1. PRÁCTICA # 9
“STAPHYLOCOCCUS”
OBJETIVOS:
 Determinar el tipo de microorganismo sembrado de diferentes fuentes a través de su crecimiento en diferentes
medios de cultivo y comprobado a través de diversas pruebas bioquímicas.
 Describir las características microscópicas, culturales que permiten efectuar el aislamiento y la diferenciación entre
Staphylococcus aureus y los estafilococos coagulasa negativa (ECN)
 Seleccionar los medios de cultivo adecuados para llevar a cabo la detección de los estafilococos
 Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a los estafilococos
INTRODUCCIÓN
STAPHYLOCOCCUS.
Los cocos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos, según su forma de división y agrupación, se integran en
dos familias (Micrococcaceae y Deicrococcaceae) y otros géneros con personalidad propia como el género
Streptococcus. La familia Micrococcaceae que tiene interés médico incluye aquellos que se agrupan de forma irregular o
en tetradas, y está constituida por los géneros Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus y Stomatococcus.
Los cocos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos de interés médico están en los géneros Staphylococcus y
Streptococcus, que a su vez comprende el neumococo (S. pneumoniae).
CONCEPTO Y CLASIFICACIÓN.
Concepto
Los estafilococos son cocos gram positivos de 0.5-1 μm de diámetro, inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos,
caracterizados en que se agrupan de forma irregular en racimos, producen catalasa y descomponen los azúcares por
fermentación. Son bacterias poco exigentes, que se cultivan fácilmente en medios comunes y presentan cierta
resistencia a los agentes externos, por cuyo motivo se pueden encontrar en la naturaleza, especialmente en el medio
ambiente que rodea al hombre, formando parte de la flora normal de la piel y mucosas e interviniendo en procesos
patógenos diversos, sobre todo en infecciones supuradas e intoxicaciones alimentarias.
Clasificación
Se pueden distinguir las siguientes especies:
1. S. aureus, prototipo de los estafilococos patógenos. Es el agente causal de la mayoría de las infecciones; se
caracteriza por producir coagulasa o fermentar el manitol, elaborar diversas toxinas, en especial la toxina α, y
sintetizar en su mayoría un pigmento amarillo dorado, no difusible, que colorea a las colonias.
2. S. epidermidis y S. saprophyticus, prototipos de los estafilococos oportunistas. Son gérmenes comensales de la piel
o libres en el medio ambiente, que en ocasiones pueden intervenir en procesos patógenos. Se caracterizan por no
producir coagulasa ni toxina α, no fermentan el manitol y elaboran en su mayoría un pigmento blanco aporcelanado.
La importancia de los estafilococos deriva de su aumento progresivo de resistencia a los antibióticos, sobre todo en el
medio hospitalario, que junto con su resistencia a los agentes externos les permite difundir y producir infecciones y
brotes epidémicos (infecciones hospitalarias), que plantean serios problemas epidemiológicos y terapéuticos.
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Estructura antigénica y clasificación en tipos
La estructura antigénica de S. aureus es compleja y mal conocida. En la pared celular se han demostrado cerca de 30
antígenos, y los más importantes son:
1. El polisacárido A, específico de especie, constituido por ácidos teicoicos, polímeros de fosfato de ribitol, que están
unidos al peptidoglicano por enlaces covalentes. Son antigénicos e inducen la aparición de anticuerpos, y se ha
demostrado un aumento de anticuerpos antirrubitol en los casos de endocarditis estafilocócica. En S. epidermidis,
los ácidos teicoicos son polímeros de fosfato glicerol y en S. saprophyticus, polímeros de fosfato de ribitol. Los
bacteriófagos se fijan en esta capa.

2. 2. La proteína A, específica de especie, se encuentra en la pared celular y puede liberarse en el medio. Presenta la
propiedad de unirse a la extremidad Fc de las IgG normales y a la extremidad F(ab) 2 de las IgG específicas, así
como de activar el complemento.
3. Existen, además, en la pared celular un número indeterminado de proteínas responsables de la tipoespecificidad.
4. También se han aislado cierto número de cepas mucoides capsuladas, especialmente en los animales, cuya
composición e importancia no se conocen.
La especies S. aureus se caracteriza por la presencia de ácidos teicoicos, polímeros de fosfato de ribitol y proteína A.
Pero, además por sus antígenos tipoespecíficos se ha podido subdividir en tipos siguiendo dos criterios: a) En serotipos,
mediante el empleo de sueros tipoespecíficos, y se ha clasificado en 18 serotipos. b) En fagotitos o lisotipos, por el
estudios de la sensibilidad de la cepa frente a un grupo de fagos seleccionados. Se conocen más de 100 fagotipos que
por necesidades prácticas se han reunido en 4 grupos y un grupo no clasificado.
Los serotipos 1, 2 y 3 se corresponden en líneas generales con los fagogrupos I, II y III. Es interesante señalar que en
los tres primeros fagogrupos se encuentran la mayoría de las cepas patógenas para el hombre: en el grupo II, cepas
extrahospitalarias y productoras de toxinas exfoliativa y, en el grupo III, la mayoría de cepas multirresistentes a los
antibióticos pertenecientes a determinados serotipos o fagotipos.
Acción patógena
Es debida fundamentalmente a la acción de antígenos de superficie, toxinas y fermentos1
STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBESPECIE AUREUS.
Staphylococcus aureus subespecie aureus es sin duda el patógeno humano más importante entre los estafilococos. Se
lo encuentra en el ambiente externo y en las narinas anteriores del 20 al 40% de los adultos. Otros sitios de colonización
son los pliegues cutáneos, el periné, las axilas y la vagina. Aunque este microorganismo suele formar parte de la
microflora humana normal, puede producir infecciones oportunistas importantes en las condiciones apropiadas. Los
factores que pueden predisponer a un individuo a infecciones graves por S. aureus incluyen los siguientes:
Defectos quimiotácticos de los leucocitos, sean congénitos o adquiridos.
Defectos en la opsonización por anticuerpos.
Defectos en la destrucción intracelular de las bacterias después de la fagocitosis.
Lesiones cutáneas.
Presencia de cuerpos extraños.
Infecciones por otros agentes, particularmente virus.
Enfermedades crónicas de base, como tumores malignos, alcoholismo, y cardiopatías.
Administración profiláctica o terapéutica de agentes antimicrobianos.
En estas circunstancias S. aureus puede producir una variedad de procesos infecciosos que van desde infecciones
cutáneas relativamente benignas hasta enfermedades sistémicas potencialmente fatales. Las infecciones cutáneas
incluyen la foliculitis simple (infección superficial que rodea los folículos pilosos) y el impétigo (infección superficial de la
piel observada frecuentemente en los niños). Así como furúnculos y carbuncos que afectan el tejido subcutáneo y
producen síntomas sistémicos como fiebre. S. aureus se aísla con frecuencia de heridas quirúrgicas infectadas, las que
pueden funcionar como focos para el desarrollo de infecciones sistémicas. La bronconeumonía estafilocócica adquirida
en la comunidad se observa habitualmente en ancianos y se asocia con una neumonía viral como factor predisponiente.
La neumonía nosocomial producida por S. aureus se observa en cuadros clínicos de enfermedad pulmonar obstructiva
crónica, con intubación y aspiración. Las enfermedades malignas subyacentes se reconocen como factores de riesgo
importantes para el desarrollo de una bacteriemia por S. aureus. La bacteriemia también puede “sembrar” localizaciones
distantes del organismo y dar origen a una endocarditis, una osteomielitis, una pioartritis y la formación de abscesos
metastáticos, particularmente en la piel, los tejidos subcutáneos, los pulmones, el hígado, los riñones y el cerebro. La
meningitis estafilocócica aparece en pacientes con anormalidades del sistema nervioso central relacionadas con
traumatismos, cirugía, tumores malignos e hidrocefalia y Staphylococcus aureus es la segunda causa más frecuente de
meningitis asociada con derivaciones ventriculoperitoneales. También es uno de los muchos microorganismos asociados
con peritonitis en pacientes sometidos a diálisis peritoneal ambulatoria continua. Las toxinas estafilocócicas también son
responsables de la necrólisis epidémica tóxica (síndrome estafilocócico de la piel escaldada) y del síndrome de shock
tóxico. También hay cepas de S. aureus que pueden producir intoxicaciones alimentarias debido a la elaboración de
exotoxinas durante su desarrollo en alimentos contaminados.
S. aureus posee varias propiedades que se supone que contribuyen a su capacidad de producir enfermedad. Sin
embargo, estos factores de virulencia no se encuentran en todas las cepas de S. aureus y este microorganismo sigue
1
A. Fumarola, et al. Microbiología y parasitología medica. Segunda edición. Editorial Masson.
2

