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TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200344
PRODUCCIÓN DE ETANOLYPROTEÍNAS POR UNA CEPA
DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE INMOVILIZADA EN
ALGINATO DE CALCIO
Manuel González Pérez (1), Pedro Gross Cobas(2), Vito de Deus Ramos(3)
1. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Cuba.
2. Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Cuba.
3. Ministerio de la Marina, Islas de Caboverde
Se cuantificaron las cantidades de etanol y proteínas producidas por la cepa de levadura
Saccharomyces cerevisiae Scer 02, inmovilizadas en alginato de calcio y en la forma no inmovilizada.
Los resultados del análisis estadístico indican un mayor rendimiento de etanol y proteínas en la
forma inmovilizada, simultáneamente, lo cual es de interés para la industria.
Palabras clave: etanol, proteína, S. cerevisiae, alginato, inmovilización.
_____________________
A study of the quantity for ethanol and protein production from the yeast Saccharomyces cerevisiae
Scer 02, also in the alginate immovilization and free forms, has been done in this work. The results
are increased when the yeast is in the immovilization form. A statistical analysis over these results
is made.
Kay words: ethanol, protein, S. Cerevisiae, alginate, immovilization.
Introducción
Las levaduras del género Saccharomyces
cerevisiae han sido utilizadas tradicionalmente
en la industria de la producción de etanol /14/.
Además de la obtención de este metabolito, las
propias células de levaduras, por su contenido en
proteínas y vitaminas, se han utilizado en la
alimentación animal y, ocasionalmente, en la
alimentación humana, como un subproducto in-
dustrial. /19, 17, 23, 16/ Con el propósito de
incrementar los niveles productivos uno de los
procedimientos biotecnológicos más útiles es
inmovilizar las levaduras en diferentes soportes
como agar, alginato de calcio, astillas de madera
de bálsamo, etcétera. /17, 23, 10, 13/
Las levaduras poseen hasta un 40 % de proteí-
nas de buena calidad y, en cuanto al etanol toleran
hasta un 12 % de este metabolito. En la actuali-
dad, las levaduras son objeto de estudio en la
producción de proteínas unicelulares /31, 32, 33,
34, 37/, y en cuanto a la síntesis de etanol se
trabaja en la obtención de cepas que toleren más
del 12 % de etanol en el medio de cultivo, cepas
que resistan temperaturas de destilación mayores
de 60 ºC o que incrementen la densidad
poblacional, su aislamiento y protección median-
te las tecnologías de la inmovilización. /17, 23,
2, 12, 11, 28/ La cepa de levadura Scer 02 utiliza-
da en nuestro trabajo procede del cepario del
Centro de Estudio de Biotecnología Industrial
(CEBI) de la Universidad de Oriente. Es una cepa
esencialmente sintetizadora de proteínas aunque
sintetiza etanol.
Nuestro objetivo de trabajo fue valorar la
posibilidad de incrementar la producción de
etanol, simultáneamente con el mantenimiento
del nivel proteico mediante la utilización de las
técnicas de inmovilización, y manteniendo el
medio tradicional de producción de etanol utili-
zado tradicionalmente en las destilerías de alco-
hol en Cuba, el medio compuesto de melaza de
caña.
Fundamento teórico
Por las características bioquímicas de los pro-
cesos abordados es necesario, metodológicamen-
te, analizarlo en tres aspectos con una mayor o
menor interrelación según cada uno.
Síntesis de etanol
La síntesis de etanol en las levaduras transcu-
rre mediante la vía de Embden-Meyerhof, en la
que partiendo de 1 mol de glucosa genera 2 moles
de etanol, 2 moles de adenosin trifosfato (ATP)
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 45
y 2 moles de CO2. Ésta es una vía anaeróbica,
aunque la levadura normalmente necesita de oxí-
geno para la síntesis de sus ácidos grasos
insaturados. /1/
Un contenido de etanol en el medio de cultivo
por encima del 12 % comienza a disolver los
lípidos de la membrana celular de la levadura
provocando su destrucción limitando así el pro-
ceso industrial. /23/
Síntesis de proteínas
La síntesis de proteínas necesita energía en
forma de ATP y GTP. El ATP se origina en la
propia vía de síntesis de etanol y el GTP en el
ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La proteína en
sí se genera mediante una vía compleja a nivel del
citoplasma celular involucrando la información
genética del DNA nuclear y el rol funcional de los
ribosomas. Las membranas celulares y
subcelulares además de lípidos poseen proteínas
mientras que todo el rol funcional de la levadura,
incluyendo la síntesis de etanol, está controlada y
viabilizada por las enzimas que son proteínas.
