1. REPUBLIQUE ALGERIENN DEMOCRATIQUE ET
POPULAIRE
MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE MOHAMED KHEIDER BISKRA
FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET DES
SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DÉPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE
ET DE LA VIE
1ére année master BBM
Les moyens d’étude de la
culture des cellules
animale
2011/2012

2. Sommaire :
Introduction
I- La culture des cellules animales :
1-Définition de la culture cellulaire
2-La milieu de culture des cellules animales
3-L’obtention des culture cellulaires
4-A quoi rassemblent les cellules cultivées
5-Les avantages et les inconvénients
6-L’utilisation des cellules en culture
II- Les moyennes d’étude de la culture des cellules animales
1-Des méthodes appropriées en microscopie optique permettent
l’observation de cellules vivant dans des boites de culture :
2-Une technique d’apparition récente est l’étude de la variation de la
concentration intracellulaire du calcium :

3. Introduction :
La culture cellulaire est devenue un des outils majeurs
utilisés aujourd'hui dans les sciences de la vie. La culture
des cellules animale en dehors de l’organisme permet
l’observation des cellules vivantes dans des conditions
favorables. De plus, une culture cellulaire représente un
système expérimental beaucoup plus simple qu’un animal
entier et elle fournit un système qui peut être étudié dans
des conditions soigneusement contrôlées. Il existe plusieurs
moyennes permet l’étude d’une culture des cellules
animales. Dans notre exposé, on présente quelques
moyennes.

4. I- La culture des cellules animales :

5. I- La culture des cellules animales :
1-Définition de la culture cellulaire :
En biologie, la culture cellulaire désigne un
ensemble de techniques utilisées pour faire
croître des cellules hors de leur organisme (ex-
vivo) ou de leur milieu d'origine, dans un but
d'expérimentation scientifique ou de
fécondation in vitro.

6. 2- La milieu de culture des cellules animales :
-Les milieux mis au point pour cultiver les cellules
animales sont beaucoup plus complexe que les
milieux « minimum » suffisants à la prolifération des
bactéries et des levures.
-Les premières tentatives de culture des cellules
utilisaient des milieux de compositions incertaines,
comme le plasma, le sérum et des extraits
embryonnaires ces milieux sont isotoniques et
tamponnés.
En 1955, quand Harry Eagle décrivit le premier milieu
reconstitué

7. Le milieu reconstitué comprend:
-Les sels et le glucose (1g /l)
-Les acides aminés et les vitamines
-Le PH du milieu doit être maintenu entre 7,2 et 7,4. On
utilise donc le tampon physiologique qui est le tampon
bicarbonate (H2CO3/HCO-3).
-L’équilibre est maintenu grâce à un atmosphère contenant 5
à 10 % de CO2
-les facteurs de croissance polypeptidiques qui activent leur
division.

8. 3- L’obtention d’une culture cellulaire :
-Il existe deux méthodes de base pour faire la culture primaire:
•les Cultures d'explants:
de petits morceaux de tissus sont fixés sur un récipient de
culture en verre ou en plastique traité et baignés dans du
milieu de culture. Après quelques jours, des cellules
individuelles se déplacent de l'explant de tissus vers la surface
du récipient de culture ou le substrat où elles commencent à se
diviser et proliférer.

9. Dissociation enzymatique: la méthode la plus généralement
utilisée
ce processus est accéléré en ajoutant des enzymes de digestion
(protéolytiques), telles que la trypsine ou la collagénase, à des
fragments de tissus pour dissoudre le ciment maintenant les
cellules ensembles. Ceci crée une suspension de cellules
individuelles qui sont placées dans des récipients de culture
contenant un milieu de culture pour les laisser pousser et se
diviser.

11. Repiquage :
Lorsque les cellules dans le récipient de culture primaire ont
poussé et couvert tout le substrat de culture disponible, elles
doivent être repiquées pour leur donner de la place afin
d’avoir une croissance continue(culture sécondaire). Cela se
fait généralement en les retirant aussi délicatement que
possible du substrat avec des enzymes. Ces enzymes sont
similaires à celles utilisées pour obtenir la culture primaire et
sont utilisées pour rompre les liaisons protéiques liant les
cellules au substrat.

12. À quoi ressemblent les cellules cultivées?
Systèmes de culture cellulaire :
systèmes de culture monocouche:
Ils sont essentiellement basés sur l'aptitude des cellules à
pousser attachées sur un substrat de verre ou de plastique traité
systèmes de culture en suspension:
Ils sont essentiellement basés sur l'aptitude des cellules à
flotter librement dans le milieu de culture

13. Types de cellules :
Les cellules cultivées sont généralement décrites d'après leur
morphologie (forme et apparence) ou leurs caractéristiques
fonctionnelles. Il existe trois morphologies de base:
1. type épithélial: ces
cellules sont attachées à
un substrat et
apparaissent plates et de
forme polygonale.