3. siendo fuente de sorpresas constantes a medida que se descubren propiedades patogénicas nuevas y diferentes. Estas
propiedades incluyen las siguientes.
Formación de la cápsula
Algunas cepas de S. aureus producen un exopolisacárido que puede evitar la fagocitosis del microorganismo por parte
de los leucocitos polimorfonucleares. Estos exopolisacáridos han sido observados por microscopia electrónica en
derivaciones de marcapasos, catéteres peritoneales y guías intravenosas infectadas por S. aureus y han sido
demostrados inmunológicamente in Vitro. Este material puede facilitar la adherencia de los microorganismos a las
células del huésped y a los dispositivos protésicos. Los aislamientos clínicos de S. aureus se han clasificado en ocho
tipos de acuerdo con la inmunotipificación del polisacárido capsular y entre el 70 y el 80% de los aislamientos clínicos
importantes pertenecen a los serotipos capsulares 5 u 8. Estos dos tipos capsulares, particularmente el tipo 8, también
están asociados con otros factores de virulencias de S. aureus, como por ejemplo, la producción de la toxina del
síndrome de shock tóxico. Además, una gran cantidad de cepas de S. aureus que son resistentes a la oxacilina, la
penicilina antiestafilocócica utilizada con mayor frecuencia, expresan el serotipo 5 de polisacárido capsular. Los tipos
capsulares 5 y 8 también se han encontrado en aislamientos animales de S. aureus.
Proteína A
La pared celular de S. aureus contiene esta peculiar proteína que tiene la capacidad de unirse a la región Fc de la
molécula de inmunoglobulina G (IgG). La proteína A se encuentra unida al peptidoglucano de la pared celular y también
puede ser segregada al medio durante el desarrollo. La proteína A funciona como un factor de virulencia al interferir en
la opsonización y la ingestión de los microorganismos por parte de los leucocitos polimorfonucleares, activan al
complemento y estimulan reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato y retardado. La proteína A es inmunogénica
y en los individuos con infecciones graves producidas por S. aureus se encuentran anticuerpos dirigidos contra ella. La
presencia de la proteína A en S. aureus constituye la base de las pruebas de coaglutinación que se utilizan muchos
laboratorios clínicos para la identificación de microorganismos y para la detección de antígenos bacterianos en líquidos
corporales.
Constituyentes de la pared celular
La pared celular de S. aureus contiene peptidoglucano (polímeros de N-acetilglucosamina y de ácido N-acetilmurámico
ligados en forma cruzadas), que son similares a los encontrados en otras bacterias gram positivas, y ácidos teicoicos,
que son polímeros peculiares de ribitol (monosacáridos de cinco carbonos) con fosfatos. Los ácidos teicoicos participan
en la adherencia específica de las bacterias gram positiva a las superficies mucosas. Además de conferir rigidez y la
elasticidad a la pared celular de los estafilococos los peptidoglucanos y los ácidos teicoicos poseen varias propiedades
biológicas que se supone que contribuyen a la virulencia. Estas propiedades incluyen la capacidad de activar el sistema
del complemento, de inhibir la quimiotaxis de las células inflamatorias y de estimular la producción de anticuerpos. Las
pruebas sexológicas para la detección de anticuerpos contra estas moléculas han sido investigadas en lo que respecta a
su posible valor diagnóstico o pronóstico; los resultados han sido desalentadores debido a la considerable superposición
de títulos de anticuerpos entre individuos infectados y no infectados, el amplio espectro de infecciones y enfermedades
producidas por S. aureus y la variabilidad dependiente del huésped de la respuesta inmune según la edad, otras
infecciones y la inmunocompetencia general.
Enzimas
S. aureus produce varias enzimas que pueden contribuir a su virulencia. La producción de catalasa por parte de estos
microorganismos pueden actuar para inactivar el peróxido de hidrógeno y los radicales libres tóxicos formados por el
sistema mieloperoxidasa dentro de las células fagocíticas después de la ingestión de estos microorganismos. Tanto la
coagulasa libre como la unida pueden recubrir las células bacterianas con fibrina y tornarlas resistentes a la
opsonización y la fagocitosis. Las fibrinolisinas pueden degradar coágulos de fibrina y permitir la diseminación de la
infección a los tejidos contiguos. En forma similar, la hialuronidasa hidroliza la matriz intercelular de mucopolisacáridos
en los tejidos y, por lo tanto, pueden actuar diseminando los microorganismos a zonas adyacentes. Las cepas de S.
aureus que provocan furunculosis crónica son productoras de potentes lipasas que pueden contribuir a la diseminación
de los microorganismos en los tejidos cutáneos y subcutáneos. Se ha descrito una fosfolipasa C específica para el
fosfatidilinositol asociada con cepas recuperadas de pacientes con síndrome de distrés respiratorio del adulto y
coagulación intravascular diseminada. Los tejidos afectados por esta enzima se vuelvan más susceptibles al daño y la
destrucción por componentes bioactivos del complemento y los productos de la activación del complemento. Los
estudios inmunológicos y de especificidad de sustrato indican que S. aureus produce por lo menos tres tipos diferentes
de beta-lactamasas. La producción estas enzimas puede ser inducible o constitutiva y hace que estos microorganismos
sean resistentes a la penicilina y a la ampicilina. Los genes que codifican estas enzimas habitualmente residen en
plásmidos que también poseen genes para la resistencia a diversos antibióticos, como la eritromicina y la tetraciclina.
Estos genes de resistencia pueden ser transferidos a otras bacterias por transformación y tranducción.
Hemolisinas
3

4. Las hemolisinas de S. aureus poseen varias actividades biológicas. La alfa-hemolisina tiene efectos letales sobre una
amplia variedad de tipos celulares, entre ellos los leucocitos polimorfonucleares humanos, y lisa eritrocitos de varias
especies animales. La toxina es dermonecrótica por inoculación subcutánea y es letal para los animales cuando se le
inyecta por vía intravenosa. También es una potente neurotoxina. Esta toxina es responsable del halo de eritrocitos
bemolizados que se observa alrededor de las colonias de algunas cepas de S. aureus que se desarrollan en agar
sangre de carnero. La beta-hemolisina es una esfingomielinasa que tiene actividad contra una variedad de células. Es
una hemolisina “caliente-fría” (es decir, sus propiedades hemolíticas son incrementadas por la exposición posterior de
los eritrocitos a bajas temperaturas). La beta-hemolisina, junto con el factor CAMP producido por los estreptococos del
grupo B.
Toxinas
La leucocidina es una exotoxina que ejerce un efecto tóxico directo sobre la membrana de los leucocitos
polimorfonucleares humanos que provoca desgranulación del citoplasma, edema celular y lisis. La toxina tiene dos
componentes que interactúan en forma sinérgica para producir una granulocitopenia profunda. La forma de acción de
esta toxina involucra la formación de poros que alteran la permeabilidad celular al potasio y otros cationes. Las
exfoliatinas o toxinas epidermolíticas son producidas por ciertas cepas de estafilococos y consisten en dos proteínas,
denominadas ET-A y ET-B, de 24.000 Da de peso molecular relativo de cada una. Las dos moléculas son diferentes
desde el punto de vista bioquímico e inmunológico pero tienen actividades biológicas similares. La ET-A es una proteína
termoestable cuyo gen estructural es cromosómico, en tanto ET-B es termolábil y de origen plásmido. Estas proteínas
poseen actividad proteolítica y disuelven la matriz mucopolisacárida de la epidermis, lo que da como resultado la
separación intraepitelial de las uniones celulares del estrado granuloso. Las cepas que producen una de estas toxinas o
ambas son responsables del ”síndrome estafilocócico de la piel escaldada”. En este cuadro clínico se observa la
formación de bullas grandes áreas del cuerpo, con la posterior formación de escaras en las capas superficiales de la
piel. Esto da como resultado grandes áreas de piel denudada y en carne viva. La enfermedad se ve habitualmente en
recién nacidos y lactantes. Ambas toxinas son antigénicas y los anticuerpos dirigidos contra ellas son protectores. Las
enterotoxinas A a E son moléculas termoestables, responsables de la características clínicas de la intoxicación
alimentaria estafilocócica. El mecanismo exacto de acción de estas enterotoxinas se desconoce pero aumentan el
peristaltismo intestinal.
ESTAFILOCOCOS COAGULASA-NEGATIVOS
Antiguamente los estafilococos coagulasa-negativos por lo general se consideraban contaminantes de poca importancia
clínica. Sin embargo, en las últimas décadas estos microorganismos se han reconocido como agentes importantes de
enfermedades humanas. Aunque se han descrito varias especies diferentes de estafilococos coagulasa negativos,
relativamente pocos de ellos producen infecciones en los seres humanos. Sin embargo, como una mayor cantidad de
laboratorios han intentado identificar estafilococos coagulasa- negativos se están reconociendo infecciones producidas
por otras especies cada vez con mayor frecuencia. Los tipos de infecciones asociadas con los estafilococos coagulasa-
negativos incluyen las siguientes:
Infecciones urinarias, nosocomiales y adquiridas en la comunidad.
Infecciones producidas por dispositivos permanentes.
Bacteriemia en huéspedes comprometidos.
Endocarditis de válvulas cardíacas naturales y protésicas.
Osteomielitis.
Endoftalmitis posquirúrgica.
ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS DE ORÍGEN HUMANO, ANIMAL Y AMBIENTAL
Estafilococos encontrados en el hombre y en primates no humanos
Especie Comentarios.
Integrante de la flora normal humana de la piel . Se encuentra también en primates no
S. haemolyticus
humanos.
Esta especie, que representa aproximadamente el 1% de los estafilococos encontrados
S. warneri normalmente en la piel humana, en la actualidad es una causa bien reconocida de
bacteriemia relacionada con catéteres, de endocarditis de válvulas naturales.
Esta especie se encuentra en la piel humana y ha sido aislada como causa de bacteriemia
S. hominis
en pacientes cancerosos.
Encontrado en la piel y en la uretra de mujeres sanas. Ha sido identificado como causa de
septicemia, osteomielitis y artritis séptica posterior a la reducción a cielo abierto de una
S. simulans
fractura de peroné. Posee una cápsula que inhibe la fagocitosis in Vitro y contribuye a la
virulencia in vivo.
4

