Rapport TP de Microbielogie Réalisé par : NAIT-SI hassan et OUAFIK Naoufal

1. Faculté des sciences et techniques – Settat
Rapport de Microbiologie
Encadré par :
Réalisé par : Nait-si Hassan & Ouafik Naoufal

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I. Introduction :
Microbiologie est un domained’étudess’intéressant
aux Micro-organismes, en particulier auxbactéries, aux
protozoaires, auxvirus ainsiqu’à certains champignons
(levures)et algues unicellulairesde petitetaille.
Et dans laboratoiremicrobiologieest trouveplusieurs
déférentmatérielsdemandedans les analysesde certain
matièrevivantet devoirPour chaqueutilisateur
ensuivreles déférentesconditions au cours de leur
travail.
L’objectifde cet TP est familiarisel’étudiant avec un
laboratoire de microbiologie,son équipement et son
fonctionnement.

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II. Matériels utilises en MICROBIOLOGIE :
Bec bunsen. Autoclave.
Boîtes de Pétri. Anse.

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Flacon pour milieu de culture. Tube.
Etuve.

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III. Préparation d’un milieu de culture :
Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules,
de bactéries, de levures, de moisissures afin de permettre leur étude. En
principe, les cellules trouvent dans ce milieu les composants
indispensables pour leur multiplication en grand nombre, rapidement,
mais aussi parfois des éléments qui permettront de privilégier un genre
bactérien ou une famille. Ainsi, selon le but de la culture, il est possible
de placer les micro-organismes dans des conditions optimales, ou tout à
fait défavorables.
Il se compose d'une base (agar-agar, eau, minéraux...) ainsi que d'un
indicateur coloré de pH ou de réaction d'oxydo-réduction pour
permettre de formuler des hypothèses sur le genre.
Il existe aussi des bouillons de culture qui possèdent la même fonction,
mais ces milieux ne contiennent pas d'agar-agar,ils sont donc
totalement liquides.
 Préparation d’un milieu de culture (Gélose nutritive) :
 Tryptone : 5g
 Extrait de levure : 2.5g
 Glucose : 1g
 Agar : 15g/l
 Eau distillée : 250ml
On chauffe jusqu’à ébullition, ensuite on met les milieux de culture
dans l’autoclave pour les stériliser.

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On laisser les milieux dans l’autoclave 20min avec une température de
121°C.
Quand l’autoclavage prend fin :
 Ouvrir le flacon dans un périmètre stérile.
 Passer l’ouverture du flacon à la flamme.
 Verser le milieu dans la boite pétri.
 Passer l’ouverture du flacon à la flamme pour une 2ème fois.
 Fermer le flacon
 Laisser les boites refroidir à coté du bec bunsen.
 En fermer la boite pétri et on le met dans l’incubateur
IV. La stérilisation :
1. Définition :
La stérilisation est la destruction de toutes les formes viables de
vie, et l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un
objet, et ce de manière durable. En microbiologie, le but de la
stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-organismes
introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la
contamination du milieu extérieur et des personnes.
a) Méthodes physiques de stérilisation :
 Stérilisation à la chaleur :
La chaleur détruit les bactéries et les spores. On distingue les
procédés à chaleur « sèche » ou «humide».

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 Stérilisation à la chaleur sèche :
La « chaleur sèche » est efficace pour la stérilisation de la verrerie,
des pipettes et d'autres matériaux, solides, résistant à la chaleur. On
peut grouper sous ce titre :
 Le flambage
Le passage dans la flamme (bec BUNSEN) de la
surface de matériel non inflammable assure une
parfaite stérilisation. On stérilise de cette façon les
fils de platine et les pipettes Pasteur.
 Four pasteur :
C'est un four-étuve à air chaud et sec. Il est utilisé à180°C pendant
90 minutes. Cet appareil n'est utilisé que pour la stérilisation de la
verrerie préalablement nettoyée et séchée ou de matériels métalliques
(instruments de dissection) pouvant tolérer de très hautes
températures.
 Stérilisation à la chaleur humide :
Vapeur sous pression, le système de stérilisation le plus efficace est la
vapeur sous pression.
 Autoclavage :
Est conçu de telle façon que l'air présent à l'intérieur, après
fermeture,

