1. Hépatite C
Virus & Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil
2. Découverte du Virus de l’Hépatite C
From New England Journal of Medicine, 1975
Hépatite C : Virus et Marqueurs
3. Identification du Virus de l’Hépatite C
From Science 21 April 1989
Hépatite C : Virus et Marqueurs
4. The Global Burden of HCV Infection
• Approximately 170 million people are chronically
infected with HCV
• HCV is responsible for >350,000 deaths per year
worldwide
- 60,000 in Europe
- >7,500 in the US
• Up to 85% of HCV-infected patients are unaware of
their status
- 50.3% in the US
- 42.6% in France (i.e., 100,000 persons)
• Less than 10% of the HCV-infected population has
received treatment in the US
Hépatite C : Virus et Marqueurs
5. SVR Rates in the Past 25 Years
Heim M. Nat Rev Immunol 2013;13(7):535-42.
Hépatite C : Structure et Virologie Moléculaire
2014-2015
8. Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
9. • Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
• Tropisme : Hépatocyte
Virus de l’Hépatite C
Hépatite C : virus et marqueurs
10. Identification d’Homologues du VHC chez
les Non Primates
Kapoor et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108(28):11608-13; Kapoor et al., Mbio 2013;4(2):e00216-13.
Phylogénie de la région codant RdRp (7711-8550 HCV g1a)
CHV: canine hepacivirus
RHV: rodent hepacivirus
Hépatite C : Virus et Marqueurs
12. Les Différents Modèles d’Etude in vitro
• cDNA développés en 1997
• Réplicons subgénomiques (1999)
• Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp) (2003)
• Système de culture permettant le production
de particules virales infectieuses (HCVcc)
(2005)
Hépatite C : Virus et Marqueurs
16. Densité des Particules Circulantes
Lindenbach BD. Curr Top Microbiol Immunol 2013;369:199-218.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
17. The “Lipidome“ of HCVcc Particles
Merz et al., J Biol Chem 2011;286(4):3018-32.
LPC: lysophosphotidylserine
CE: cholestery ester
Chol: cholesterol
PI: phosphatidylinositol
PS: phosphatidylserine
PE: phosphatidylethanolamine
SM: shingomyelin
PC: phospahtidylcholine
PG: phosphatidylglycerol
Total lipid profile Phospholipid profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
18. Organisation Structurale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700; Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
19. Organisation Génomique des
Flaviviridae
Hépatite C : Virus et Marqueurs
0 1800 3600 5400 7200 9000 10800
C
4A
p7
NS5BNS5ANS4BNS3NS2E2E1
5’UTR 3’UTR
Hepatitis C virus
Npro
C E1 E2E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B
4A
p7
5’UTR 3’UTR
Pestivirus
C
prM
E NS1 2A 2B NS3 NS5NS4A 4BCap
5’UTR 3’UTR
Yellow fever virus
21. Structure de l’IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
“Pseudoknot domain“
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.
22. Crystal Structure of the Full HCV IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.
23. MicroRNA (miR)-122 et Infection VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Expression abondante et spécifique du
foie
• Interaction avec la région 5’NC du génome
viral
– 2 sites au niveau du domaine I
• Favorise la stabilité de l’ARNm viral
24. miR-122 : Cible Thérapeutique ?
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Janssen et al., N Engl J Med. 2013;368(18):1685-94.
25. Efficacité Antivirale du Miravirsen
Janssen et al., N Engl J Med 2013;368(18):1685-94.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
26. Pros & Cons des Antagonistes de miR-122
• Activité pangénotypique
• Barrière à la résistance élevée (HTA)
• Administration parentérale
• Faible taux de miR-122 dans les hépatocytes a
été associé au développement d’HCC
Tsai et al., J Clin Invest 2012;122(8):2884-97; Wilson et al., Curr Opin Virol 2014;7C:11-18.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
30. Protéine de Capside
• Forme mature formée de ~177 amino
acides (21-kDa)
• Capacité de lier les lipides et l’ARN
• Structure tridimensionnelle non résolue
– Conformation en hélices alpha (~ 50%)
– Constituée de 2 domaines (D1 & D2)
Hépatite C : Virus et Marqueurs
31. Protéine de Capside
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-11365.
Domaine d’interaction avec l’ARN viral Domaine d’interaction
avec LD
32. Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC G1b
33. Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II
– Hétérodimères avec E1
Hépatite C : Virus et Marqueurs
34. Kong et al,Science. 2013 Nov 29;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Topologie de la Protéine E2 : Domaine “Ig-like“
35. Structure de E2
Purple and red: Ig ß sandwich
Blue: CD81 receptor binding loop
Kong et al,Science 2013;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
36. Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II
– Hétérodimères avec E1
• Interaction avec récepteurs membranaires
– CD81
– SRB-I
Hépatite C : Virus et Marqueurs
37. Étape Précoce : Entrée du VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700.