5. Se ha relacionado principalmente con endocarditis de válvulas naturales y protésicas, con
S. lugdunensis celulitis de la piel y del tejido subcutáneo, con peritonitis, con prótesis de cadera infectadas
y con abscesos mamarios.
Integrante de la flora normal humano, se encuentra alrededor de las glándulas sebáceas
del cuero cabelludo y de la frente. Recientemente la especie se ha dividido en dos
S. capitis
subespecies, S. capitis subespecie capitis y S. capitis subespecie urealyticus. Esta última
subespecie es ureasa-positiva.
Ha sido aislada a partir de varias infecciones humanas, entre ellas empiema cerebral,
infecciones de heridas, bacteriemia como complicación de una osteítis vertebral, infección
S. schleiferi de una prótesis de cadera. La especie ha sido dividida en dos subespecies; los
aislamientos humanos se denominan S. schleiferi subespecie schleiferi y los aislamientos
caninos reciben el nombre de S. schleiferi subespecie coagulans.
Especie que se encuentra en muestras clínicas humanas y animales y en alimentos todavía
S. pasteuri
no han sido asociada con procesos infecciosos y es fenotípicamente similar a S. warneri.
Esta especie se encuentra en el conducto auditivo externo de los seres humanos y rara vez
S. auricularis
ha sido implicada en infecciones
Esta especie se ha subdividido en dos subespecies denominadas S. cohnii subespecie
S. cohnii cohnii y S. cohnii subespecie urealytium. Ambos microorganismos pertenecen a la flora
normal de la piel.
Este microorganismo se encuentra tanto en seres humanos como en primates no humanos
S. xylosus
y ha sido implicado como causa de infecciones de las vías urinarias superior e inferior.
S.
Esta especie anaerobia, se encuentra en las mucosas humanas.
saccharolyticus
Originalmente aislado de cabras, recientemente se lo ha encontrado en la piel humana y en
S. caprae
nuestras clínicas humanas.
Especie coagulasa-negativa resistente a la novobiocina, se encuentra en seres humanos y
S. pulvereri
en pollos.
Estafilococos encontrados en otros animales.
Especie Comentarios.
S. intermedius Hallado como integrante de la flora de los perros, los hurones, los caballos y los gatos,
pueden producir infecciones cutáneas, urinarias, óseas y del sistema nervioso central en
varias especies animales
S. hyicus Encontrado en cerdos, ganado vacuno y leche de vaca.
S. choromogenes Produce infecciones cutáneas en el ganado vacuno.
S. sciuri Se encuentra normalmente en roedores y otros mamíferos pequeños, fundamentalmente
ardillas.
S. gallinarum Esta especie se encuentra en aves de corral y no es patógena.
S. lentus Forma parte de la flora normal de las ovejas y las cabras.
S. equorum Una rara especie equina de importancia patógena indeterminada.
S. delphini Especie coagulasa-positiva que produce lesiones cutáneas purulentas en delfines.
S. felis Produce otitis, cistitis, abscesos, heridas y otras infecciones cutáneas en gatos.
S. muscae Se encuentra como integrante de la flora transitoria de la superficie corporal de las
moscas que viven en establos de vacas pero que no se ha encontrado en moscas que
habitan en residencias humanas.
S. piscifermentans Se encuentra en peces, en productos de pescados fermentados y en puré de soja.
S. vitulus Se encuentra como parte de flora de los caballos, los ratones campestres y las ballenas
piloto.
Otras especies de estafilococos (en su mayoría de origen animal).2
Especie Comentarios
Utilizado como cultivo iniciador en el procesamiento de productos cárneos como el salame
S. carnosus
y salchicha.,
Especie saprófita encontrada en la leche y otros productos lácteos y como parte de la flora
S. caseolyticus
del ganado vacuno y las ballenas.
S. kloosii Encontrado en mamíferos, es de importancia clínica y ubicación taxonómica inciertas.
Encontrado en mamíferos y aves, es de importancia clínica y ubicación taxonómica
S. arlettae
inciertas.
INTOXICACIÓN ALIMENTARIA ESTAFILOCÓCINA.
2
Koneman, et al. Diagnóstco Microbiológico Texto y atlas a color. Quinta edición. Editorial Medica Panamericana.
5

6. La intoxicación alimentaria más común está causada por el coco Gram positivo Staphylococcus aureus. Este organismo
produce varia enterotoxinas que secreta al medio circulante o alimento; si se come el alimento que contiene la toxina, en
el plazo de 1-6 horas se observan severas reacciones que incluyen náuseas, con vómitos y diarreas. Se han identificado
seis tipos de enterotoxinas de S. aureus: A, B, C1, C2, D y E. La enterotoxina A es la más frecuentemente está asociada
a los brotes de intoxicación alimentaria estafilocócica. El mecanismo de acción de la enterotoxina A es el de un
superantígeno e implica la estimulación sistémica de un gran número de células T. La enterotoxina A de S. aureus es un
péptido pequeño, de peso molecular 30.000 Dalton, codificado por un gen cromosómico. La clonación y secuenciación
de este gen, el gen entA, y de varios otros genes de enterotoxinas de S. aureus, muestra que esta familia de toxinas
están relacionadas genéticamente.
Las clases de alimentos más comúnmente implicadas en las intoxicaciones alimentarias son los productos cocidos al
horno y rellenos de crema pastelera o de nata, las aves, la carne y los productos cárnicos, las salsas, las ensaladas con
huevo y carne, los flanes y los aliños con nata para ensaladas. Si estos alimentos se mantienen en el frigorífico después
de ser preparados, permanecen relativamente seguros ya que S. aureus es incapaz de crecer a bajas temperaturas. Sin
embargo, con frecuencia esta clase de alimentos no se refrigeran y frecuentemente se mantienen en cocinas calientes o
al aire libre, durante meriendas campestres. Bajo estas condiciones Staphylococcus, que pueden haber llegado al
alimento desde un manipulador de alimentos, durante su preparación, crece y produce enterotoxina. Muchos de los
otros alimentos implicados en intoxicaciones alimentarias no se vuelven a cocinar de nuevo antes de comerlos, pero
incluso si se cocinan, la toxina es relativamente termoestable y puede permanecer activa. La intoxicación alimentaria
estafilocócina puede evitarse con cuidados métodos higiénicos o almacenando los alimentos a bajas temperaturas para
evitar el crecimiento microbiano, y eliminando todos los alimentos que hayan permanecido durante algunas horas a
temperatura superior a 4 grados centígrados.3
CURVA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la determinación periódica del número de
células viables por mililitro que existen en un líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo que
ha crecido previamente hasta la saturación.
Dicha curva se divide en seis fases, mismas que se simbolizan con letras de la A a la F. A continuación se muestra un
cuadro con las características principales de cada fase y se desarrollan las más importantes.
Parte de la Curva Fase Tasa de Crecimiento
A Rezago Cero
B Aceleración Creciente
C Exponencial Constante
D De retraso Decreciente
E Estacionaria máxima Cero
F Declinación Negativa (muerte)
A: Fase de Rezago.
Este periodo consiste en la adaptación de las células microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las células
microbianas se encuentran empobrecidas en cuanto a metabolitos y enzimas, esto debido a las condiciones
desfavorables que representaba el cultivo previo. Por lo anterior, en este lapso de tiempo se forman las enzimas y los
metabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento.
Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan
diferentes que las células sean genéticamente incapaces de sobrevivir, por lo que sólo unas cuantas mutantes podrán
subsistir, y obviamente se requerirá más tiempo para que éstas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de
células.
C: Fase Exponencial.
Como el nombre lo indica, en esta fase las células se encuentran en un estado de crecimiento sostenido.
Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante, pero éste material es en sí catalítico y la masa aumenta de
manera exponencial. Lo anterior continua hasta que uno o más nutrimentos se agoten, o hasta que se acumule tal
cantidad de metabolitos tóxicos que se inhiba el crecimiento. El nutrimento limitante para los organismos aerobios suele
ser el oxígeno: cuando la concentración bacteriana es de aproximadamente 1 x 107/ml es necesario incrementar el
ingreso de oxígeno mediante agitación o burbujeo; pero cuando la concentración alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por ml, la
tasa de difusión de oxígeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento
disminuye progresivamente.
3
Brock. Biología de los Microorganismos. Octava edición. Editorial Prentice Hall.
6

7. Durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las células (medida en gramos de biomasa producida por
hora), cuando el crecimiento no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la constante de la tasa
de crecimiento (k) por la concentración de biomasa. La constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cuál las
células producen más células, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de biomasa producidos por cada
gramo de biomasa preexistente creados en una hora.
El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa exponencialmente con respecto al tiempo. De
lo anterior se deriva que, si graficamos el logaritmo de la concentración de la biomasa (o celular) en función del tiempo,
como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos una línea recta como representación de esta fase.
Esta fase puede prolongarse indefinidamente si las células se transfieren repetidamente a un medio nuevo (fresco) de
composición idéntica al anterior, lo cual se logra de manera automática mediante dos aparatos: el
quimiostato y el turbidostato.
E: Fase Estacionaria Máxima.
Como se explicó en la descripción de la fase anterior, ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulación
de metabolitos tóxicos el crecimiento cesa por completo después de un periodo de decrecimiento en la tasa de
crecimiento, lo cual corresponde a la fase D o de retraso.
No obstante, por lo general en esta fase se puede observar recambio celular, lo cual se debe a que, aunque existe una
pérdida lenta de células por muerte, dicha pérdida se compensa exactamente por la formación de nuevas células a
través de crecimiento y divisón. Así, la cifra de células viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteo
aumente poco a poco el número de células, si se cuentan también las muertas.
Para comprender lo anterior debemos considerar que, para una célula microbiana, muerte significa la pérdida
irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cuál se comprueba cuando una célula es incapaz
de producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva que designar a una célula microbiana como muerta
no implica su destrucción física.
La duración de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio.
F: Fase de Declinación.
Esta fase, también conocida como fase de muerte, representa el decremento de células debido al aumento progresivo
de la tasa de mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido.
Por lo general, una vez que la mayoría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo
que un número pequeño de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o años. Dicha persistencia puede
deberse a que las células consiguen crecer gracias a los nutrimientos liberados por las células que mueren y se lisan,
observándose recambio celular.4
MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas
óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de
Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Clasificación de los medios de cultivo
En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en
forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le
añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:
° Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son
usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los
componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
° Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativa y
cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. (Para bacterias como: Echerichia coli y
Leuconostoc citrovorum)
4
Brooks, et. al., Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 16a ed.
7