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Soit chassé vers l'extérieur par la vapeur.
C’est un appareil indispensable dans un
laboratoire de microbiologie.
Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau,
à une température de 120°C pendant une durée qui
varie en fonction du milieu, de la température
utilisée et du volume des récipients. Ce procédé tue
toutes les cellules végétatives et les endospores.
Ébullition :
ne peut que difficilement assurer une stérilisation efficace. Toute fois
cette efficacité peut être améliorée par :
Chauffage de 2 mn à 62°C : c’est la pasteurisation.
 Stérilisation par filtration (agent mécanique) :
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à
travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 μm. Les micro-
organismes sont trop gros et sont donc retenus par le filtre. Cette
technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles
comme certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de
croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques.
 Stérilisation par les ultra-violets :
Ces radiations UV à courtes longueurs d'ondes sont létales pour les
micro-organismes et dangereuses pour de nombreux autres

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organismes. Ceci est à l'origine des inquiétudes causées par la
destruction de la couche d'ozone. Les lampes UV de ce type sont
placées dans des salles à désinfecter et des enceintes de sécurité pour
stériliser l'air.
b) Méthodes chimiques de stérilisation :
Certaines substances chimiques sont utilisées en microbiologie.
Il existe des agents qui ne tuent pas mais qui plutôt préviennent ou
inhibent la croissance. On les appelle agents bactériostatiques (pour
les bactéries) ou fongistatiques (pour les champignons). Et les
substances bactéricides sont destinées pour détruire les germes
microbiens.
V. 2ème séance :
 Nous Prenons notre Boite pétri.
 Nous devons diviser la boite en Deux partie une pour la main lavée
et l’autre pour la main non lavée.
 On fait passer la main non lavée sur la première partie de la boite
et la main lavée a l’autre partie de la boite pétri.
VI. 3éme Séance :
Lecture des résultats de la séance précédente avec quelques
remarques et conclusions.

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Pour les mains sales : le nombre est supérieur à 300 UFC, la plupart
des colonies sont jaunes, mais il y’a quelques une blanches de tailles
différentes.
Pour les mains propres : le nombre est presque celui des mains sales
- Explication : les mains n’ont pas été bien lavées avec de l’eau de javel,
Elles (mains) ont été essuyées dans la blouse qui contient beaucoup de
micro-organismes.
L’eau du robinet contient un grand nombre de micro-organismes.
 Technique d’isolement :
L’isolement permet d’obtenir une culture pure, indispensable à
toute étude et à toute identification bactériologique. Les produits
naturels sont à de rares exceptions près, poly microbiens, l’isolement
varie suivant les cas
Les méthodes utilisées de basent sur 3 méthodes :
L’utilisation de milieu sélectif : permet d’isoler une ou plusieurs
espèces microbiennes présentant un intérêt particulier en inhibant
la croissance des autres espèces microbienne.
Ces méthodes sont utilisées souvent dans des analyses de
contrôle concernant la qualité des produits alimentaires.
 Méthode par épuisement de la semence :
 Tracer sur le fond extérieur de la boite de pétri deux
diamètres Perpendiculaires séparant la boite en quatre secteurs.

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 Prélever à l'anse (stérile) une partie de la culture
dans le cône Stérile.
 Flamber l'anse et laisser refroidir
Etaler à nouveau le prélèvement par stries serrées dans la
moitié Correspondante aux quadrants 2 et 3.
 Flamber l'anse et laisser refroidir.
 Répéter une dernière fois l'étalement en stries serrées
dans la moitié correspondante aux quadrants 3 et 4

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