38. E2 : Trois Domaines Variables
• E2 contient 3 domaines très variables
– HVR1
– VR2
– VR3
• Délétion HVR1 est non létale mais
augmente la sensibilité du virus aux
anticorps neutralisants
Hépatite C : Virus et Marqueurs
40. HVR1
Région HVR1 (27 amino-acides)
80% de divergence nucléotidique entre génotypes
Epitope majeur de neutralisation
Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-4817.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
43. Protéine p7
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Viroporine dont la
structure 3D a été
récemment déterminée par
ME
• Rôle(s) in vivo ?
• Cible thérapeutique
potentielle
Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-68.
44. Rôle in vivo ?
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Scheel TK, Rice CM. Nat Med 2013;19(7):837-49.
45. Activité Antivirale du BIT225
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV
• Activité synergique
Luscombe et al., Antiviral Res 2010;86(2):144-53.
46. Activité Antivirale in vivo
• Phase II
- Patients VHC (G1a, G1b, G3)
- Patients VIH (inhibiteur de Vpu)
- Patients coinfectés
• Activité antivirale chez les patients G1 naïfs de
traitement
- 200 à 400 mg en combinaison avec SOC pendant 4
semaines suivi de la bithérapie pendant 44
semaines
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
47. Taux de Réponses Virologiques
• Futurs développements
– Génotypes 1 & 3
– 3 mois de traitement en association à pegIFN/RBV
– Evaluation de l’efficacité en association à d’autres
DAA
Treatment EVR (%) SVR % (n/N)
200 mg BIT225+ pegIFN/RBV 88 88
400 mg BIT225+ pegIFN/RBV 86 100 (7/7)
pegIFN/RBV 63 75 (6/8)
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Structure et Virologie Moléculaire
48. Protéine NS2
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• NS2 (région N-ter)
– Rôle dans l’organisation
de la formation des
nucléocapsides
• NS2pro
(région C-ter)
Jirasko et al., PLoS pathog 2010;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-835.
50. Inhibition de la Production d’IFN par NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Rehermann B., J Clin Invest 2009;119(7):1745-54.
51. Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAs
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lange et al., EMBO Mol Med 2014;6(1):4-15.
52. Protéase NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.
53. Telaprevir
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Kieffer et al. Hepatology 2007;46:631-639.
Telaprevir Dosing Telaprevir Dosing
0
2
4
6
8
0
2
4
6
8
Log10HCVRNA(IU/mL)
Log10HCVRNA(IU/mL)
HCV RNA (>100 IU/mL)
Wild type
T54A
V36A/M
R155K/T
36/155
A156V/T
36/156
Days Days
Patient 1002Patient 1018
LODLOD
1 14 1 14
54. Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
Caractéristiques des IP
DAA
PI 1st
generation
PI 2nd
generation
NS5A Inh. 1s
t
generation
NS5A Inh. 2nd
generation
NS5B
nucleos(t)ide
inh.
NS5B non
nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance
profile
Pangenotypi
c efficacy
Adverse
events
Drug-drug
interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
55. Telaprevir Approved First generation
Boceprevir Approved First generation
Simeprevir Approved Second wave
Faldaprevir (BI1335) Phase 3 Second wave
Asunaprevir Phase 3 Second wave
ABT450/r Phase 3 Second wave
Sovaprevir Clinical hold Second wave
Vedroprevir Phase 2 Second wave
IDX-320 Phase 2 Second wave
Vaniprevir Phase 3 (Japan) Second wave
Danoprevir Phase 2 Second wave
MK-5172 Phase 3 Second generation
ACH-2684 Phase 2 Second generation
Inhibiteurs de Protéase
Pawlotsky JM., Gastroenterology 2014;146(5):1176-92.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
56. • Protéine essentielle à la formation des complexes
de réplication
• Phosphoprotéine régulée par PI4KIII alpha
(enzyme localisé au niveau du RE)
– P56 et p58 (forme hyperphosphoryléee)
• Formée de 3 domaines
• Cible d’inhibiteurs spécifiques
Protéine NS5A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Reiss et al., PLoS Pathog. 2013 May;9(5):e1003359.
57. Protéine NS5A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
RNA binding
groove
Tellinghuisen et al., Nature 2005;435(7040):374-9.
58. Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAs
Hépatite C : virus et marqueurs
Lange et al., EMBO Mol Med 2014;6(1):4-15.
59. Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
Caractéristiques des anti-NS5A
DAA
PI 1st
generation
PI 2nd
generation
NS5A Inh. 1s
t
generation
NS5A Inh. 2nd
generation
NS5B
nucleos(t)ide
inh.