8. De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:
° Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en
particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más
sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar. Un medio
de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran
tamaño. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y
cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirán el tratamiento y podrán crecer. Las bacterias
lijadoras de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio libre de nitrógeno, donde sólo
ellas podrán crecer porque obtienen el nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogos microbianos usan frecuentemente
medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto
químico tóxico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la única fuente de carbono sea dicho
compuesto. El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizado en biorremediación.
° Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados
para el aislamiento de microorganismos específicos. Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos
microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies
particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi,
agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos
medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódica, el telurito potásico o el cristal
violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta
forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente
causal de una grave intoxicación alimentaría. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de
otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de
carbono poco común.
° Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los
microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características
fisiológicas de los microorganismos. Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado
microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza
el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor
una zona transparente debido a que producen hemólisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las
bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos
metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.
° Medios selectivos-diferenciales: Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey
es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias
entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de
bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz
grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la
mayoría de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente
diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la
lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterias sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán
rojas, mientras que las restantes no lo serán.
Por su composición los medios de cultivo se clasifican en:
° Líquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente útiles para hacer diluciones, para homogenizar mezclas de
microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas.
° Sólidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es posible
observar las características típicas de un solo tipo de microorganismo.
° Semisólidos: Son aquellos medios líquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a 0.8%. Estos se
emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaerofílicos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o por
simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se
prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor
probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
∼Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de
calidad.
8

9. ∼Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
∼Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
∼Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización.
∼Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.
Almacenamiento de los medios de cultivo:
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el
fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25º), con poca humedad y protegidos de la luz
solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor; Los medios de
cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8ºC, a menos que el
medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su
deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).5
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS:
MAC CONKEY
Medio empleado ampliamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como Salmonellas, Shigella y
coliformes a partir de heces fecales, orinas, aguas negras y diversos alimentos.
Formulación aproximada en gramos por litro:
Peptona de gelatina........................................17.0
Mezcla de peptonas..........................................3.0
Lactosa............................................................10.0
Mezcla de sales biliares......................................1.5
Cloruro de sodio................................................5.0
Agar..................................................................13.5
Rojo neutro.......................................................0.03
Cristal violeta....................................................0.001
Preparación:
Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Remojar bien entre 10 a
15 minutos y calentar a ebullición agitando continuamente. Hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC
durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 ºC y vaciar en cajas de Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir
las cajas para evitar que se deposite un exceso de humedad en la superficie del medio.
Usos:
El espécimen puede sembrarse directamente en la placa por estría superficial, o bien inocularlo en medios líquidos d
enriquecimiento, tales como caldo tetrationato, caldo selenito cistina o caldo GN. Incubar placas y caldos a 35ºC de 18
a 24 horas. Hacer resiembras de estas últimas en placas de Agar de Mac Conkey y volver a incubar.
Se recomienda sembrar simultáneamente las muestras en otros medios mas selectivos tales como Eosina y Azul de
metileno, Agar SS, Agar Tergitol 7, Agar XLD, Agar Entérico Hektoen, Agar Sulfito de Bismuto, Agar Verde Brillante,
especial para Salmonellas.
Los gérmenes Gram positivos son inhibidos por las sales biliares y el cristal violeta. Las enterobacterias fermentadoras
de la lactosa bajan el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rojas o rosadas. Las no
fermentadoras de la lactosa dan colonias transparentes, incoloras o ambarinas.
En el Agar MacConkey crecen también bacilos Gram negativos que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae,
como Pseudomonas y Aeromonas. Asimismo, pueden desarrollarse en número reducido colonias puntiformes de
Streptococcus fecalis de color rojo y de algunos estafilococos cuyas colonias son pequeñas, opacas de color rosa
pálido.
Por último, este medio puede usarse en la diferenciación de especies de Mycobacterium.
CARACTERÍSTICAS DE LASA COLONIAS MICROORGANISM
O
5
http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/metodesteril.pdf : “Método estéril y Medios de cultivo” por la Prof. Sofía
Gutiérrez de Gamboa
9

10. Puntiformes, rosa pálido, opacas y Estafilococos
escasas
MEDIO BASAL O/F (DE HUGH Y LEIFSON)
Para identificar bacilos NO fermentadores de importancia médica y sanitaria, principalmente
El medio Hugh y Leifson se emplea extensamente, junto con otros medios de diferenciación, para identificar al
numeroso grupo de bacilos Gram negativos NO fermentadores de carbohidratos, por medio de las reacciones de
oxidación y/o de fermentación de los mismos. Estos bacilos predominantemente oportunistas que pueden provocar
infecciones intrahospitalarias serias, por ejemplo las causadas por Pseudomonas.
Sin duda alguna, una de las pruebas más importantes para el estudio de los bacilos NO fermentadores de
carbohidratos, fue introducida en 1953 por Hugh y Leifson cuyo medio permite conocer si el germen en cuestión oxida,
fermenta o no al hidrato de carbono agregado al mismo.
Se encontró que el al contenido de peptonas (1%) en los medios usuales utilizados en el estudio de las fermentaciones,
producían al ser degradadas, la suficiente cantidad de aminas alcalinas para neutralizar y enmascarar a la pequeña
cantidad de ácidos formados por los microorganismo oxidativos.
Bajando la concentración de peptona al 0.2% se podría determinar si el carbohidrato contenido en el medio era o no
atacado por las bacterias en estudio.
Los azucares que mas se emplean son la glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y xilosa.
Formula aproximada en gramos por litro:
Peptona de Caseína.................................2.0
Cloruro de sodio........................................5.0
Fosfato Dipotásico.....................................0.30
Agar............................................................2.5
Azul de Bromotimol.....................................0.03
Preparación:
Suspender 9.8g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia
hasta disolución del material. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Agregar 10 ml de solución de
glucosa al 10% esterilizada por filtración por cada 100 ml del medio fluido. Mezclar y distribuir asépticamente a razón de
5 ml por tubo. Si prefiere, puede agregarse directamente 1.0 g del carbohidrato a cada 100 ml del medio 1.0g del
carbohidrato a cada 100 ml del medio y esterilizar en autoclave a 118ºC durante 10 minutos, a fin de evitar la
degradación del azúcar. El medio tiene un color verde.
Usos:
Inocular 2 tubos recientemente preparados, por punción profunda con el germen en estudio. Si el medio ya tiene cierto
tiempo de preparación, fundirlo en baño María para eliminar los gases disueltos.
Agregarle a un de los tubos una vez inoculado, una cepa de 4 a 5 mm de petrolato, aceite de parafina o vaspar estériles.
No es recomendable el uso de aceite mineral. Incubar ambos tubos a 35% durante 48 horas o mas. Se puede observar
la producción de ácido por el cambio al color amarillo del medio, la formación de gas por la presencia de burbujas, y la
movilidad o inmovilidad del microorganismo. Los cambios se aprecian mejor comparando los tubos inoculados con uno
que no lo hayas sido, que funcionará como control.
Para facilitar la identificación del grupo de bacilos Gram negativos NO fermentadores, utilizar también el Agar Diferencial
de Sellers y el Medio del indol Nitrito.
Resultados:
Color amarillo en ambos tubos con o sin formación de gas: Carbohidrato fermentado. Degradación fermentativa.
Cambio únicamente en el tubo que no contiene aceite: Oxidación de azúcar. Degradación oxidativa.
Sin cambio en ninguno de los tubos: Microorganismos inertes. El carbohidrato no ha sido fermentado ni oxidado.
AGAR SAL Y MANITOL
Aislamiento de estafilococos
10

