliser, automatisé, peu coûteux (30% par
rapport à une charge virale VHC)

• Décision de traiter et suivi de l’efficacité des
traitements antiviraux
– Quantitatif
– Alternative aux techniques de détection-quantification
de l’ARN du VHC


Performances Analytiques de la Trousse
Architect (Abbott)
• Spécificité
– 99,2% à 100%

• Sensibilité
– 3 fmol/L (i.e ~ 500 to 3 000 UI/mL d’ARN VHC)
– Tous les génotypes (excepté génotype 2)

• Intervalle de quantification
– 3 à 20 000 fmol/L (≤ 7,8 Log10 UI/mL d’ARN VHC)

• Stable à 37°C pendant 96 heures
Ross et al., J Clin Micribiol 2010, 48(4): 1161-8; Mederacke et al., J Clin Virol 2009, 46(3): 210-5; Miedouge et al., J Clin Virol 2010, 48(1):18-21.


Trousse Architect : Monitorage des
Cinétiques Virales
RVR (G1b)

RVS (G1b)

Rechuteur (G1b)

Non-répondeur (G1a)

Core Ag
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8.

RNA


Performances de la Trousse Architect
chez Différentes Populations

Mederacke et al., J Clin Virol. 2012 Feb;53(2):110-5.


Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)
• Diagnostic de l’infection par le VHC
– Faciles à utiliser, automatisés
– Diminution de la fenêtre sérologique d’environ
20-30 jours
– Moins sensibles que les tests de 3ème génération
pour la détection des anticorps anti-VHC


Détection des Anticorps Anti-VHC
• Diagnostic de l’infection par le VHC
– Faciles à utiliser, automatisées
– A l’aide d’un test de 3ème génération
. ADVIA Centaur (Siemens)
. VITROS ECi (Ortho-Clinical Diagnostic)
. AXSYM HCV 3.0 (Abbott)
. Cobas Elecsys Modular HCV (Roche)
. INNOTEST HCV Ab IV (Innogenetics)
. Monolisa anti-HCV Plus version 2 (Bio-Rad)


Tests rapides Disposant d’un Marquage
CE/IVD pour la Détection des Ab anti-VHC
Oraquick HCV

Toyo HCV

Labmen HCV

Orasure (USA)
Meridian
Bioscience Eur.

Turklab (Turquie)
Nephrotek

Turklab (Turquie)
Nephrotek

Liq. craviculaire,
Sang total, sérum,
plasma

Sang total, sérum,
plasma

Sang total, sérum,
plasma

Technologie

IC

Flux latéral

Flux latéral

Délai lecture
résultat

20-40 min

15 min

15 min

15 €

6,4 €

€

Fabricant
Distrib. France
Matrices

PU catalogue HT


Performances des Tests rapides pour la
Détection des Ab anti-VHC
Spécificité
(IC95%)

Sensibilité
(IC95%)

VPP

VPN

OraQuick® HCV
Rapid Ab Test

100%
(97,9-100,0)

99,4%
(97,7-99,9)

100%

98,4%

TOYO® anti-HCV
test

98,2%
(94,8-99,4)

96,2%
(93,3-98,0)

99,0%

93,1%

Labmen® HCV
test

100%
(94,4-100,0)

62,7%
(54,8-69,5)

100%

49,6%

100%
(97,9-100,0)

98,2%
(95,9-99,1)

100%

96,6%

Sang total capillaire

Liquide craviculaire
OraQuick® HCV
Rapid Ab Test
Chevaliez S, et al., article soumis.


Tests Virologiques Moléculaires
Tests Qualitatifs-Quantitatifs
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?

Détermination
du Génotype
Quel est le génotype du VHC ?

Détection de la résistance

Quel type de VHC est présent ?