NS5B non
nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance
profile
Pangenotypi
c efficacy
Adverse
events
Drug-drug
interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
60. Daclatasvir Phase 3 First generation
Ledipasvir (GS-5885) Phase 3 First generation
Ombitasvir (ABT-267) Phase 3 First generation
ACH-2928 Phase 2 First generation
PPI-668 Phase 2 First generation
GSK 2336805 Phase 2 First generation
BMS 824393 Phase 2 First generation
Samatasvir Phase 2 First generation
AD4025 Phase 1b ?
MK-8742 Phase 2 Second generation
ACH-3102 Phase 2 Second generation
GS-5816 Phase 2 Second generation
Inhibiteurs de NS5A
Link et al,. J Med Chem. 2014;57(5):2033-46; Degoey et al., J Med Chem 2014;57(5):2047-57; Ivachtchenko et al., J Med Chem 2014 Sep 9.
Pawlotsky JM., Gastroenterology 2014;146(5):1176-92.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
61. Mécanismes d’Action des anti-NS5A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Eyre NS, Beard MR.
Gastroenterology.
2014;147(5):959-62.
62. Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999,
7: 1417-1426.
Protéine NS5B: RdRp
Hépatite C : Virus et Marqueurs
63. Réplication
– Modèle du poliovirus
. Virus à ARN monocaténaire de
polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery 2007; 6: 1001-18.
Réplication Virale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
64. Variabilité Génétique
• Erreurs au cours de la réplication
– Fréquentes
. 10
-4
-10
-5
mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées
– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’
("proofreading")
– Accumulation de mutations
• A l’origine de :
– La diversification des types et des sous-types
– La distribution en quasi-espèces
Hépatite C : Virus et Marqueurs
69. Quasi-espèces
• Décrites pour la première fois en 1978 par
Domingo et coll
– Bactériophage Qβ
• Evolution Darwinienne
– Génération de mutants compétition
avantages aux variants les plus “fit“
Domingo et al., Cell 1978;13(4):735-44; Domingo et al., Microbiol Mol Biol Rev 2012;76(2):159-216.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
70. “Last but not Least“
Hépatite C : Virus et Marqueurs
71. Consequence of Genetic Bottleneck
Domingo et al., Microbiol Mol Biol Rev 2012;76(2):159-216.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
73. Caractéristiques des anti-NS5B
Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.
DAA
PI 1st
generation
PI 2nd
generation
NS5A Inh. 1s
t
generation
NS5A Inh. 2nd
generation
NS5B
nucleos(t)ide
inh.
NS5B non
nucleos(t)ide
inh.
Efficacy
Resistance
profile
Pangenotypi
c efficacy
Adverse
events
Drug-drug
interaction
Good profile Average profile least favorable profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
74. Sofosbuvir Approved Nuc
VX-135 Partial clinical hold Nuc
Deleobuvir Phase 2 NNuc
BMS-791325 Phase 2 NNuc
TMC-647055 Phase 2 NNuc
Lomibuvir Phase 2 NNuc
GS-9669 Phase 2 NNuc
ABT-333 Phase 3 NNuc
ABT-072 Phase 2 NNuc
Setrobuvir Phase 2 NNuc
Inhibiteurs de NS5B
Pawlotsky et al., Seminars in Liver Disease, in press.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
79. Cycle Viral
deLemos & Chung., Trends Mol Med 2014;20(6):315-21.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
80. HCV Entry
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
81. Réplication du VHC
• Mécanismes moléculaires encore mal
connus
• Localisation cytoplasmique au sein de
complexes de réplication (membranous
web)
– NS4B, NS5A, NS34A et NS5B (RdRp)
– Association étroite avec des facteurs cellulaires
Hépatite C : Virus et Marqueurs
83. Modèle de Réplication du VHC
• Selon modèle des virus à ARN ss polarité
positive (exemple du PV)
Ding., Nature Reviews Immunolog, 2010; 10: 632-644.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
84. Assemblage & Sécrétion du VHC
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
85.