11. Es un medio selectivo muy empleado para aislar estafilococos patógenos de materiales clínicos diversos. También se
utiliza en la industria alimenticia con los mismos fines, el aislamiento e identificación de Estafilococos que se encuentran
en la leche y productos lácteos, carnes y derivados cárnicos incluyendo conservas de pescado.
Formula aproximada en gramos por litro:
Extracto de carne......................................1.0
Mezcla de peptonas...................................10.0
Cloruro de sodio........................................75.0
D-Manitol...................................................10.0
Agar............................................................15.0
Rojo de fenol...............................................0.025
Preparación:
Suspender 111g. del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos 15 minutos. Mezclar bien y
calentar a ebullición durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Vaciar en cajas de petri.
Usos:
La degradación del manitol con producción de ácido cambia el color del medio, de rosado a amarillo. Debido a su alto
contenido de cloruro de sodio, puede hacerse una siembra masiva del material en estudio. Generalmente se incuban las
placas unas 36 hrs., apareciendo las colonias de estafilococos no patógenos de tamaño pequeño y rodeadas de una
zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patógenos fermentadores del manitol, dan colonias más grandes y
rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos no patógenos de tamaño pequeño y rodeadas de
una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patógenos fermentadores del manitol, dan colonias más grandes
y rodeadas de una zona amarilla. Si agregamos a cada litro del medio, una yema de huevo en condiciones de
esterilidad, los estafilococos, que además de fermentar el manitol producen lipasa, darán un precipitado amarillento de
ácidos grasos alrededor de la colonia. Este fenómeno concuerda bastante bien con la propiedad de coagular el plasma
que presentan los estafilococos patógenos coagulasa positivos.
BASE DE AGAR SANGRE
Aislamiento, cultivo y actividad hemolítica de gérmenes difíciles
La base de Agar Sangre es adecuada para aislar y cultivar diversos microorganismos de difícil crecimiento. Al añadir
sangre es adecuada para aislar bacilos tuberculosis.
Preparación:
Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante un
minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.
Después de esto enfriar a 4 –50ºC y añadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estéril, homogenizar y vaciar en cajas de
petri estériles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo.
También es posible inocular el fondo de una caja petri estéril con un pequeño inóculo, y vaciar posteriormente el medio
fundido a unos 50ºC; la caja se hace girar suavemente para homogenizar la muestra.
En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapón de rosca que se pueden inocular y
posteriormente vaciar en cajas de petri estériles
Usos:
Para el aislamiento del Mycobacterium tuberculosis, la base de agar sangre con 0.1% de glicerol, 2.5% de sangre
humana de banco de sangre y 100 unidades de penicilina por mililitro ha dado resultados comparables con los del
medio de Lowenstein-Jensen.
La base de agar Sangre también puede usarse para la preparación de antígenos.
BASE DE CALDO ROJO FENOL
Fermentación de carbohidratos; Medio usado para determinar las reacciones de fermentaciones.
Formula aproximada en gramos por litro:
Peptona de caseína.................................10g
Cloruro de sodio........................................5g
Rojo de fenol.............................................0.018g
pH final 7.4+-0.2
Preparación:
11

12. Disolver 15 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, agregar si se desea de 5 a 10 g de carbohidratos. Se
puede agregar de 0.5 a 1.0 g de agar si el medio va a ser destinada al cultivo de organismos anaerobios.
Si se desea investigar la formación de gases, emplear tubos Durham. Colocar los tubos en un recipiente adecuado y
esterilizar de 116 a 118ºC durante 15 minutos.
Usos:
El base de caldo rojo de fenol puede usarse en los estudios de fermentación de muchas especies bacterianas.
Los tubos de control sin carbohidratos deben inocularse e incubarse en paralelo con las pruebas de fermentación.
Deben examinarse los cultivos frecuentemente ya que los diferentes carbohidratos pueden ser utilizados a velocidades
variables.
La aparición de color amarillo es indicio de fermentación.
Para el cultivo de microorganismos anaerobios, el medio debe estar preparado recientemente o calentarse y enfriarse
antes de su uso.
AGAR MUELLER HINTON
Pruebas de sensibilidad a antibióticos y cultivo de Neisseria
En un medio muy rico en nutrientes que se recomienda para el aislamiento y desarrollo de gonococos y meningococos.
También se emplea, sobre todo, en las pruebas de sensibilidad (antibiogramas)
Formula aproximada en gramos por litro:
Infusión de carne de res.......................................300.0
Peptona de caseína Ácida....................................17.5
Almidón.................................................................1.5
Agar.......................................................................17
pH final.................................................................. 7.4 +- 0.2
Preparación:
Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien
agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, y esterilizar a 121ºC por un tiempo no mayor de 15 minutos.
Enfriar a 40-45ºC y vaciar en cajas de petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar “chocolote”, previa
adicción de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en baño María a 80ºC 10 minutos. No
sobrecalentar el medio en ningún momento.
Usos:
Es un medio útil para el desarrollo de bacterias del genero Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a 35ºC, en
atmósfera de CO2. El medio deberá mantenerse húmedo en su superficie; esto puede lograrse si dentro de la jarra,
envases de hojalata, frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una esponja o algodón húmedo y una vela
encendida, cerrando luego herméticamente.
Para realizar las pruebas de sensibilidad con sulfonamidas, las cajas deben examinarse después de 12 a 18 horas de
incubación. Después de este tiempo se tendrán que revisar periódicamente las zonas de inhibición ya que el
microorganismo puede desarrollar cuando la concentración del agente antimicrobiano comienza a disminuir.
Se obtiene mejores resultados para aislar Neisserias patógenas preparando un agar chocolate con el Mueller Hinton
adicionándole a cada 100 ml del medio terminado y fluido 1.0 ml de la suspensión VCN, mas 1.0 ml del
polienriquecimiento.
AGAR TCBS
Para cultivar Vibirios selectivamente; Para el aislamiento selectivo de vibrios patógenos a partir de materiales clínicos,
aguas y alimentos.
Formula aproximada en gramos por litros:
Extracto de levadura......................................5.0
Mezcla de peptonas......................................10.0
Citrato de sodio.............................................10.0
Tiosulfato de sodio........................................10.0
Bilis de buey..................................................5.0
Colato de sodio..............................................3.0
Sacarosa........................................................20.0
12

13. Cloruro de sodio............................................10.0
Citrato de hierro.............................................. 1.0
Azul de timol....................................................0.04
Azul de bromotimol........................................0.04
Agar................................................................14.0
Preparación
Suspender 86 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y
hervir durante un minuto. Enfriar entre 45-50ºC y vaciar en cajas de petri. No esterilizar en autoclave.
Usos:
Se emplea ampliamente para aislar y cultivar diversas especies del género Vibrio que pueden provocar cólera, diarreas
coliformes e intoxicaciones por alimentos contaminados. Las 2 últimas afecciones provocadas sobre todo, a partir de
diversos pescados y mariscos que se ingieren crudos o semicudos y que pueden ser causadas por Vibrio
parahemolyticus.
El agar TCBS, es altamente inhibitorio para las Enterobacterias, incluyendo coliformes y proteus. Los Enterococos son
también inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferación de los Vibrios, como el
antes mencionado, el V. Cholerae y el V. Alginolyticus.
El agar TCBS, es altamente inhibitorio para las enterobacterias, incluyendo coliformes y Proteus. Los enterococos son
también inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferación de los vibrios, como el
antes mencionado, el V. Cholerae y el V. Alginolyticus.
El material sospechoso, se siembra masivamente por estría superficial y se incuba a 35ºC, de 18 a 24 horas.
Casi todos los vibrios fermentan la sacarosa y dan colonias amarillentas por la producción de acido.
Algunas cepas de Proteus fermentadores de la sacarosa pueden formar colonias amarillentas similares a las de los
vibrios.6
AGAR
Su composición es en base de polímero de galactosa y acido poligalacturónico; su fuente es algas marinas
(Rodófitas), su enzima catabólica es agarasa. El agar nutritivo es usado como medio de cultivo para el crecimiento de
bacterias y hongos, pero no para virus (aunque los virus bacteriófagos crecen frecuentemente en bacterias cultivadas en
agar).7
MEDIO DE STUART
Está descrito como un medio de transporte eficaz para la recuperación y viabilidad de microorganismos como
Pneumococo, Strep.pyogenes , N. Gonnorrhoeae,Haemophilus sp. Y otros microorganismos lábiles. Se utiliza también
para el transporte de muestras de secreciones oculares, óticas, heridas y abscesos. Los microorganismos permanecen
viables de 6 días a 8 semanas. Se recomienda para la toma de muestras en sitios estériles.
MEDIO DE CARY-BLAIR
Se utiliza para el transporte de muestras fecales o raspados réctales para Coprocultivo. Se recomienda este medio, ya
que permite el desarrollo de Salmonellas y Shigellas aún después de 49 días a 28ºC, Vibriones y campylobacter
permanecen viables hasta por 22 días a 28ºC.8
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Prueba de Coagulasa:
La coagulasa es una proteína de composición química desconocida y que resulta relativamente termoestable, ya que
resiste temperaturas de hasta 60ºC durante 30 minutos; es muy sensible a la acción de enzimas proteoliicas y, como
posee una actividad similar a la de la protrombina (que la capacita para convertir el fibrinógeno en fibrina, aún cuando en
el medio de reacción se encuentren ciertas sustancias anticoagulantes), permiten que el infectólogo lo detecte mediante
reacciones simples.
6
Manual Bioxon, p.p 26, 28, 29, 33, 39, 41, 52
7
www.wikipedia.org
8
http://www.lablinsan.cl/productos/page8.html
13