Inmovilización en alginato de calcio
El alginato de sodio al interactuar con el
bicloruro de calcio forma el alginato de calcio,
polímero que forma una estructura en enrejado o
malla. Dentro de estas esférulas quedan atrapa-
das las células de levaduras como enjauladas. Las
células de levaduras se multiplican por gemación.
Cuando la levadura está inmovilizada de la mane-
ra indicada incrementa mucho su densidad
poblacional. Otra ventaja es que a través de los
poros de la red del alginato ocurre la salida del
etanol retirable en el proceso fabril sin necesidad
de detener el proceso. Además, al salir el etanol
y alejarse de las levaduras su afectación sobre
ellas es menor. Los sustratos penetran por estos
mismos poros. La levadura, protegida en esta red,
incrementa su población y con ello la cantidad de
proteínas en el cultivo. En estas ventajas de la
inmovilización por atrapamiento en alginato de
calcio y las interacciones de las vías de biosíntesis
de etanol y proteínas radica el fundamento teóri-
co que nos permite elevar los niveles de síntesis
de etanol y de proteínas. /21, 36, 4/
Materiales y métodos
Medios de cultivo del microorganismo
Se emplearon los siguientes medios: medio
YPG, descrito porHaritzu et al, 1992(citadopor
Collins y Lyne, 1995); medio Melaza según Ca-
bello (1989); como medio mínimo se empleó el
reportado porKawai et al. l988 (citadoporCollins
y Lyne, 1995). Todos los medios de cultivo fue-
ron esterilizados a 121°C durante 20 min antes de
los experimentos
Cepa de microorganismo
Se utilizó una cepa de Saccharomyces
cerevisiae var. Scer 02 procedente del cepario
del CEBI, Universidad de Oriente, originaria del
cepario del ICIDCA, Ciudad Habana.
Esta cepa fue mantenida en medio YPG des-
crito por Horitsu et al. 1992 (citado por Collins
y Lyne, 1995).
Inmovilización de las levaduras
Se realizó con alginato de sodio en CaCl2 por
el procedimiento reseñado por Sutaret al. (1986),
evaluándose su calidad mediante los índices por
ciento de retención de la actividad funcional, el
grado de inmovilización y la eficiencia de inmo-
vilización, los que fueron calculados mediante
las fórmulas siguientes /36, 38, 8, 17, 29/:
EI% =
#cél aplicadas #cél lavadas
#cél aplicadas
Eficiencia deinmovilización
b g b g
b g b g−
*100 (2)
GI =#cél / mg =
#cél aplicadas #cél lavadas
mLgel
Grado de inmovilización
b g b gb g−
(1)
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200346
Seguimiento de parámetros durante la
fermentación alcohólica
Medición del crecimiento celular
Se llevó a cabo en los medios YPG y Melaza
midiendo la densidad óptica del cultivo a 540 nm.
/15/
Número de células
El número de células se determinó por conteo
en cámara de Neubauer. Para la fermentación
clásica se tomó una muestra de cada tiempo con
la cual se llenó la cámara y se realizó el conteo. En
el caso de la fermentación con células
inmovilizadas, primeramente, se tomó una mues-
tra de cada tiempo equivalente a 1 mL y se llevó
a 9 mL de una solución de NaOH 0,1N en la cual
se disolvieron los gránulos de alginato con las
células inmovilizadas y con esta suspensión se
llenó la cámara para llevar a cabo el conteo.
Medidas del pH
Los cambios de pH se siguieron potenciomé-
tricamente en cada una de las muestras.
Acidez total
La cuantificación de la acidez total se realizó
por titulación con NaOH 0,1 N de una muestra
fermentada. A la muestra (l0 mL) se le eliminó el
contenido de CO2 calentando a ebullición duran-
te 30 s. Se colocan 200 mL de H2O destilada
hervida en un erlenmeyer y se le adiciona 1 mL de
solución de fenolftaleína al 1 %, se neutraliza con
solución NaOH 0,1 N y se le agrega 5 mL de la
muestra hervida y se valora con solución de
NaOH 0,1N. Este dato se informa como gramos
de ácido tartárico con el uso de la siguiente
fórmula:
Síntesis de etanol
El análisis de la síntesis de etanol se realizó en
el medio melaza con las levaduras inmovilizadas
y no inmovilizadas durante 48 h, a pH 5,5. Las
muestras fueron centrifugadas y el destilado se
realizó en el sobrenadante. Los concentrados
obtenidos fueron analizados por espectrofoto-
metría acorde con el procedimiento descrito por.