86. Hépatite C
Stratégie Diagnostique & Suivi
Virologique
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil
87. Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
Ag de capside (AgC)
ARN VHC
Génotype VHC
Profil de résistance
Marqueurs Virologiques
Stratégie diagnostique & suivi virologique
88. Tests Sérologiques
• Détection of des anticorps anti-VHC par EIA de 3ème
génération
• Tests “Combo”
– Détection simultanée de l’AgC et des anticorps anti-VHC
• TROD (test rapide d’orientation diagnostique)
• Détection et quantification de l’antigène de capside
(AgC)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
89. Détection des Anticorps Anti-VHC
• Diagnostic de l’infection par le VHC
– Trousses commerciales
– Faciles à utiliser, automatisées
– A l’aide d’un test de 3ème
génération
. ADVIA Centaur (Siemens)
. VITROS ECi (Ortho-Clinical Diagnostic)
. AXSYM HCV 3.0 (Abbott)
. Cobas Elecsys Modular HCV (Roche)
. INNOTEST HCV Ab IV (Innogenetics)
. Monolisa anti-HCV Plus version 2 (Bio-Rad)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
90. Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)
• Diagnostic de l’infection par le VHC
– Trousses commerciales (2 trousues disponibles)
– Faciles à utiliser
– Non automatisées
– Diminution de la fenêtre sérologique d’environ
20-30 jours
– Moins sensibles que les tests de 3ème
génération
pour la détection des anticorps anti-VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique
91. Tests rapides Disposant d’un Marquage CE/IVD
ou OMS pour la Détection des Ab anti-VHC
Oraquick
®
HCV
Toyo®
HCV
Labmen®
HCV
Multisure
HCV
Signal
HCV v2.0
HCV
TriDot 4th
Manufacturer Orasure Turklab Turklab
MP
Diagnostics
Span
Diagnostics
J Mitra & Co
Specimen
type
oral fluid,
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
serum,
plasma
serum,
plasma
Volume
required (µL)
40 (oral fluid)
20
30 10 25 100
One drop
(35 µL)
Time to read
(min)
20 15 15 15 10 3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
92. Tests rapides “en cours de Marquage CE/IVD“
pour la Détection des Ab anti-VHC
Assure®
HCV
First Response®
HCV
Manufacturer MP Diagnostics
Premier Medical
Corporation Ltd
Specimen type
whole blood,
serum, plasma
whole blood,
serum, plasma
Volume required (µL) 50 One drop (35 µL)
Time to read (min) 15 20
Stratégie diagnostique & suivi virologique
93. Performances des Tests rapides pour la
Détection des Ab anti-VHC
Spécificité Sensibilité VPP VPN
Sang total capillaire
OraQuick® HCV
Rapid Ab Test
100% 99,4% 100% 98,4%
TOYO® anti-HCV test 98,2% 96,2% 99,0% 93,1%
Labmen® HCV test 100% 62,7% 100% 49,6%
Liquide craviculaire
OraQuick® HCV
Rapid Ab Test
100% 98,2% 100% 96,6%
Chevaliez S, et al., article soumis.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
94. Performances des Tests rapides pour la
Détection des Ab anti-VHC
Spécificité Sensibilité VPP VPN
Sang total veineux
OraQuick® HCV
Rapid Ab Test
100 98,7 100 98,1
Assure® anti-HCV 100 94,9 100 93,0
First Response HCV 100 96,2 100 94,6
Multisure HCV 100 96,2 100 94,6
Chevaliez S, et al., unpublished results.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
96. Antigène de Capside en Fonction des
Génotypes
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
97. Quantification de l’AgC à partir de Sang
Total Déposé sur DBS
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0 2 4 6
0
2
4
6
Core antigen level in serum with
the Architect HCV Ag assay (Log fmol/L)
CoreantigenlevelinwholebloodfromDBS
withtheArchitectHCVAgassay(Logfmol/L)
r=0.56; p<0.0001
0 1 2 3 4
0
1
2
3
4
Mean of HCV core antigen level in serum
and whole blood from DBS (Log fmol/L)
Diffrencebetweenserumand
wholebloodfromDBS(Logfmol/L)
2.46
1.66
3.26
0 2 4 6
0
2
4
6
Core antigen level in serum with
the Architect HCV Ag assay (Log fmol/L)
CoreantigenlevelinwholebloodfromDBS
withtheArchitectHCVAgassay(Logfmol/L)
r=0.56; p<0.0001
0 1 2 3 4
0
1
2
3
4
Mean of HCV core antigen level in serum
and whole blood from DBS (Log fmol/L)
Diffrencebetweenserumand
wholebloodfromDBS(Logfmol/L)
2.46
1.66
3.26
98. Quantification de l’AgC à partir de Sang
Total Déposé sur DBS
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNA level in whole blood
from DBS with m2000 (Log IU/mL)
HCVcoreAglevelinwholeblood
fromDBS(Logfmol/L)
r=0.65; p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCVcoreAglevelinwholeblood
fromDBS(Logfmol/L)
HCV RNA level in whole blood
from DBS with CAP/CTM96 v2.0 (Log IU/mL)
r=0.66; p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNA level in whole blood
from DBS with m2000 (Log IU/mL)
HCVcoreAglevelinwholeblood
fromDBS(Logfmol/L)
r=0.65; p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCVcoreAglevelinwholeblood
fromDBS(Logfmol/L)
HCV RNA level in whole blood
from DBS with CAP/CTM96 v2.0 (Log IU/mL)
r=0.66; p<0.0001
99. Intérêts Cliniques de la Quantification de
l’AgC
• Diagnostic de l’infection
– Trousses commerciales
– Facile à utiliser, automatisé, peu coûteux (30% par
rapport à une charge virale VHC)
• Décision de traiter et suivi de l’efficacité des
traitements antiviraux
– Quantitatif
– Alternative aux techniques de détection-quantification
de l’ARN du VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique
100. Performances Analytiques de la Trousse
Architect (Abbott)
• Spécificité
– 99,2% à 100%
• Sensibilité
– 3 fmol/L (i.e ~ 500 to 3 000 UI/mL d’ARN VHC)
– Tous les génotypes (excepté génotype 2)
• Intervalle de quantification
– 3 à 20 000 fmol/L (≤ 7,8 Log10 UI/mL d’ARN VHC)
• Stable à 37°C pendant 96 heures
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8; Mederacke et al., J Clin Virol 2009, 46(3): 210-5; Miedouge et al., J Clin Virol 2010, 48(1):18-21.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
101. Trousse Architect : Monitorage des
Cinétiques Virales
RVR (G1b) RVS (G1b)
Rechuteur (G1b) Non-répondeur (G1a)
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8.