14. En cuanto a su función in vivo, ésta consiste principalmente en interferir la fagocitosis, debido a que genera la
producción de redes de fibrina alrededor de los microorganismos, impidiendo que el fagocito entre en contacto con ellos
para englobarlos; sin embargo, al parecer también neutralizar la actividad antimicrobiana que el suero normal manifiesta
contra los agentes infectantes.
Tocante a su mecanismo de acción, existen evidencias de que la coagulasa puede inducir la activación de un
mecanismo alterno de coagulación, habilitando a un componente del plasma, denominado factor reactivo de la
coagulasa o FRC, para convertir el fibrinógeno en fibrina.
De hecho, se sugiere que la coagulasa es una sustancia muy parecida a la protrombina que, al reaccionar con el FRC,
forma un compuesto muy parecido a la trombina. Este paso es el decisivo por que, como es sabido, es la trombina la
que activa al fibrinógeno para formar fibrina en el proceso normal de la coagulación.
De acuerdo a lo anterior, la coagulasa origina la coagulación del plasma en dos pasos: inicialmente se verifica una
reacción entre la enzima producida por el microorganismo y el FRC y posteriormente, las redes de fibrina son
producidas por efecto del complejo formado en el paso anterior.
Recordando el proceso que se efectúa en la última etapa de la coagulación sanguínea en el organismo, es posible
relacionar el mecanismo asociado a la enzima estafilococcica
Otro aspecto importante en la realización de la prueba, radica en la elección del plasma que se va a emplear; debe
considerarse principalmente su origen, ya que se ha encontrado que algunas cepas presentan resultados positivos con
el humano y el de conejo, pero negativos con el bovino.
La reacción se considerará positiva si ocurre cualquier grado de coagulación visible dentro del tubo. Las bacterias
coagulasa fuertemente positiva pueden producir el coagulo dentro de las primeras cuatro horas, razón por la que es
recomendable leer el resultado en intervalos de 30 minutos, ya que S. aureus también produce fibrinolisinas, y la acción
de éstas puede destruir el coágulo, provocando la obtención de resultados falsos negativos cuando se toman lapsos
mayores. Otras cepas de S.aureus sólo son capaces de producir suficiente cantidad de coagulasa hasta que transcurren
cerca de 18 h. Por tal motivo, es conveniente revisar nuevamente a las 24 h los cultivos que en los primeros tiempos se
observen como coagulasa negativa.
Es importante hacer notar que, a mayor virulencia de la cepa analizada, menor será el tiempo en que la prueba será
positiva. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus
(coagulasa positivo) de otros Staphylococcus.
Principio
La coagulasa se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que
requieren el uso de técnicas de determinación diferentes:
Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija está unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina
formados entre las células suspendidas en plasma (que contiene fibrinógeno) provocan su aglutinación, indicada por la
presencia de agregados visibles en el portaobjetos.
Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de
cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un
tubo de ensayo, se forma un coágulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del
plasma de manera similar a cuando se añade trombina.
Medios y reactivos
Plasma coagulasa (Difco, o BBL)
Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente.
Procedimiento
Prueba en portaobjetos
Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos
Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensión cargada
homogénea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensión del m.o. Mezclar bien con el asa.
Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos
blancos.
Prueba en tubo
Colocar asépticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estéril.
Añadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensión en suero fisiológico de un cultivo en placa).
14

15. Mezclar por rotación el tubo, evitando remover o agitar el contenido.
Colocar en baño de agua a 37°C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formación de un coágulo
visible.
Interpretación
Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparición de un
precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Esta prueba es
solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardíos deben verificarse mediante la
prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija.
Prueba en tubos:
1+: pequeños coágulos no organizados.
2+: pequeños coágulos organizados.
3+: gran coágulo organizado.
4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo.
Se consideran positivos los grados 3+ y 4+
Controles
Positivo: S.aureus
Negativo: S.epidermidis:
Prueba de catalasa
La catalasa es una enzima que descompone al peroxido de hidrógeno (H 2O2) en oxigeno y agua. Químicamente es una
hemoproteina bastante similar a la hemoglobina lo están en estado reducido (Fe++). Exceptuando a los estreptococos y
a gardnerella vaginalis, las bacterias aerobias y facultativas poseen esta enzima, no así la mayoría de las anaerobias
que, con el objetivo de llevar a cabo la degradación del mismo sustrato, producen la peroxidasa.
Dentro del laboratorio de Bacteriología, la prueba de la catalasa se utiliza generalmente para diferenciar al género
Streptococcus (-) del Staphylococcus (+) y, con menor frecuencia, para hacerlo entre las especies de bacilos Gram
positivos y entre las micobacterias. Para llevarla acabo es necesario disponer, por un lado, de una solución de peróxido
de hidrógeno al 30 % y por otro, de un cultivo puro de 18-24 h del microorganismo por probar, contenido en una caja de
Petri o bien en tubos de ensayo exentos de sangre, toda vez que los eritrocitos poseen esta actividad enzimática.
El procedimiento más sencillo y rápido incluye el uso de un portaobjetos, en el cual se colocan, primeramente, una
asada del microorganismo y posteriormente, se vierten sobre ésta una o dos gotas de la solución que está en contacto
con las células, se empiecen a notar burbujas ocasionadas por el O2 que se desprende. 9
Prueba de oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia
de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que
produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de
electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en
los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus),
pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción
de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del
oxígeno y cuya acumulación es tóxica.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
Identificar todas las especies de Neisseria (+)
Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.
9
Manual de practicas Bacteriología; Q.F.B. R. Garza Velasco; departamento de Biología; facultad de Química,
UNAM. p.p 7-21
15

16. El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina
(reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de
Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira
gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
Realización de la prueba:
1. Método en placa directa
Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.
Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos,
mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.
1. Método indirecto sobre papel
Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.
Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos. 10
TINCIÓN DE GRAM
La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares y
reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes
infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la
muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en
la composición de su pared y arquitectura celular.
Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son
afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y
visualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared
celular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad celular…).
Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa
por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración,
permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante.
Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el cristal violeta como colorante
inicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsina
básica como contracolorante.
Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser
tenidas en cuenta antes de su realización, a saber:
· Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solución de cristal violeta. Si los hay,
filtrar antes de su uso.
· La estabilidad de la solución de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina básica es de 1 año y la de la
solución de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados (la evaporación puede alterar su efectividad)
a temperatura ambiente.
· Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sería diariamente, preparar tinciones con cepas de colección de E.coli,
S.aureus o S.epidermidis para comprobar los resultados esperados.
· Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretación microscópica de la tinción, como son la
preparación de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados,
sobrecalentamiento en la fijación y excesivos lavados durante la tinción. Todos los anteriores son causas comunes de
pobres resultados en la tinción de Gram.
· Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tinción pueden ser cultivados, y al
contrario, algunos no observados pero presentes consiguen ser recuperados en el cultivo.
· Supervisión diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal especializado, para confirmación de
coincidencias y posibles discrepancias.
Otras consideraciones importantes que deben ser revisadas e inspeccionadas por microscopía tras la realización de la
tinción son:
10
http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/oxidasa.htm
16

17.  Como regla para evidenciar una buena decoloración, y teniendo en cuenta la fuente de la muestra, el fondo de la
tinción deberá ser claro o ligeramente gram (-). Si hay leucocitos se observarán completamente gram (-), y si hay
levaduras tipo Candida completamente gram (+).
 Para una buena interpretación de la tinción, el grosor de la extensión no debe permitir que aparezcan más de 2 células
solapadas unas encima de otras.
 Examinar la tinción en busca de evidencias de inflamación (células polimorfonucleadas, células mononucleadas y/o
hematíes). La presencia de células epiteliales, bacterias de la flora, restos alimenticios…, según el producto patológico
que estemos observando, pueden indicar una mala obtención de éste.
 Inspeccionar distintas áreas de la tinción en busca de microorganismos. Prestar más atención en aquellas tinciones con
signos de inflamación de pacientes inmunocompetentes, que en aquellas en donde no se observen éstos. Si no se
detectan se indicará como “No se observan microorganismos”. Si se observan, se informará su número relativo, el tipo
de microorganismo y su reacción gram. Se debe ser cuidadoso al informar si solo se observa 1 ó muy pocos
(especialmente si no existen signos de inflamación), ya que los recipientes de recogida de muestras, los portas y
algunos cultivos pueden contener bacterias no viables ni significativas pero contaminantes que nos aparecerán en la
tinción.
En cuanto a la reacción gram y características morfológicas de los microorganismos visualizados, estas son:
Gram:
 Positivo: de violeta fuerte a azul claro.
 Negativo: rosa o rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo será intenso).
 Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser debido a una mala extensión, fijación
o tinción, presencia de células viejas, daño en la pared celular o por particularidades especiales de la pared
celular de ciertos microorganismos.
 Neutro: no toman ningún color, siendo generalmente el fondo alrededor de ellos de un ligero gram (-). Los
microorganismos pueden ser intracelulares. Esta reacción gram ha sido vista en tinciones de muestras clínicas
en donde están presentes elementos fúngicos o algunas especies de micobacterias.
 Otras características: a examinar en el gram son si la tinción de los microorganismos es homogénea, bipolar,
en cuentas o gotas, punteada, en barras o irregular.
Formas:
 Totales: cocos, cocoides, cocobacilares, bacilos, filamentosos (ramificados o no) y levaduriformes.
Extremos: redondeados, afilados, romos, en forma de palo de tambor o inflado (por vacuolas, esporas,
acúmulos de cualquier naturaleza…) y cóncavos.
 Lados: paralelos, ovoides, cóncavos e irregulares.
 Eje mayor: recto, curvado o en espiral.
 Pleomorfismos: variación en la forma de un mismo conjunto de microorganismos. Ocurre en algunas especies
de difteromorfos, Bacteroides spp., filamentosos ramificados (Actinomyces spp,…), por tratamientos
antibióticos.
Tamaños: teniendo en cuenta que el tamaño medio de un hematíe es de 7 mm y el de los gránulos citoplasmáticos de
los leucocitos polimnorfonucleares son de 0,2-0,3 mm:
 Totales: minúsculo (< 0,3 mm), pequeño (0,3-0,5 mm), medio y grande.
 Longitud: corto (0,5-1 mm), medio, largo y filamentoso (10-30 mm).
 Anchura: delgado, medio y grueso.
 Pleomórficos: variación en el tamaño de un mismo conjunto de bacterias.
Características agrupacionales: microorganismos aislados, en pares, en cadenas, tétradas, en grupo o arracimados,
en empalizada, en letras chinas, empaquetados, en formas angulares tipo V o L .11
TOMA DE MUESTRA
11
http://www.a14.san.gva.es/labm/gram.htm
17

