1. ESCOLA SUPERIOR DE BIOTECNOLOGIA - UNIVERSIDADE CATÓLICA PORTUGUESA MESTRADO EM MICROBIOLOGIA APLICADA MICROBIOLOGIA MOLECULAR Metatranscriptomic Analysis of the Response of River Biofilms to Pharmaceutical Products, Using AnonymousDNA Microarrays Applied and Environmental Microbiology – Agosto 2010 Ana Figueiredo João Pereira Leonardo Dantas Porto, 04 de Janeiro de 2011.

3. Muitas actuam a concentrações relativamente baixas;

4. Fármacos necessitam de tempo para atingir o efeito desejado e logo, são produzidos especificamente para resistir à degradação dentro do corpo;

5. A taxa de adição ao meio excede a sua transformação ou degradação;

9. Construção da plataforma de microarrayanónimo 48 sub-arrays impressos emlâminas de vidro revestidas de Aminosilano Total Genomic DNA Sonication Genomic Fragments (400-600bp) VersArray Colony Picker (Bio-Rad) 6,351 “bons” (66.2%) 917 “fracos” (9.6%) End repair (End-It kit) Taq DNA polymerase + dATP Verificação em gel Quantificação de DNA por UV Amplificação (primers para vector) UA Ligation into pDrive vector VersArray Chip Writer Pro Printer (Bio-Rad) Extracção de DNA dos 9 600 clones Transformação de células XL1-Blue

10. Hibridização e análise do Microarray 250-500mg de Biofilme(amostracomposta) Ácidosnucleicos RNAse DNAse mRNA OmRNA foi enriquecido, amplificado para cDNA, e marcado com Cy3. 50µL de RNA cDNA 50µL deDNA Usam-se primers aleatórios e uma forma mutada do fragmento Klenow da DNA polimerase I, para a incorporação de nucleotidos fluorescentes, Cy5.

13. Os 96 valores positivos e negativos de maior valor para cada eixo foram seleccionados para sequenciação.Fig 1a.

15. As posições relativas dos tratamentos não foram exactamente as mesmas que para WC, mas observou-se alguma similaridade Fig1b.

17. sondas > parede celular e membrana externa (COG M)ou envolvidas na transducção de sinal (COG T) - resposta positiva.

18. Sondas > genes que codificam as DNA e RNA polimerases - resposta negativa.

19. Gemfibrozil (GM)

20. 3 sondas > Chitinophagapinensis – resposta negativa ao GM, que pode indicar que este microrganismo pode ser inibido pelo gemfibrozil.

22. 1 sonda >guanosinatetrafosfato (ppGpp) sintetase – resposta positiva.

23. Resposta mais positiva para a sonda ligada à proteína chaperonaDnaK (proteína de choque térmico 70).

24. Sondas potencialmente relacionadas com genes de resposta a stress - respostas positivas ou negativa.

26. 5 genes relacionados com producção e conversão de energia (COG C) – resposta positiva.

27. 2 sondas relacionadas a Hyphomonasneptunium – resposta negativa.

30. Resultados Sondas de melhor resposta 11 das 192 sondas com os maiores valores em cada lado dos dois primeiros eixos dos biofilmes SSR também estavam entre as 384 sondas que tiveram os maiores valores para os biofilmes WC.

31. Resultados qRT-PCR qRT-PCR concordante com Microarray qRT-PCR discordante do Microarray

32. Discussão Hormese ERITROMICINA  Chaperona DnaK  ppGpp sintetase

33. Discussão SULFONAMIDAS Diminuição da expressão de genes relacionados à replicação e transcrição (DNA e RNA polimerases) SULFAMETOXAZOL Aumento da expressão de genes relacionados à parede celular e membrana externa Formação de biofilme SULFAMETAZINA Aumento da expressão de genes relacionados à produção e conversão de energia.

34. Discussão GEMFIBROSIL Aumento da expressão de diversos genes relacionados ao metabolismo lipídico, indicando que o GM possa afectar este processo em baixas concentrações.  Regulador de síntese do flagelo  Regulador de síntese do flagelo DIMINUIÇÃO DOS NÍVEIS DE 16S rRNA Todos os produtos farmacêuticos; Diminuição da biomassa microbiana ou diminuição da atividade geral no biofilme.

36. Indicação que as pequenas moléculas testadas causam alterações reproductiveis nas comunidades de biofilmes para ambos os rios.

37. Sondas serão de, ou genes similares de organismos diferentes, ou de genes diferentes provindos de organismos idênticos.

39. QuantoaoGemfibrozil e àsSulfonamidas as respostasobservadas, estãode acordo com o conhecimentogeral, poisnãoexistemmuitosestudos de transcriptómica com estesfármacos.

40. O microarray foiusado com sucessoembiofilmesformados sob condiçõesnutriocionaisdiferentesdaquelas a quelhederamorigem.

41. A partirdestepoderá ser construido um microarray maisreduzidocontendoapenas as sondasmaisrelevantes.

43. Muito obrigado pelavossaatenção e debate!

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