/30/
Cuantificación de las proteínas
La cantidad de proteínas presentes en las mues-
tras se determinó mediante el procedimiento
Keldhal. /40, 5/
Preparación de la melaza
Se toma la miel final procedente del central y
se lleva de 80-90 °Bx a 40 °Bx mediante la técnica
indicada en. /6/
Fermentación clásica
Se realizó utilizando la metodología de /14/,
con las siguientes particularidades: un cultivo de
levadura en medio YPG líquido crecido hasta
faseexponencialseinoculóenfrascoserlenmeyer
de 250 mL de capacidad que contenían 100 mL
del medio de producción. El análisis de los mos-
tos de la fermentación se realizó a las 0, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 24, 36 y 48 h, realizando cuatro réplicas para
cada tiempo. Además, se preparó un blanco en un
erlenmeyer con l00 mL del medio de producción
sin añadirle el inóculo.
Fermentación con células inmovilizadas
Se prepararon varios erlenmeyer con l00 mL
del medio de producción a los cuales se les
añadieron los volúmenes con la levadura
inmovilizada, estos fueron incubados a 32 °C.
Aquí también se preparó un blanco en el cual los
gránulos estaban formados por una mezcla de la
suspensión de alginato y medio YPG líquido sin
levaduras.Setomaroncuatroréplicasdelasmues-
tras en los mismos intervalos de tiempos que en la
fermentación clásica.
(3)% *RAF =
gramos de etanol / L Inmovilizado
gramos de etanol / L Aplicado
Retención de la actividad funcional
b g
b g b g100
(4)Ac. tartárico /100mL =
mL NaOH N.75.100
1 000.5
b g.
donde:mL(NaOH)sonlosmLdeNaOHconsumidos
en la valoración y N es la normalidad de la solución.
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 47
células muertas y se procedió a contar las células
teñidas. Se calculó el por ciento de viabilidad
para cada tiempo. /15/
Resultados y discusión
Las figuras 1 y 2, respectivamente, mues-
tran la producción y productividad de etanol
por S, cerevisiae Scer 02, en las formas clásica
e in-movilizada en alginato de calcio, en me-
dio melaza y en fermentación batch durante 48
h. En la fermentación clásica los máximos de
producción y productividad se lograron a las
24 y 48 h. En la forma inmovilizada en alginato
los rendimientos mayores se lograron a las 6, 7
y 8 h de fermentación, y con valores muy
superiores a los anteriores de la forma clásica.
A igualdad de condiciones el rendimiento de
etanol es superior en las formas inmovilizadas.
concordando con lo reportado por la literatura.
/26, 27, 23, 18, 19, 20/
Acidez volátil
Este parámetro se cuantificó en un volumen de
muestra destilada (5mL), ésta se tituló con una
solución de NaOH 0,1 N, de la misma forma que
para la acidez total y el dato se informa como
gramos de ácido acético usando la siguiente fórmu-
la:
Azúcares reductores totales (ART)
Los ART presentes en el mosto fermentado se
(5)G de ac. acético / 100mL =
mL NaOH N. .100
1 000.4
b g. 60
cuantificaron usando la técnica de Fehling, para
este fin, a la muestra se le debe eliminar previa-
mente el material orgánico mediante una defeca-
ción. /39/
Viabilidad
Se tomó 0,1 mL de la muestra y se le añadió
una solución de azul de metileno para teñir las
0
5
10
15
20
25
0 3 4 5 6 7 8 24 36 48
Fermentación clásica
C2
Inmov. en alginato
TIEMPO (horas )
ETANOL
(g/ L )
Fig. 1 Valores promedios de la producción de etanol por la cepa de levadura
Saccharomyces cerevisiae Scer 02, en medio melaza y en dos condiciones de cultivo batch:
la fermentación clásica y la fermentación con células inmovilizadas en alginato de calcio.