Clinical Utility of HCV RNA Assays in the
Era of DAAs
- Make appropriate decisions
. Shorten or extend treatment duration
. Stop treatment due to futility

Identify treatment failure and the emergence
of resistance
. Virological failure is associated with selection of viral
variants with reduced susceptibility to DAAs


New Response Categories at the
Protease Inhibitor Era
Rx response
terms

Definition

vRVR

HCV RNA undetectable at week 2 of therapy

RVR

HCV RNA undetectable at week 4 of DAA therapy

W4UTND
LI4W-W8UTND

eRVR

HCV RNA undetectable at week 4 and through week
12 of therapy

W4U-12UTND

SVR12

HCV RNA undetectable 12 weeks after treatment
cessation

SVR12TND

SVR24

HCV RNA undetectable 24 weeks after treatment
cessation

SVR24TND

Wedemeyer et al., Hepatology 2012, 56(6):2398-403; Jacobson et al., J Viral Hepat. 2012,19(4):236-43.

New
nomenclature
W2UTND


Higher Rates of SVR in Patients Achieving
an eRVR or an RVR

SVR (%)

ADVANCE

Jacobson et al., N Engl J Med. 2011, 364:2405-2416; Poordad et al., N Engl J Med. 2011, 364:1195-1206.

SPRINT-2


Concordance Between SVR24 and SVR12
(or SVR4)
• More than 13,000 adults considered (86.2% genotype 1)
• From 15 Phase II and III studies (pegIFN, AlbIFN, BOC, TVR)
SVR24

(%)

Not
Detected
detected
SVR12
(G1)
SVR4
(G1)

Not
detected

5428

93

Detected

56
4239

412

Detected

53

3002

NPV

Se

Sp

98.3

98.8

99.0

98.0

91.1

98.3

98.8

87.9

4617

Not
detected

PPV

Chen et al., Gastroenterology 2013 Jun;144(7):1450-1455.e2.


Requirements for HCV RNA Assays
• Real-time-based assays with
– A low lower limit of detection
– A broader range of linear quantification
– Identical lower limits of detection (LLOD) and
quantification (LLOQ)

• Satisfactory analytical performance, regardless
of the HCV genotype


Available HCV RNA Assays
• Qualitative assays
– Target amplification methods
. PCR (Polymerase Chain Reaction)
. TMA (Transcription-Mediated Amplification)

• Quantitative assays
– Signal amplification method
. bDNA (branched DNA)

– Target amplification methods
. Real-time PCR
. Real-time TMA


Intervalles de Quantification
10

102

103

Cobas Amplicor
HCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNA
Assay
Versant HCV RNA
3.0 (bDNA)
CTM HCV test v2.0
(Roche)
CAP/CTM HCV test,
v2.0 (Roche)
RealTime™ HCV
(Abbott)
Artus HCV QS-RGQ
(Qiagen)
Versant HCV RNA
1.0 (kPCR, Siemens)
Chevaliez et al., Gastroenterology 2012 May;142(6):1303-1313.

104

105

106

107

108


LLOD or LLOQ: Which One Make Use Of?
HCV Treatment
HCV RNA level (Log10 IU/mL)

7
6
8

Detectable/
quantifiable

5

6

4

4
3
2
2
Detectable/not quantifiable

1

1
0

Undetectable

0

LLOQ
LLOD

Time
SVR

Harrington et al., Hepatology. 2012 Apr;55(4):1048-57.


SVR Rates According to HCV RNA Status
SPRINT-2
BOC/PR RGT

ADVANCE
(T12PR)
100

80

SVR (%)

100

80

60

60

40

40

20

20

0

4

6

8

10

12

Week
Harrington et al., Hepatology. 2012 Apr;55(4):1048-57.