14. 2. type lymphoblaste: ces cellules ne se fixent pas
normalement à un substrat mais restent en suspension avec
une forme sphérique.
3. type fibroblaste: ces cellules
sont attachées à un substrat et
apparaissent allongées et
bipolaires.

15. L’utilisation des cellules en culture :
-L’étude des mécanismes de la physiologie cellulaire : contrôle de
cycle cellulaire, métabolisme, régulation de l’expression du gènes, études
des mouvements et des jonctions cellulaires. La culture cellulaire permet
d’étudier la cellule eucaryote et ses relations avec son environnement.
-En médecine humaine, la culture cellulaire est utilisée pour la
réalisation de greffes et d’autogreffes (cellules souches sanguines), le
dépistage des maladies génétiques (caryotype), la thérapie génique.
-L’industrie pharmaceutique est une grande utilisatrice de ces culture :
étude pharmacologique et toxicologique de nouvelles molécules
médicamenteuses, production des substances a usage thérapeutique
(hormones de croissance, insuline, interférons et cytokines, anticorps
monoclonaux) et production de vaccins.

16. Les avantages et les inconvénients :
Les avantages :
la plus part des tissus animaux et végétaux sont constitué de différent
type de cellules, alors que des cellules de type spécifique avec des
propriétés homogène peuvent être cultivé.
les conditions expérimentales, peuvent être nettement mieux contrôlées
en culture que dans un organisme intacts.
dans de nombreux cas, une cellule unique peut rapidement se développer
en une colonie constituée de nombreuses cellules identiques, un
processus appelé clonage cellulaire. Cette technique simple, permet
d’isolé facilement des clones distincts de cellules.

17. Les inconvénient :
Un des principaux inconvénients des cellules en culture est le fait
qu’elles ne sont pas dans leur environnement normal et que, par
conséquent, leurs activités ne sont pas régulées par les autres cellules
comme dans le cas d’un organisme intact.
L’environnement immédiat des cellules en culture radicalement de leur
environnement « normal », par conséquent, leurs propriétés peuvent être
affectées de plusieurs façons.

18. II- Les moyennes d’étude d’une
culture des cellules animales :

19. 2-Des méthodes appropriées en microscopie optique
permettent l’observation de cellules vivant dans des boites
de culture :
Des méthodes appropriées en microscopie optique
permettent l’observation de cellules vivant dans des boites
de culture :
-Par exemple, le contraste de phase. Couplées d’abord à la
microcinématographie, maintenant à la vidéomicroscopie, ces
méthodes rendent possible l’observation de cellules cultivées
pendant de longues périodes (mouvements cellulaire,
endocytose, différenciation cellulaire…).

20. -Ces techniques sont aussi appliquées à l’étude in vitro du
fonctionnement d’organites cellulaires isolés, comme par
exemple les mouvement des mitochondries le long des
microtubules.
-Les progrès de la microscopie à fluorescence, la synthèse de
protéines fluorescentes (GFP : la protéine à fluorescence verte)
permettent la visualisation en temps réel du devenir
intracellulaire de protéines marquées
- Il est possible, à l’aide d’un faisceaux laser, d’éteindre
localement la fluorescente , puis de suivre la récupération de la
fluorescence
technique permettant l’analyse de la mobilité des protéines, de
leur transport actif dans ou à la surface des cellules vivantes.

21. Une technique d’apparition récente est l’étude de la
variation de la concentration intracellulaire du
calcium :
La synthèse chimique a mis à la disposition des chercheurs des
molécules qui sont fluorescentes, lorsqu’elles sont en contacte avec du
calcium libre dans le hyaloplasme. La mesure de l’intensité de la
fluorescence émise permet de mesurer en temps réel (quelques
millisecondes) les variations de la concentration intracellulaire du
calcium induites par des agents pharmacologiques par exemple. Couplée
à un système de vidéomicroscopie avec intensification du signal et
analyse d’image, la méthode permet de visualiser à l’intérieur de cellules
en culture ces variations de la concentration du calcium, et ce en temps
réel
D’autres fluorocromes sont maintenant disponibles pour mesurer dans
les mêmes conditions les variations du PH ou celles de la concentration
en sodium.

22. La microscopie vidéo et traitement d’image :
De même qu’il possible d’observer un champ microscopique à l’œil ou
de la photographier, on peut aussi le filmer avec un caméra vidéo.
Les caméra vidéo offrent de nombreux avantages pour l’observation des
objets:
On construit des types particuliers de caméra vidéo très sensibles à la
lumière, permettant de donner des images d’objets sous un éclairage très
faible.
C’est particulièrement utile pour l’observation de spécimens vivants, qui
sont facilement détériorés par la chaleur dégagée par une source
lumineuse, et des spécimens colorés par fluorescence, qui se décolorent
rapidement quand ils sont exposés à la lumière. De plus, les caméras
vidéo augmenter fortement le contraste de l’image et faire apparaitre des
objets très petits.