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200348
Durante la producción de etanol es importan-
te tener en cuenta el costo y el rendimiento /22/ .
Atendiendo a esto durante la fermentación alco-
hólica son objetivos importantes: el aumento de
laeficienciadelprocesoenrelaciónconelsustrato
utilizado y la energía gastada. Un segundo aspec-
to es aumentar la productividad volumétrica. En
este aspecto es de interés la tolerancia de la
levadura a la concentración de etanol la que
oscila entre el 8 y el 18 %, según las especies. El
género Saccharomyces tolera hasta un 11 % de
etanol. Este producto difunde pasivamente a tra-
vés de la membrana celular de la levadura tratan-
do de igualar las concentraciones dentro y fuera
de la célula. Un nivel de etanol superior al 11 %
tiene como consecuencia la disolución de los
lípidos de las membranas celulares y la interfe-
rencia en el metabolismo de éstos. A esos niveles
de etanol no se forma ergosterol y otros lípidos
saturados necesarios para las membranas. En la
actualidad, a escala mundial, una de las sendas
investigativas en este campo es la búsqueda de
cepas que toleren concentraciones de etanol ma-
yores que los niveles señalados. Otra alternativa
estudiada es el arrastre del etanol que está siendo
sintetizado mediante vapor. /23, 24, 25/
En la fermentación clásica se obtuvo un máxi-
mo de 18,69 g/L de producción de etanol a las 36
h de iniciada la fermentación mientras que con
las células inmovilizadas en alginato el valor
máximo se obtuvo a las 6 h con 23,40 g/ L.
Respecto a la productividad en la fermentación
clásica fue de 0,54 g/L/h a las 8 h y en la
fermentación con alginato fue de 3,90 g/L/h a las
6 h de fermentación. De acuerdo con los resulta-
dos del análisis estadístico, p =0,05, la producti-
vidad es mayor en la forma inmovilizada que en
la fermentación clásica. /9, 35/
Durante la síntesis de etanol por la vía
fermentativa fueron controlados diferentes fac-
tores que influyen en la producción y la produc-
tividad /23/, resultados que se exponen a conti-
nuación.
En las figuras 3 y 4 se muestra el comporta-
miento de la acidez total y acidez volátil obser-
vándose un incremento ligero de la acidez volátil
durante las 10 h iniciales para luego mantenerse
similares. En la fermentación clásica la acidez
total posee un incremento más lento, lo que se
corresponde con un metabolismo menor eviden-
ciado por el nivel de etanol obtenido aunque en
general, no existen diferencias significativas en
los valores de estos dos índices excepto para el
valor de la media de la fermentación clásica a
tiempo cero que es significativamente inferior a
las demás medias.
Fig. 2 Representación comparativa de la productividad en gramos de etanol en la cepa de
Saccharomyces cerevisiae Scer 02 en gramos de etanol por litro de medio melaza en horas
(g/L/horas) en dos condiciones de cultivo: Fermentación clásica y células inmovilizadas en
alginato de calcio.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4ETANOL ( g/L/h )
0 3 4 5 6 7 8 24 36 48
TIEMPO ( horas )
PRODUCTIVIDAD DE ETANOL
Ferm. clásica
Inmov. en alginato
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 49
La viabilidad fue superior en alginato de cal-
cio a las 48 h de iniciada la fermentación (figura
5) con 80,22 % y es 67,06 % en la fermentación
clásica.
Durante todo el proceso fermentativo la viabilidad
siempre fue superior en la fermentación con las leva-
duras inmovilizadas en alginato de sodio, aunque estas
diferencias no son estadísticamente significativas.
Fig. 3 Representación comparativa de los valores de acidez total medida como gramos de
ácido tartárico por cada 100 mL de medio melaza en cultivo batch de la cepa de levadura
Saccharomyces cerevisiae Scer 02 en las condiciones de fermentaciones clásica e
inmovilizadas en alginato de calcio. Los resultados experimentales se obtuvieron mediante
la fórmula 4.
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
0 10 20 30 40 50 60
TIEMPO (horas )
GdeACIDOTARTARICO/100mL
Ferm. clásica
Inmov. en alginato
Fig. 4 Comparación de la acidez volátil en las fermentaciones clásica e inmovilizadas en
alginato de calcio y en medio melaza por S. cerevisiae Scer 02 en un cultivo batch. Los
resultados experimentales se obtuvieron mediante la fórmula 5.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 10 20 30 40 50 60
TIEMPO (horas )
GDEACIDOACETICO/100mL
Ferm. clásica
Inmov. en alginato
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200350
En la figura 6 aparecen los contenidos de
azúcares reductores observándose que los resul-
tados se mantienen más altos en la fermentación
clásica indicando una menor utilización de éstos.