16

20

0

4

Undetectable
Detectable/Below LLOQ
Above LLOQ (> 25 IU/mL)

8

10

Week

12

16

20


Avantages Techniques de la PCR (TMA) en
Temps Réel
- Diminution du risque de contamination
- Amélioration de la sensibilité
- Augmentation de l’intervalle de quantification
linéaire
- Amélioration précision et reproductibilité
- Augmentation de débit à travers l’automatisation


Plates-formes de PCR en Temps Réel
CAP-CTM96 (ROCHE)

kPCR (SIEMENS)
m2000SP-m2000RT (ABBOTT)


8

Difference between
CAP/CTM v1.0 and bDNA (Log10 IUI/mL)

HCV RNA level in CAP/CTM v1.0 (Log10 IU/mL)

HCV RNA Quantification
(CAP/CTM v1.0, Roche)
7

6

5

4

3

+1.5
+1.11

+1.0
+0.5

+0.48

0.0

-0.15

-0.5
-1.0
-1.5

3

4

5

6

7

8

3

HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA
(Log10 IU/mL)

5

6

7

Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and
bDNA (Log10IU/mL)
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)

Adapted from Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-31.

4

Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)

8


Mean titer (Log10 Cp/mL)

HCV RNA levels (Log10 IU/mL)

Effect of nucleotide Substitution on HCV
Genotype 4 RNA Quantification

WT G4 or WT G1
A165T or G145A
G145A+A165T
G145A+A165T±A142G
Chevaliez et al., Hepatology 2009, 50(5): 1681; Vermehren et al., 2011; J Clin Microbiol, 49(9): 3309-3315.


8

+1.5
Difference between
CAP/CTM v1.0 and bDNA (Log10 IUI/mL)

HCV RNA level in CAP/CTM v2.0 (Log10 IU/mL)

Genotype 4 HCV RNA Quantification
7

6

5

4

3

+1.0
+0.62

+0.5

+0.35
+0.08

0.0
-0.5
-1.0
-1.5

3

4

5

6

7

8

3

(Log10 IU/mL)

5

6

7

bDNA (Log10IU/mL)
Genotype 4 (n=122)

Chevaliez et al. J Clin Microbiol. 2013, 51(4):1078-82.

4

8



(Log10 IU/mL)

Zitzer et al., J. Clin. Microbiol. 2013;51:571-577.

bDNA (Log10IU/mL)


(m2000, Abbott)
+1.5
Difference between
m2000 and bDNA (Log10 IUI/mL)

HCV RNA level in m2000 (Log10 IU/mL)

8

7

6

5

4

+1.0
+0.58

+0.5

+0.26
0.0

-0.06

-0.5
-1.0

3

3

4

5

6

7

(Log10 IU/mL)

8

-1.5
3

5

6

7

Mean of HCV RNA levels in m2000 and bDNA
(Log10IU/mL)
Genotype 1 (n=55)

Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.

4

Genotype 2 (n=21)
Genotype 3 (n=29)

Genotype 4 (n=24)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=3)

8


kPCR (Siemens)

QS-RGQ (Qiagen)

Hang et al., ECCMID London, April 2012; Drexler et al., J Clin Microbiol 2012 Jun;50(6):2114-7.


HCV RNA Level Assessment in Practice
• HCV RNA quantification should be regularly assessed
before, during and after treatment
• HCV RNA quantification should be based on a realtime PCR (or TMA) assay
– With results expressed in IU/mL
– With identical LLOD and LLOQ, of the order of 10-15 IU/mL

• In a given patient, HCV RNA level monitoring must
be performed with the same real-time assay


Europe or FDA Approval for HCV RNA
Quantification Tests
• Only 2 tests are approved by the FDA and in
Europe for HCV RNA quantification in clinical
practice
– m2000 since May 2011
– New version of CAP/CTM since March 2013


Génotypes du VHC

Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.


Répartition des Génotypes

1a,

Adapted from Fang J., et al. J. Clin Liver Dis., 1997.


Répartition des Génotypes en France

Brouard et al., EASL 2009, Abstract actualisé 167.


Détermination du Génotype
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique

• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.


Détermination du Génotype
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique

• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 14613; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.