Core Ag
RNA
Stratégie diagnostique & suivi virologique
102. Performances de la Trousse Architect
chez Différentes Populations
Mederacke et al., J Clin Virol. 2012 Feb;53(2):110-5.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
103. Tests Moléculaires
Détermination
du Génotype
Quel est le génotype du VHC ?
Détection de la résistanceDétection de la résistance
Quel type de VHC est présent ?
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Tests Qualitatifs-Quantitatifs
Stratégie diagnostique & suivi virologique
104. - Identify active viral replication
- Make appropriate decisions
. Shorten or extend treatment duration
. Stop treatment due to futility
Identify treatment failure and the emergence
of resistance
. Virological failure is associated with selection of viral
variants with reduced susceptibility to DAAs
Clinical Utility of HCV RNA Assays
Stratégie diagnostique & suivi virologique
105. Requirements for HCV RNA Assays
• Real-time-based assays with
– A low lower limit of detection
– A broader range of linear quantification
– Identical lower limits of detection (LLOD) and
quantification (LLOQ)
• Satisfactory analytical performance, regardless
of the HCV genotype
Stratégie diagnostique & suivi virologique
111. HCV RNA Level Assessment in the Era of DAA
• HCV RNA quantification should be regularly assessed
before, during and after treatment
• HCV RNA quantification should be based on a real-
time PCR (or TMA) assay
– With results expressed in IU/mL
– With identical LLOD and LLOQ, of the order of 10-15 IU/mL
• In a given patient, HCV RNA level monitoring must
be performed with the same real-time assay
Stratégie diagnostique & suivi virologique
112. Europe or FDA Approval for HCV RNA
Quantification Tests
• Only 2 tests are approved by the FDA and in
Europe for HCV RNA quantification in clinical
practice
– m2000 since May 2011
– New version of CAP/CTM since March 2013
Stratégie diagnostique & suivi virologique
113. Monitorage de l’Efficacité des
Traitements avec DAA
Avant
traitement
Au cours du traitement Après
traitementFin de traitement
S2 S4 S10 S12 S24 S48 SVR12 SVR24
SOF/PR X X X
SMV/PR X X X Xa
Xa
DCV/PR X X X X
SANS IFNb
X X Xc
Xc
X X
a
Fin de traitement en fonction si en échec d’un traitement antérieur et si oui le type de réponse
b
SOF+RBV; SOF+SMV±RBV; SOF+DCV±RBV
c
S12 ou S24 : fin de traitement selon la combinaison thérapeutique utilisée
Stratégie diagnostique & suivi virologique
114. Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
4
1
5a
3
2
6
7a
Stratégie diagnostique & suivi virologique
115. Détermination du Génotype
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
116. Arens et al., J Clin Virol 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
119. Résumé
• Détermination du génotype (sous-type)
VHC
– La détermination du génotype sur la seule
région 5’NC doit être proscrite
– La 2nde
génération de Line Probe Assay qui utilise
des sondes dirigées contre la région core en
plus de la région 5’NC est la meilleure méthode
permettant de distinguer les sous-types 1a et
1b
EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
120. Intérêt de la Détermination du Sous-Type
(1a vs 1b) ?
- Différence d’efficacité de la combinaison
thérapeutique
- Profils de résistance différents en cas d’échec
thérapeutique
- Influence sur la décision thérapeutique
Stratégie diagnostique & suivi virologique
121. Impact du Sous-Type sur la Barrière
Génétique à la Résistance aux IP
HCV-1a prototype ...PAGHAVGIFFRAAVCTRGVAKAVDFIP...
