1. Université Mohamed Kheidher –Biskra-
Faculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de la vie
1ère année Master Biochimie et Biologie moléculaire
Exposé sur:
2011/2012

2. Plan de travail:
Introduction
I-Dosage des acides nucléiques
Méthode basée sur la fluorescence
Dosage par Spectrophotométrie
II-Conservation des acides nucléiques
Conservation de l’ADN
Conservation de l’ARN
Conclusion

3. Introduction:
Après la réalisation des techniques de dosage utilisée la conservation
pour maintenir la structure des acides nucléotides.

4. I-Dosage des acides nucléiques :
Dosages des acides nucléiques
spectrofluorométrie spectrophotométrie

5. Estimation des quantités d’ADN et d’ARN :
Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à
partir d’un matériel biologique.
Méthode basée sur la fluorescence :
On utilise un spéctrofluorimétre pour mesurer l’intensité de
la fluorescence d’une solution des acides nucléiques en
présence d’un excès de fluorochrome.

6. Principe :
Les fluorochromes qui se fixe sur le ADN et dont le taux de
fixation est directement lié a la quantité de ADN émettra une
quantité de fluorescence qui sera proportionnelle a la
quantité de ADN présente.
Les différents fluorochrome:
- Se fixant spécifiquement sur des paires de bases:
Bases A-T: DAPI
Bases G-C: mithramycine .
- Intercalant: Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui
ont l'avantage d'être moins chers ).

7. Utilisation du DAPI :
Le DAPI(Di Aminido Phenyl lndol) colorant utilisé en cytochimie et
spécifique de l'ADN fluoresce en bleu.
Cet isotope radioactif se lie spécifiquement à l’ADN double brin, à
une longueur d’onde précise à la suite d’une excitation lumineuse.
On utilise une longueur d’onde d’excitation de 369 nm et d’émission
de 460 nm. Les méthodes fluorimétrique sont très sensibles ; elles
permettent de doser des quantités d’ADN de 1 µg. elles sont plus
longues et plus couteuses que la méthode spectrophotométrie.

8. Utilisation BET (bromure d’éthidium) :
Les acide nucléiques peuvent aussi être dosé grâce à des
colorant, un des plus utilisés est le bromure d’éthidium qui
s’intercale entre les bases et qui émet dans le rouge lorsqu’il est
excité par un rayonnement UV .il colore l’ADN mais aussi l’acide
nucléique simple brin tel que l’ARN.

9. Méthode basée sur la spectrophotométrie:
Le dosage des acides nucléiques par la spectrophotométrie est une
méthode plus simple et plus rapide.les acides nucléiques ont la propriété
d’absorber les U.V .à une longueur d’onde de 260 nm, une lecture de
l’absorbance à cette longueur d’onde permettra de déterminer la
concentration d’un échantillon d’un acide nucléique. La concentration
d’un acide nucléique donné est obtenue par la relation suivant :
Concentration (µg /ml) = DO (densités optiques) 260nm× 50×facteur de dilution
L’unité de densité optique à 260 nm correspond à :
1 unité de A260=50 µg /ml : une solution d’ADN double brin.
1 unité de A260=33 µg/ml : une solution d’ ADN simple brin
1unité de A260=40 µg/ml : une solution d’ARN

10. Ces valeurs s’appliquant à des acides nucléiques parfaitement purs et
en solution homogène, certains contrôles doivent être effectués.
Une lecture au spectrophotomètre en ultra-violet permet de vérifié la
pureté de l’ADN obtenu.
Pour vérifier que cet ADN purifié n’a pas été dénaturé en cour
d’expérience, c'est-à-dire qu’il est toujours en double hélice, on fera
une mesure de l’hyperchromicité (augmentation de A260) après
dénaturation alcalin par NaOH. Le pourcentage l’hyperchromicité est
R=25%.
Si l’ADN est dénaturé, le pourcentage d’hyperchromicité est égale à
0%.
%Hyperchromicité = A(ADN dénaturé)-A(ADN natif)×100 /A(ADN natif) .

11. Principe de spectrophotométrie :

12. Lorsqu’une lumière d’intensité I₀ passe à travers une solution, une
partie de celle-ci est absorbée par le(s) soluté(s). L’intensité de la
lumière transmise est donc inférieure à I . On définit l’absorbance de
la solution comme :
Vidéo ici

13. Dosage des acides nucléiques par
absorption UV
Les nucléotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due aux
bases azotées A,C,G,T, U
- Estimation de la concentration en acides nucléiques .
- Estimation de la pureté de l’échantillon .
Spectre d’absorbance

14. Échantillon d’ADN pur : Abs 260/Abs 280 compris entre 1,8 et 2
si le rapport est < 1,7 présence de protéines.
Si le rapport est > 2 présence d’ARN.

16. II- Conservation des acides nucléiques :
Conservation des acides nucléiques
Conservation Conservation
d’ADN d’ARN

17. - Conservation d’ADN :
Tableau 01 : Les conditions de stockage d’ADN
conservation Le tampon Le pH La
d’ADN température
Stockage à Tris-EDTA = 8,0 à4 C
court terme
Stockage à Tris-EDTA = 8,0 à – 20 C
long terme

18. - Conservation d’ARN :
Tableau 02 : les conditions de conservation d’ARN purifié et non purifié
Conservation Le tampon Le pH La
d’ARN
température
Stockage d’ARN -Tris-EDTA
purifié à court -L’eau pure Rnase -80 C pendant un
terme free avec ou sans- an
EDTA
Citrate de sodium
Stockage d’ARN
purifié à long L’éthanol Inférieur
terme à -20 C
Stockage d’ARN
non purifié isothiocyanate de [-20 C à -80 C]
guanidine Pendant 18 mois

19. Conclusion
Après la réalisation de l’extraction et la purification des acides
nucléiques on entamer le dosage de ces dernier par deux méthodes
basés sur la fluorescence et la spectrophotométrie. Et stockage d ADN
et D ARN purifier et non purifier dans des conditions favorables ces
étapes suivie par la séparation détection caractérisation et
identification des acides nucléiques