En la fermentación en alginato es inferior, donde
a las 48 h sólo quedaba el 2,37 % frente a 4,49 %
en la fermentación clásica. El nivel de los azúca-
res reductores descendió significativamente a
las 36 h (fermentación clásica) en relación con el
nivel de su utilización a las 7 y 8 h. La mayor
densidad poblacional y las restantes ventajas de
la inmovilización explican estas diferencias.
En la síntesis fermentativa del etanol siempre
existe un incremento en el número de células y es
mayor en la inmovilización con alginato (figura
7). En correspondencia con esto la viabilidad
Fig. 5 Comparación de la viabilidad en la cepa de levadura S. cerevisiae Scer 02 durante la
fermentación alcohólica en medio melaza en las condiciones de fermentación clásica e
inmovilizada en alginato de calcio.
VIABILIDAD DE LAS LEVADURAS
60
65
70
75
80
85
0 3 4 5 6 7 8 24 36 48
TIEMPO (horas)
%DEVIABILIDAD
Ferm. clásica
Inmov. en alginato
Fig. 6 Comportamiento de los azúcares reductores durante la síntesis de etanol en el
medio melaza durante las fermentaciones clásica e inmovilizada en alginato de calcio.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 10 20 30 40 50 60
TIEMPO (horas )
%DEAZUCARESREDUCTORES
Ferm. clásica
Inmov. en alginato
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 51
(figura5) también resultó superior en la fermenta-
ción con alginato. Estos resultados concuerdan
con la mayor producción y productividad en la
forma inmovilizada respecto a la forma clásica
(figuras 1 y 2). Hay un descenso del nivel de los
azúcares reductores siendo mayor en las formas
inmovilizadas, lo que se corresponde con el nivel
del producto (figura 1). A las 48 h el número de
células fue de 1,1E7/mL en la fermentación
clásica y 3,25E7/mL en la inmovilización en
alginato.
Realizada la inmovilización de la cepa de
Saccharomyces en estudio se procedió a evaluar
ésta, según. /36/ Para ello se calculó:
a) El grado de inmovilización mediante la fór-
mula (1):
Siendo en el alginato:
b) Eficiencia de Inmovilización ( EI) mediante la
fórmula (2):
En alginato:
c) % de Retención de Actividad Funcional (%
RAF) mediante la fórmula (3):
En el alginato :
La eficiencia de la inmovilización fue muy
buena, lo que queda corroborado por los altos por
cientos de la misma, lo cual es indicativo del bajo
nivel de errores experimentales y, al ser la reten-
ción de la actividad funcional también alta, es
posible evaluar las inmovilizaciones realizadas
de muy buena calidad.
Tanto en la forma inmovilizada como en la
forma clásica existe incremento en el rendi-
miento de proteínas concordando con el incre-
mento en el número de células en ambos casos,
pero resultó ser mayor en la forma inmovilizada
dada a un incremento superior en la densidad
poblacional (figura 8). De acuerdo con estu-
dios previos estas proteínas unicelulares son
de buena calidad y no existen problemas de
toxicidad presentando, adicionalmente, un ín-
dice de digestibilidad aceptable, característi-
cas que permiten su utilización en la alimenta-
ción animal. /31/
GI =
31,25 - 10,25
100 = 85 %
25
*
EI% =
31,25*10
31,25*10
100 = 97 %
7
7
− 0 75 107
, *
.
c h
% .RAF =
16,72 g / L
17,13 g / L
100 = 97,6 %
Fig. 7 Comparación del número de células promedio (biomasa) en el crecimiento en medio
melaza de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae Scer 02. en la fermentación clásica
e inmovilizada en alginato de calcio. En los dos casos es cultivo batch. Los valores del eje Y
se multiplican por 107 y corresponden a 1 mL del medio de cultivo.
BIOMASA CELULAR
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 3 4 5 6 7 8 24 36 48
TIEMPO (dias )
NUMERODECELULAS
Ferm. clásica
Inmov. en alginato
TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200352
Fig. 8 Obtención de proteínas a partir de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae
Scer 02 en medio melaza de caña, en cultivo batch, en las formas movilizadas e
inmovilizadas.