Analyse Phylogénique après Séquençage
Direct

NS5B

Région
(286 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
43

Génotype 1

0.05

Génotype 6
Génotype 5

1mGUI24
1mGUI11
1mGUI17
1dBA107
1dHC1N16
1dFR17
99 Patient 26
Patient 52
59
Patient 60
Génotype 1, sous-type i
98 Patient 48
96
1iQC181
1iQC77
1iFR16
Patient 40
1bHCP01
34
Génotype 1, sous-type b
1bHCVBK
100
1bHCJ4
Patient 7
Patient 8
Patient 17
Patient 18
Patient 36
Patient 16
Génotype 1, sous-type ?
Patient 64
100
Patient 28
Patient 2
Patient 54
72
Patient 46
Patient 59
1fFR2
1l98CM1457
1l98CM1427
1lM5186N
1gEG024
1g2152
1g1382
1eQC172
1eCAM1078
1eM4541N
1kQC82
1kQC68
1jQC89
1jQC2
1aHCJ1
1aHCVH
1aHCV1
1cKhaja1
1cSR031
1cHCG9
1h98CM1521
1h98CM1357
Génotype 4
1hFrSSD98
4aED43
Génotype 3
100
Patient 62
Génotype 3,
3aNLZ1
6aEUHK2
Génotype 2
Patient 49
Génotype 2
2aHCJ6
5aSA13

sous-type a


Versant® HCV Genotype 2.0 Assay
(INNO-LiPA)


Intérêt de la Détermination du Sous-Type
(1a vs 1b) ?
- Modeste différence d’efficacité de la
trithérapie
- Profils de résistance différents en cas d’échec
de la trithérapie
- Pas d’influence sur la décision thérapeutique


Intérêt du Sous-Type dans la Résistance
au Telaprevir
Subtype 1b

Subtype 1a

Substitutions in patients who failed to achieve an SVR


Impact du Sous-Type sur la Barrière
Génétique à la Résistance
HCV-1a prototype ...PAGHAVGIFFRAAVCTRGVAKAVDFIP...
HCV-1b prototype ... S
V ...

- ------------------------ -

HCV-1a

AGAAAA
AGAACA

(R155K)
(R155T)

HCV-1b

CGAAAA
CGAACA

(R155K)
(R155T)


Intérêt de la Détermination du Sous-Type
(1a vs 1b) ?
- OUI
. Dans les essais cliniques afin de correctement
stratifier l’efficacité des DAAs et d’interpréter les
profils de résistance

- NON (OUI avec le Simeprevir)
. En pratique clinique car le sous-type n’a pas
d’influence sur la décision thérapeutique avec les
IP de 1ère génération


Résumé
• Détermination du génotype (sous-type)
VHC
– La détermination du génotype sur la seule
région 5’NC doit être proscrite
– La 2nde génération de Line Probe Assay qui utilise
des sondes dirigées contre la région core en
plus de la région 5’NC est la meilleure méthode
permettant de distinguer les sous-types 1a et
1b

EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.


Intérêts des Tests Virologiques en
Thérapeutique
• Décision de traiter
• Optimisation du schéma thérapeutique
• Etude de la réponse virologique au
traitement


Le Génotype du VHC Détermine l’Approche
du Traitement VHC
• Génotypes 2/3, 4, (5/6)
– Options thérapeutiques disponibles en 2014
. IFN pégylé plus ribavirine plus sofosbuvir 12 sem (Sovaldi®)
. Sofosbuvir plus ribavirine 12 sem (génotype 2)
. Sofosbuvir plus ribavirine 24 sem (génotype 3)

• Génotype 1
– Options thérapeutiques possibles en 2014
. IFN pégylé plus ribavirine plus IP 1st gen 1st vague (boceprevir ou
telaprevir)
. IFN pégylé plus ribavirine plus IP 1st gen, 2nd vague (simeprevir)
. IFN pégylé plus ribavirine plus sofosbuvir 12 sem (Sovaldi®)


Monitoring of Treatment Responses

BOC/PR
TVR/PR
PR
S4 S8 S12

S24

S36

S48

S72

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