18. Consideraciones generales para la toma de muestra:
1. Debemos saber QUE vamos a tomar como muestra (esputo, sangre, etc.)
2. PORQUE vamos a tomar la muestra (con fines de diagnostico, investigación)
3. COMO vamos a tomar la muestra (punción, raspado, etc.)
4. DONDE vamos a tomar la muestra (piel, faringe, etc.)
5. CUANDO vamos a tomar la muestra (ayuno, etc.)
Características de una muestra:
 Ser obtenida del lugar donde asiente la patología.
 Generalmente tomada de los bordes de la lesión.
 Ser cualitativamente optima para su estudio.
 Alcanzar cuantitativamente un volumen razonable
 En la mayoría de los casos ser de emisión reciente.
 En algunos casos haber sido obtenida cuando el paciente esta atravesando determinadas instancias evolutivas de
su patología.
 Obtenida siguiendo criterios anatómicos y funcionales.
 Perfectamente envasada, evitando recipientes que potencialmente puedan producir contaminaciones accidentales.
 Enviada inmediatamente al laboratorio para su estudio o si tiene que transcurrir algún tiempo será enviada en
recipientes especiales o en medios de cultivo de transporte.
 Obtenida con material esterilizado y en condiciones de asepsia.
Procedimiento para la toma de muestras:
Instrucciones generales y específicas a seguir para lograr una buena toma de muestras.
 La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos, ya que este interfiere en la
observación directa del germen, así como en posterior aislamiento del mismo en los medios de cultivo.
 La toma de muestras debe realizarse en los lugares donde sea más probable es encontrar el microorganismo con la
menor contaminación externa posible.
 Recoger la muestra en el estadio de la enfermedad más apropiado.
 Las muestras deben recoger es cantidades suficientes para permitir un examen completo; deben colocarse en
recipientes estériles y remitirse lo más pronto posible el laboratorio.
 Es un requisito indispensable que el laboratorio recibe la suficiente o técnicas adecuas.
 El personal debe rechazar las muestras que no se han recogido de forma adecuada y los especialistas deben
apoyar esta actitud.
 Recordando:
La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano.
Es muy importante seguir las normas necesarias para evitar la contaminación externa.
La cantidad debe ser suficiente y es fundamental que se utilice un recipiente.
Clasificación de la toma de muestras:
Se clasifican en:
1. MUESTRAS SUPERFICIALES
2. MUESTRAS DE CAVIDADES
3. MUESTRAS ESPECIALES.
4. MUESTRAS ESPECÍFICAS
1) MUESTRA SUPERFICIALES: Aquí consignamos a las muestras de la piel, pelo, uñas.
℘ PIEL: Tenemos dos posibilidades de obtener la muestra, ya sea procediendo a alzar a los gérmenes con el asa
bacteriología, por simple raspado ligero o con la ayuda de bisturí proceder a raspar algo energéticamente los bordes
de la lesión, de manera no solo obtendremos los microorganismos sino también las capas superficiales de la piel,
esto es provechoso en el caso de ciertas determinaciones.
Finalmente puede ser que en determinados casos se pretenden nódulos los cuales están por debajo de la piel, siendo
más palpable que visibles; en este caso procedemos también a raspar con el bisturí el lugar de la lesión llegando hasta
el nódulo de manera que una vez obtenida la pulpa, esta puede ser procesada y así llegar a observar al microbio.
℘ PELO: También hay dos posibilidades, la primera cuando los gérmenes se hallan localizados en el folículo piloso, en
este caso será suficiente proceder a raspar la región con el asa bacteríol6gíca previo de la zona con agua destilada,
también se podrá arrancar el pelo a fin de aislar al germen a partir del folículo piloso.
18

19. La segunda posibilidad se vera cuando el tallo del pelo este atacado (micosis) en esta situación procederá acortar el
pelo para su observación o posterior procesamiento en cultivo.
℘ UÑAS: Se utilizan dos técnicas, de acuerdo al sitio atacado. La primera se utiliza cuando la lesión asienta en el
lecho ungueal, en esta técnica desplazamos el asa bacteriológica, previo lavado de la región con agua destilada
por el lecho ungueal con un solo trazo firme y seguro.
Si la uña se halla atacada por microorganismos (hongos) entonces procedemos a cortar ayudados de un bisturí a fin de
continuar luego con el cultivo y el diagnostico a través de la microscopia.
1) MUESTRA DE CAVIDADES: Consignamos las muestras de mucosas, conducto auditivo externo, esputo, orina,
heces fecales.
℘ MUCOSAS.- El instrumento que sirve de como denominador en la obtención de estas muestras es el hisopo, es
decir un aplicada de madera que posee es uno de sus extremos un engrosamiento de algodón y que obviamente
debe ser esterilizado. Si vamos describiendo las mucosas de arriba hacia abajo, encontramos lo siguiente:
℘ MUCOSAS CONJUNTIVAL.- Usamos un hiposo estéril aunque algunas escuelas prefieren utilizar el asa
bacteriológica, luego ubicamos la conjuntiva infectada o aquella que presente mayor exudado si la muestra a nivel
del ángulo interno del ojo afectado. El hisopado debe ser cuidadoso y suave para rió producir mayor traumatismo.
℘ MUCOSA NASAL.- De igual forma utilizamos un hisopo si la lesión es visible a simple vista procedemos entonces a
obtener la muestra, si la lesión es mucho más interna. Entonces será necesario que un especialista la obtenga con
instrumental que nosotros ya no poseemos. Hay otras oportunidades en que es preciso utilizar un cincel delgado y
largo que podemos fabricar a partir de un sujetador de papel (clip) el cual es convertido en alambre rectilíneo y
posteriormente aplastando uno de los extremos obtendremos un pequeño cincel, con el cual y una vez esterilizado
procedemos a raspar lesiones sospechosas.
℘ MUCOSA ORAL.- En esta cavidad es sencillo tomar cualquier nuestra pues tenemos gran visibilidad Allí podemos
observar donde se localizan una lesión y posteriormente utilizando el hisopo llevar a cabo la toma de muestra. Por
otra parte para fines de investigación podemos escoger cualquier segmento de la mucosa oral puesto, que esta
posee una flora variada de microorganismos.
℘ MUCOSA GENITAL FEMENINA.- Aun debemos considerar dos posibilidades más y son aquellas que se presentan
en el caso de una mujer con himen intacto y otra que haya tenido contacto sexual. En la mujer con himen intacto tan
solo debemos esperar que las secreciones se viabilicen al exterior para así ser obtenidas. En la mujer desflorada
utilizaremos el especulo es decir dos valvas que una vez introducidas en el canal vaginal pueden ser separadas a
voluntad, brindándonos de esta forma un campo de acción y observación ideales luego procederemos a hisopar las
regiones escogidas, haciendo hincapié en las vecindades del orificio cervical externo, pues allí se acumularan las
secreciones.
3) MUESTRAS ESPECIALES.
℘ ESPUTO.- El esputo es la colección de secreciones patológicas provenientes del árbol traqueo-bronquial. La
muestra podemos obtenerla a través de diferentes técnicas, entre las cuales citaremos las más importantes:
Forma natural de eliminación del esputo: Esta es la técnica más utilizada, se aplica a pacientes que pueden
entender y aplicar las instrucciones que se les dé.
Entregamos al paciente un recipiente especial para esta muestra y le indicamos que al despertara proceda a realizar
un enjuague bucal con un antiséptico, luego debe proceder a expectorar directamente dentro de recipiente, llegando a
acumular por lo menos tres esputos (flemas).
Posteriormente se sierra herméticamente el envase y deberá ser enviado a laboratorio debidamente rotulado (nombre
completo, edad y sexo) además de la numeración correspondiente y fecha.
Lavado gástrico: Esta técnica se práctica en pacientes que no van ha poder realizar lo anterior, los niños (por que
degluten el esputo), ancianos, enfermos mentales finalmente mujeres (por que también degluten el esputo.
Lavado traqueal: Esta técnica consiste en instalar suero fisiológico tibia hacia el árbol traqueo- bronquial de manera
que provoquemos el acceso de tos al despertar o excitar ese reflejo, en esa circunstancia debemos estar bien
protegidos con barbijo, gorro, mandil y guantes.
Forma postural: Este método también es útil en pacientes que no pueden eliminar en forma espontánea la muestra.
Procedemos a colocar al paciente en decúbito ventral sobre una camilla (o cualquier superficial que cumpla la misma
función) con una almohada debajo de ala región abdominal finalmente la cabeza queda colgado en una de los
extremos la camilla al igual que los brazos lateralmente: de esta forma por simple acción de la gravedad la
secreciones se viabilizaran al exterior, directamente al recipiente
℘ RECOGIDA DE ORINA. - La toma de muestras se realizará en un frasco estéril que no deberá abrirse antes de la
recogida. La recogida de orina puede realizarse de tres formas:
Recogida de la porción media de la micción: Es aconsejable que la orina recogida sea de la primera hora de la
mañana. El paciente debe lavarse meticulosamente los genitales externos con agua y jabón enjugándose finalmente
con agua limpia. Iniciará la micción despreciándose la primera parte. A continuación, y sin detener la micción, debe
19