HCV-1b prototype ...-S------------------------V-...
HCV-1a AGAAAA (R155K)
AGAACA (R155T)
HCV-1b CGAAAA (R155K)
CGAACA (R155T)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
122. Résistance au SMV dans les Essais
• 1254 patients G1 inclus dans les phases 2b/3
(C206,C208, C216, HPC3007)
– 197/1254 (15,7%) étaient en échec
% patients with mutations at time
of failure not achieving SVR
Emerging mutations at time of failure
Overall 91 (180/197)
GT1a* with Q80K 93 (49/53) 84% (41/49) R155K
12% (6/49) D168E
4% (2/49) Other
GT1a* without
Q80K
97 (61/63) 41% (25/61) R155K
36% (22/61) R155K in combination with
mutations at 80, 122 and/or 168
23 (14/61) Other
GT1b 86 (70/81) 60% (42/70) D168V
17% (12/70) D168A, E, H, T, A/V or E/V
22% (16/70) Other
Stratégie diagnostique & suivi virologique
123. Impact du Sous-Type sur la Barrière
Génétique à la Résistance aux anti-NS5A
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Gao et al., Nature 2010 6;465(7294):96-100.
124. SMV plus PegIFN/RBV: QUEST-1 − 24-48
Weeks in Treatment-naïve G1 patients
SMV group
(n=261)
Placebo group
(n=130)
Week 4
<25 IU/mL (RVR) 202/254 (80%) 15/127 (12%)
<25 IU/mL 230/254 (91%) 25/127 (20%)
SVR12 210/264 (80%) 65/130 (50%)
Breakthrough 24 (9%) 44 (34%)
Relapse 21/234 (9%) 18/84 (21%)
41%
With Q80K
60/146
59%
Without Q80K
At baseline
86/146 SVR12
31/60
Jacobson et al., Lancet 2014;384(9941):403-13.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
125. Impact du Polymorphisme Q80K sur la
Réponse au SMV plus SOF ± Ribavirin
Cohorte 1 : répondeurs nuls à la
bithérapie pégylée F0-F2 (N=74)
Cohorte 2 : naïfs de traitement et répondeurs nuls
à la bithérapie pégylée F3-F4 (N=40)
Lawitz et al., Lancet 2014;384(9956):1756-65.
24/27 31/31 17/17 25/26 38/40 18/18
Stratégie diagnostique & suivi virologique
126. Le Génotype du VHC Détermine l’Approche
du Traitement VHC
• Siméprevir uniquement chez les patients de
génotypes 1 et 4
– Excepté les patients de génotype 1a avec la mutation Q80K
• Importance de la ribavirine chez les patients non
cirrhotiques de génotype 1a avec la combinaison
“3D“ Abbvie
Stratégie diagnostique & suivi virologique
127. Intérêt de la Détermination des Profils de
Résistance ?
• Pas d’intérêt à la détermination
systématique avant traitement des
patients naïfs de traitement et en échec
d’un traitement par bithérapie pégylée car
taux de RVS élevés
• Pas d’intérêt à la détermination au
moment de l’échec car la plupart des
patients abritent des variants résistants
Hépatite C : Résistance au traitement
128. Intérêt de la Détermination des Profils de
Résistance ?
• Intérêt à la détermination chez les
patients en échec d’un traitement
contenant un ou plusieurs DAA avant
retraitement
– Importance des études observationnelles
longitudinales
Hépatite C : Résistance au traitement
Hinweis der Redaktion
Human pegivirus (HPgV) infects an estimated 2% and 5% of the world’s population.
HPgV is lymphotrophic, but its pathogenicity for humans is unknown.
cDNA a permis la caractérisation moléculaire du virus mais ce système ne répliquait que le chimpanzé.
Réplicons subgénomiques ont permis l’étude de la réplication intracellulaire en l’absence de production de particules virales
Pseudoparticules pour l’étude des étapes précoces de l’infection
Les particules VHC infectieuses issues de patients virémiques, c’est-à-dire contenant de l’ARN sédimentent à une densité &lt;1,08 g/mL, à une valeur inférieure de celles observées pour les autres virus appartenant à différentes familles et les particules VHC infectieuses (HCVcc) produites en culture cellulaire.
Cette valeur est voisine des coefficients de sédimentation de certaines lipoprotéines plasmatiques, type HDL ou VLDL.
Using mass spectrometry
Les esters de CH représentent plus de la moitié de la composition lipidique des particules HCVcc et s’apparentent aux lipoprotéines de type VLDL ou LDL
La région 5’NC est richement structuré avec une structure secondaire de type tige-boucle.