23. La microscopie à fluorescence :
Microscope à fluorescence
verticale (Olympus BX61),
équipé de filtres et d'un
appareil photo numérique
Microscope à fluorescence inversé
(Nikon TE2000) ; La plaque orangée
permet à l'utilisateur de regarder
l'échantillon, tout en protégeant les
yeux de la lumière UV qui excite la
cible pour la rendre fluorescent.

24. La microscopie à fluorescence :
•Le phénomène de fluorescence:
certaines molécules (appelées fluorochromes) absorbent des radiation
ultraviolettes invisibles et libèrent une partie de l’énergie sous forme de
lumière visible de plus grande longueur d’onde
•Dans ce microscope, la source lumineuse produit un faisceau de lumière
ultraviolette qui traverse un filtre bloquant toutes les longueurs d’onde à
l’exception de celles peuvent exciter le fluorochrome.
•Le faisceau de lumière monochromatique est focalisé par l’objectif sur
l’objet contenant le fluorochrome, celui-ci est excité et émet une lumière
de longueur d’onde visible susceptible d’etre perçue par l’observateur.
•La source lumineuse ne produisant que de la lumière ultraviolette
(noire), les objets colorés par un fluorochrome apparaissent avec des
couleurs brillantes sur un fondanoir, et le contraste est très fort.

25. Immunofluorescence:
le fluorochrome (comme la rhodamine ou la fluorescéinne) et
uni par covalence (conjugué) à un anticorps, afin de produire
un anticorps fluorescent utilisable pour localiser une protéine
spécifique au sein de la cellule.
Supposons, par exemple, que vous vous intéresser à la
localisation d’une protéine motrice particulière, comme la
dynéine cytoplasmique, avant et au cours de la mitose. Pour ce
faire, vous pourriez prendre des objets entiers ou des coupes
de cellules en division et au repos, puits les traiter par un
anticorps contre la dynéine, marqué par fluorescence.
L’examen de la préparation au microscope à fluorescence
montrait la localisation de la dynéine aux deux stades du cycle
cellulaire.

26. On peut aussi utiliser les protéines marquées par fluorescence pour
étudier des processus dynamiques tels qu’ils se déroulent dans la cellule
vivante. On peut, par exemple, fixer un fluorochrome spécifique à une
protéine cellulaire, comme l’actine ou la tubuline, et injecter la protéine
marquée par fluorescence dans une cellule vivante.
protéine fluorescence (GFP): on construit un ADN recombinant qui
réunit la région codante de la GFP à celle de la protéine étudiée. Et ADN
recombinant sert à la transfection des cellules, qui synthétisent ainsi
une protéine chimérique contenant la GFP fluorescente fusionnée à la
protéine.Dans toutes ces stratégies, les protéines marquées participent
aux activités normales de la cellule et il est possible de suivre leur
localisation au microscope pour mettre en évidence les activités
dynamiques auxquelles participe la protéine.
On peut aussi utiliser des fluorochromes pour localiser les molécules
d’ADN ou d’ARN contenant des séquences nucléotidiques spécifiques.

27. Cytométrie en flux :
Initialement développée pour le dénombrement de cellule en
suspension et l'évaluation de leur taille ,la cytométrie en flux a
été rapidement appliquée à l'analyse, la caractérisation et la
séparation des cellule eucaryotes des constituants cellulaire
(mitochondries, chromosomes).

28. Le principe de cytométrie en flux :

29. L'appareil : deux modèles différents.
Un cytomètre analyseur de paillasse
un cytomètre trieur de cellules,
beaucoup plus imposant.

30. Les lasers :
Les lasers produisant une
lumière monochromatique,
celle-ci n'est pas forcément
adaptée à la mesure
recherchée.
Différents lasers sont donc
nécessaires pour étendre les
possibilités de l'appareil : en
particulier pour mettre en
évidence différents types de
fluorochromes qui ne sont pas
excités par les mêmes
longueurs d'onde.

31. Les détecteurs :
Un système
complexe de filtres
et de détecteurs
permet de faire
plusieurs mesures
simultanées (2
mesures de
diffraction et des
mesures de
fluorescence).

32. Le tri des cellules :

33. Conclusion :
On conclure que la culture des cellules animales jouent un
grand rôle dans l’étude des mécanismes de la physiologie
cellulaire, dans la médecine humaine, et dans L’industrie
pharmaceutique. Leur études se fait à l’aide de plusieurs
moyennes, la plus utilisable c’est la microscope de
fluorescence et la cytométrie en flux.