20. recogerse la segunda mitad de la misma en un frasco estéril de unos 20, 35 m1 evitando tocara el interior o borde de
1 frasco.
Sondaje vesical o punción de sonda: El sondaje vesical debe utilizárselo menos posible ya que con lleva el riesgo de
provocar una infección por introducir microorganismos del exterior. Se efectuara en condiciones de rigurosa asepsia y
por personal cualificado.
El enfermo portadores de sonda permanente debe recogerse la muestra a trabes de la sonda y nunca directamente
de la bolsa.
Punción suprapúvica: Esta técnica permite extraer la orina directamente de la vejiga mediante una jeringa con aguja
asegurando una muestra libre de contaminaciones. Este método puede realizarse con muy poco riesgo en lactantes,
niños y adultos con vejiga llena.
Dado que la orina es un excelente medio de cultivo para la mayor parte de las bacterias, la muestra debe refrigerarse
inmediatamente después de la extracción.
A 40º C el recuadro de bacterias permanece constante durante 24 horas.
♦ Técnica de recolección en 24 horas: Se usa cuando la patología esta situada en los riñones. Consiste en recolectar
durante 24 horas toda la orina eliminada de manera que aumentemos las posibilidades de coleccionar el agente
etiológico.
Características del recipiente para recolectar orina.
a. La capacidad mínima es de 250 cc.
b. Debe poseer boca ancha.
c. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con este sistema.
d. Debe ser estéril.
e. Debe ser construido de material susceptible de esterilización.
f. De preferencia será transparente a fin de observar ciertas características macroscópicas.
g. Tiene que consignar el nombre, edad, sexo del paciente, además de la fecha y el correspondiente número de
registro.
℘ HECES FECALES.- Tenemos dos posibilidades: heces diarreicas y heces sólidas.
Heces diarreicas: En este caso obtenemos un volumen similar al de una cuchara sopera lo que más o menos viene a
ser una cantidad de 10 cc. Estas muestras deben procesarse dentro de un margen de tiempo prudencial pues al
acidificarse muchos gérmenes patógenos se lisan.
Heces sólidas: Se toma un volumen similar al de una semilla de durazno.
Características del recipiente para recolectar heces fecales.
a. La capacidad mínima es de 30 ml
b. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con este sistema, o en su defecto un tapón que asegure
herméticamente.
c. En lo posible debe ser estéril, aunque se puede utilizar un envase bien lavado.
d. Podrá ser construido de material susceptible de esterilización, (polipropileno, policarbonato, vidrio)
e. No debe ser fabricado de cartón pues deshidrata la muestra. En último caso se podrá utilizar recipientes de cartón
parafinado.
f. Tiene que consignar el nombre, edad, sexo del paciente, además de la fecha y el correspondiente número de registro.
4) MUESTRAS ESPECÍFICAS
℘ EXTRACCIÓN DE SANGRE PARA CULTIVOS: La técnica de extracción consta de una serie de pasos que deben
rigurosamente, con objeto de reducir al máximo el riesgo de contaminación.
Colocar una ligadura en el antebrazo.
Escoger la vena tocando la piel antes de la desinfección.
Limpiar la piel con alcohol (70%) sobre el sitio de la venopuntura en un área se unos 5 cm. frotando vigorosamente.
Aplicar yodo-povi dona (2 %) desde el centro hacia afuera, hasta haber saturado todo el círculo. Se dejara que el yodo
se seque, durante un minuto como mínimo, Este tiempo es fundamental y se debe cronometrar.
Si después de desinfectada, el flebotomista debe tocar la piel, deberá desinfectarse los dedos que va a usar para la
palpación o bien utilizar guantes estériles.
Se insertara la aguja en la vena a y se realizara la extracción. Se cambiaran las agujas antes de inyectar la sangre en
las botellas de cultivo.
Después e retirar la aguja, la piel del paciente se desinfectara otra ves con alcohol al 70%, ya que muchos enfermos
son sensibles al yodo.
 Una vez inoculadas, las botellas de hemocultivos deben remitirse inmediatamente al laboratorio para iniciar lo más
pronto posible su procesamiento.
20

21. ∼No es aconsejable extraer sangre a través de una derivación 0 catéter, ya que estos dispositivos pueden estará
colonizados por bacterias que no están presentes en la sangre el paciente por lo tanto, estos hemocultivos
podrían dar resultados falsos positivos.
∼También se aconseja realizar la toma por debajo de las tubuladuras intravenosas ya que la sangre tomada por
encima e ella estará diluida por el líquido transfundido.
∼Se recomienda 3 muestras en 24 h con un intervalo entre ellas superior a 1 h.
∼Sin embargo se acepta 2 o 3 extracciones separadas 30 min. Cada 24h, para cada hemocultivo, se extraerán lO
ml de sangre y se inoculará a partes iguales en dos frascos (5ml en cada uno) uno para aislamiento de gérmenes
aerobios y otro para anaerobios.
℘ LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO: Esta muestra se obtiene a partir de una punción lumbar que se practica entre el
3er. Y 4to. Espacio intervertebral lumbar.
Esta es una técnica práctica operatoria y se la debe realizar con todos los cuidados necesarios teniendo en cuenta las
contraindicaciones.
La cantidad necesaria es de 3 - 5ml. y siempre se debe realizar un estudio microscópico antes de entrar al estudio
microbiológico. La presión más importante es de procesar el liquido cefalorraquídeo dentro de un margen de tiempo
mínimo desde la toma de muestra, pues muchos gérmenes se lisan transcurrido cierto tiempo; dándonos de esta
manera un resultado negativo.
℘ MUESTRA CAPILAR: técnicas.
Realizar la antisepsia del lugar elegido (lóbulo de la oreja, pulpejo del dedo anular, planta del pie en lactantes.
Funcionar con rapidez y firmeza de tal manera que ingrese toda la punta de la lanceta.
Descartar la primera gota.
Recoger la sangre que fluye libremente llenando las tres cuartas partes del capilar.
Presionar suavemente el lugar de punción con un algodón empapado en alcohol.
La punción cutánea o capilar se emplea para:
∼ Frotis
∼Micro hematocrito
∼Grupo sanguíneo
∼Recuento de lóbulos blancos
∼Y otros.12
ANTIBIÓTICO
Sustancia química producida por ciertos microorganismos, que mata o inhibe el crecimiento de otro. Inhibe el
crecimiento o matan a otros microorganismos .Los antibióticos constituyen una clase especial de agentes
quimioterapeuticos , que se distinguen de los análogos de factores de crecimiento por que son productos naturales
(productos de la actividad microbiana ) ,son sustancias producidas en los procesos microbianos a gran escala .
ANTIBIOGRAMA
El medio de cultivo es sólido. Este sistema permite probar la eficacia de varios
antibióticos al mismo tiempo.; Sobre la superficie de una placa de agar se realiza
la siembra de una suspensión bacteriana calibrada y a continuación se depositan
sobre ella discos de papel de filtro impregnados de antimicrobianos (discos para
antibiograma disponibles en el comercio). Tan pronto como el disco toma
contacto con la superficie húmeda del agar, el agua es absorbida por el papel de
filtro y el antibiótico difunde hacia el medio circundante creando así
concentraciones progresivamente decrecientes. Se observa como a medida que
la distancia al disco aumenta hay una reducción logarítmica de la concentración
del antibiótico. Así, al cabo de 18 horas de incubación, en aquella zona donde el
antibiótico es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria aparece un halo
alrededor del disco: halo de inhibición.
El tamaño de la zona de inhibición depende de ciertas propiedades fisicoquímicas del antibiótico que influyen invitro
sobre la velocidad de difusión en agar y no están necesariamente relacionadas con la actividad terapéutica (in vivo) del
antibiótico.; La valoración de los halos se hacen por patrones obtenidos de forma que se hallan correlacionadas la CIM y
la carga antimicrobiana del disco con el diámetro del halo. Para ello es necesario determinar previamente en forma
individual la CIM y el halo de inhibición de un número amplio de cepas. Los resultados se representan en un sistema de
coordenadas que nos permite establecer una correspondencia para un antibiótico determinado. De esta forma midiendo
el diámetro del halo de inhibición de una cepa por el método del disco-placa, trasladamos este valor a la escala anterior
12
www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf
21

22. y podemos conocer su CIM. Pese a las limitaciones, esta técnica representa un avance ya que provee de resultados
estandarizados comparables entre los distintos laboratorios. 13
RESISTENCIA
Es la capacidad adquirida por un organismo para resistir los efectos de un antibiótico ante el cual es normalmente
susceptible ,esta resistencia se adquiere probablemente de los productores antibióticos ,a través de un proceso de
intercambio genético .Con el fin de protegerse a si mismo de los antibióticos que ellos producen , estos organismos
han desarrollado mecanismos para neutralizar o destruir sus propios antibióticos .
La existencia de estos genes significa que, bajo las condiciones adecuadas, es posible transferir esta resistencia a
otros organismos .Los mecanismos de resistencia a los antibióticos son por:
1) El organismo puede carecer de la estructura diana sobre la que actúa un antibiótico.
2) El organismo puede ser impermeable al antibiótico.
3) El organismo puede ser capaz de alterar en antibiótico pasándolo a una forma inactiva.
4) El organismo puede modificar la diana de un antibiótico.
5) Por intercambio genético, puede tener lugar la alteración de una vía metabólica que bloque al agente
antimicrobiano.
6) El organismo puede ser capaz de bombear hacia fuera el antibiótico que va entrando en la célula (eflujo).
La resistencia a los antibióticos puede estar codificada genéticamente por el microorganismo, bien en el cromosoma o
en los plasmados, los llamados plasmados de resistencia, los diferentes tipos específicos de resistencia tiene su base
genética en uno o en otros.
SENSIBILIDAD
Es la Administración de un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria exposición a un alergeno que da lugar a una
reacción exagerada La bacterias Gram. + son generalmente mas sensibles a los antibióticos que las bacterias Gram. -
Se puede medir fácilmente la sensibilidad de un cultivo por un método de difusión en agar o utilizando una técnica
de dilución en tubo para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM ) de un agente que inhiba el crecimiento.
El método de la CIM para el análisis de sensibilidad a los antibióticos conlleva un ensayo de dilución del antibiótico ya
se en tubos de cultivo o bien en pocillos de una placa de micro titulación .La prueba CIM ( método de Kirby-Bauer ).14
TABLAS DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
13
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp8.pdf
14
http://es.mimi.hu/medicina/antigeno.html
22

23. 23