La région 5’NC est formée de 4 domaines dont 3 constitue l’IRES ou site d’entrée interne du ribosome.
La portion apicale du domaine III présentant une forte affinité pour le su 40S du ribosome et le facteur d’initiation de la traduction eIF3
Le domaine en pseudo-nœud (pseudoknot), situé à la base du domaine 3, est capitale car joue un rôle dans l’orientation du domaine 4 et de l’ORF permettant de placer le codon initiateur AUG en face du du tRNA initiateur pour le démarrage de la traduction. Ce domaine a un rôle capital et est placé au centre de l’IRES
Les microARN sont des ARN non codant de petite taille dont la fonction est d’induire la formation d’un complexe qui a pour rôle de réprimer l’expression du gène targeter.
miR-122 est un micro ARN qui joue un rôle majeur dans l’infection VHC
Phase 2b
36 patients G1
Injections SC
Core protéine est formée de 2 domaines D1 et D2.
L’analyse HCA (hydrophobic cluster analysis) montre la présence de 2 clusters hydrophobes (2 et 4) et 3 clusters fortement basiques (1, 3 et 5) au niveau du domaine D1.
Le domaine D1 est capable d’interagir avec l’ARN viral, tandis que le domaine D2 hydrophobe permet l’association de la protéine de capside avec les gouttelettes lipidiques intracytoplasmiques
Core protein, lipid droplets, and nuclei are stained in red, green, and blue, respectively.
Caractéristiques des protéines de fusion class II : structure avec une prédominance de feuillets beta et existence sous forme de monomères ou hétérodimères avec fusion membranaire
Ig-fold which has a sandwich-like structure formed by two sheets of antiparallel beta strands
BVDV: bovine viral diarrhea virus (virus de la diarrhées bovine)
TBEV: tick born encephalitis virus
Ig-fold which has a sandwich-like structure formed by two sheets of antiparallel beta strands
CD81 interagit avec the front layer et the CD81 binding loop (mutagenesis analysis)
Caractéristiques des protéines de fusion class II : structure avec une prédominance de feuillets beta et existence sous forme de monomères ou hétérodimères avec fusion membranaire
La région E2P7NS2n est plus informative pour les études épidémiologiques que la région NS5B car moins variable entre les génotypes
P7 s’organise sous forme d’hexamères d’un PM de 42 kDa avec 2 domaines transmembranbaires
In vitro en culture cellulaire, a été montré jouer un rôle dans la sécrétion des néovirions
P7 est requis au virus pour se répliquer chez le chimpanzé.
De plus en plus d’études suggèrent que p7 pourrait avoir des fonction similaires à M2 des virus grippaux de type A, c&apos;est-à-dire un rôle dans les étapes précoces au cours de l’entré virale ainsi qu’un rôle dans les tapes tardives au cours de la sécrétion des particules virales protégeant ainsi les Gp des pH acides même si cette deuxième hypothèse est discuté car Gp HCV sont relativement stable à pH acide et on ne sait pas si p7 fait parti de la particule virale.
BVDV: bovine viral diarrhea virus
CMA and CMC are two nucloeside analogues
BVDV: bovine viral diarrhea virus
NS2 est une cysteine-protéase de 217 aa qui comprend un domaine N-ter hydrophobe permettant de se lier aux membranes et un domaine C-ter globulaire avec un sous-domaine cytosolique protéasique.
Le domaine protéasique est capable de former des homodimères afin de former un site catalytique actif permettant d’assurer en cis le clivage NS2-NS3.
La topologie du domaine hydrophobe NS2 a été récemment déterminé par RMN (résonance magnétique nucléaire) et fait apparaître 3 segments transmembranaires (TMS1, 2 et 3). De plus, il a été démontré que la région N-ter de NS2 apparaît indispensable dans l’organisation de la formation des nucléocapsides, mécanisme complexe, qui semble étroitement associé aux gouttelettes lipidiques et qui en plus de la protéine de capside requiert d’autre partenaires tel que E1, E2, p7 et NS2.
NS2 est capable d’interagir avec de nombreux partenaires p7, E2, NS3 et plus modérément NS5A
La protéine NS3 comprend deux domaines, un domaine protéasique (serine protéase qui assure la plupart des clivages en trans puis en cis) et un domaine hélicase qui represénte 70% de la protéine NS3 avec 444 amino acides.
En rouge est représenté le domaine protéasique en présence de son cofacteur la potéine NS4A en violet et son substrat. Le site actif est constitué d’une triade catalytique (His-57, Asp-81, Ser-139).
En gris sur votre droite le domaine hélicase avec le site catalytique/NTP
Sur cette diapositive, les acides aminées participant à la poche hydrophobe responsable de l’interaction avec le substrat.
Comme vous le savez, la protéase NS3 est une des cibles majeur des antiviraux en développement, dont le boceprevir et le telaprevir qui bénéficient de l’AMM depuis septembre 2011.
Les principlaes substitutions amino acidiques impliqués dans la résistance à ces composés, il s’agit des positions 36, 41, 43, 54, 155, 168, 170 et 156 qui peuvent être présentes seules ou en association et qui confèrent des degrés variables de résistance.
2nd wave: better dosing, improved tolerability, broader genotype coverage
2nd generation: pan-genotype, high barrier to resistance
Plusieurs mécanismes d’action des anti-NS5A ont été décrits dans la littérature:
1-Inhibition de la formation des complexes de réplication
2- Inhibition du recrutement de la protéine kinase PI4KIII alpha
3- Augmentation de la stabilité de la protéine NS5A
4-Augmentation de la capacité de dimérisation de NS5A
5-Facilitation de la disruption des complexes NS5A
Example of population bottleneck : passage in a new host with a profound decrease of viral diversity and emergence of a new population of viruses
One of these genomes, indicated by the arrow, is able to survive a selection event (also called a genetic bottleneck), such as passage to a new host. This virus multiplies in the host and a new population of viruses emerges, shown by the diagram on the right. The consensus sequence for this population indicates that three mutations selected to survive the bottleneck are found in every member of the population.
Essai de phase 2b menés chez 571 patients non cirrhotiques naïfs de traitement (n=438, 76%) ou en échec (n=133, 24%) montrait des taux de RVS de 83% à 100% selon la durée et la combinaison utilisée. Résultats récemment publiés dans N Eng J Med en janvier 2014.
ABT450/r: anti-NS3
ABT-267: anti-NS5A
ABT-333: NN polymerase inhibitor
Neutrino : 89% de patients G1 (69% G1a et 20% G1b)
Fission: 71% G3 et 27% G2
The first step of HCV LVP entry is the binding of E1/E2 and /or ApoE on heparan sulfate proteoglycan and LDLR.
SRBI may play a role in HCV binding via HCV E2 and/or lipoproteins. SRBI may play also a role at the post-binding step of HCV entry.
Receptor tyrosine kinase including epidermal growth factor (EGFR) but also ephrin receptor A2 mediate HCV entry through facilitating association between CD81 and claudin 1.
Claudin 1 and occludin are component of tight junctions that contributes to post-binding steps of the HCV entry process.
Recently, Niemann Pick C-1 like 1 (NPC1L1) plays an important role in CH reabsorption from biliary secretion and as a cofactor for HCV entry during post-binding steps.
Un facteur clé dans l’entrée du VHC est la capacité de mouvement latéral du complexe HCV-CD81 jusqu’au jonctions serrées permettant l’interaction avec claudin-1 et induction de l’endocytose clathrine-dépendante. On a une acidification du compartiment endosomal et induction de la fusion entre la membrane endosomale et celle de l’enveloppe virale. Suite à la fusion, le génome viral est libéré dans la cytosol, où il est directement traduit afin de produire les différentes protéines virales
Double membrane vesicles (DMV)
L’ARN viral fraichement répliqué au sein des complexes de réplication va servir pour la formation de nouvelles particules virales qui vont budder à travers le RE.
Ce processus implique la protéine de capside et les glycoprotéines E1 et E2, ainsi que l’ARN viral.
Les particules virales naissantes sont maturées au sein du Golgi afin d’acquérir leur faible densité avant exocytose à la surface des hépatocytes. De nombreuses protéines virales et cellulaires sont impliquées dans ce processus.
La protéine de capside une fois synthétisée à la capacité de s’homodimériser et d’interagir avec les LD qui sont les organelles intracellulaires de stockage des lipides. La transit de la protéine de capside via les LD n’est pas totalement élucidé, peut être un rôle de séquestration de protéine de capside jusqu’à l’assemblage…
Ce trafficking implique des protéines cellulaires comme des MAPK et DGAT1, une des 2 enzymes nécessaires à la biosynthèse des TG.
Ensuite la protéine de core doit être transférée vers les sites d’assemblage et cela implique des facteurs cellulaires.
De nombreuses protéines virales sont impliquées dans l’assemblage et la sécrétion, c’est le cas de p7-NS2, NS3/4A, NS5A et NS5B bien que toutes ne soient pas empaquetées dans la particules virale. La première étape implique l’interaction de NS5A avec les LD-core.
NS2-P7 jouent également un rôle majeur.
12 weeks of SMV plus dual therapy followed by 12 or 36 weeks of dual therapy according to HCV RNA at weeks 4 and 12
SVR12=85% in patients without Q80K at baseline