Contenido de proteínas
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 3 4 5 6 7 8 24 36 48
Tiempos (Horas)
g/mLdeproteínas
Clásica
Alginato
Conclusiones
La producción y la productividad de etanol y
la obtención de proteínas unicelulares por parte
de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae
Scer 02 es mayor cuando la levadura está
inmovilizada en alginato de calcio comparada
con la forma no inmovilizada, ambas en medio
melaza de caña y cultivo batch.
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Análisis de los Alimentos. Editorial Ciencia y
Técnica.

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  • 1. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200344 PRODUCCIÓN DE ETANOLYPROTEÍNAS POR UNA CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE INMOVILIZADA EN ALGINATO DE CALCIO Manuel González Pérez (1), Pedro Gross Cobas(2), Vito de Deus Ramos(3) 1. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Cuba. 2. Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Cuba. 3. Ministerio de la Marina, Islas de Caboverde Se cuantificaron las cantidades de etanol y proteínas producidas por la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae Scer 02, inmovilizadas en alginato de calcio y en la forma no inmovilizada. Los resultados del análisis estadístico indican un mayor rendimiento de etanol y proteínas en la forma inmovilizada, simultáneamente, lo cual es de interés para la industria. Palabras clave: etanol, proteína, S. cerevisiae, alginato, inmovilización. _____________________ A study of the quantity for ethanol and protein production from the yeast Saccharomyces cerevisiae Scer 02, also in the alginate immovilization and free forms, has been done in this work. The results are increased when the yeast is in the immovilization form. A statistical analysis over these results is made. Kay words: ethanol, protein, S. Cerevisiae, alginate, immovilization. Introducción Las levaduras del género Saccharomyces cerevisiae han sido utilizadas tradicionalmente en la industria de la producción de etanol /14/. Además de la obtención de este metabolito, las propias células de levaduras, por su contenido en proteínas y vitaminas, se han utilizado en la alimentación animal y, ocasionalmente, en la alimentación humana, como un subproducto in- dustrial. /19, 17, 23, 16/ Con el propósito de incrementar los niveles productivos uno de los procedimientos biotecnológicos más útiles es inmovilizar las levaduras en diferentes soportes como agar, alginato de calcio, astillas de madera de bálsamo, etcétera. /17, 23, 10, 13/ Las levaduras poseen hasta un 40 % de proteí- nas de buena calidad y, en cuanto al etanol toleran hasta un 12 % de este metabolito. En la actuali- dad, las levaduras son objeto de estudio en la producción de proteínas unicelulares /31, 32, 33, 34, 37/, y en cuanto a la síntesis de etanol se trabaja en la obtención de cepas que toleren más del 12 % de etanol en el medio de cultivo, cepas que resistan temperaturas de destilación mayores de 60 ºC o que incrementen la densidad poblacional, su aislamiento y protección median- te las tecnologías de la inmovilización. /17, 23, 2, 12, 11, 28/ La cepa de levadura Scer 02 utiliza- da en nuestro trabajo procede del cepario del Centro de Estudio de Biotecnología Industrial (CEBI) de la Universidad de Oriente. Es una cepa esencialmente sintetizadora de proteínas aunque sintetiza etanol. Nuestro objetivo de trabajo fue valorar la posibilidad de incrementar la producción de etanol, simultáneamente con el mantenimiento del nivel proteico mediante la utilización de las técnicas de inmovilización, y manteniendo el medio tradicional de producción de etanol utili- zado tradicionalmente en las destilerías de alco- hol en Cuba, el medio compuesto de melaza de caña. Fundamento teórico Por las características bioquímicas de los pro- cesos abordados es necesario, metodológicamen- te, analizarlo en tres aspectos con una mayor o menor interrelación según cada uno. Síntesis de etanol La síntesis de etanol en las levaduras transcu- rre mediante la vía de Embden-Meyerhof, en la que partiendo de 1 mol de glucosa genera 2 moles de etanol, 2 moles de adenosin trifosfato (ATP)
  • 2. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 45 y 2 moles de CO2. Ésta es una vía anaeróbica, aunque la levadura normalmente necesita de oxí- geno para la síntesis de sus ácidos grasos insaturados. /1/ Un contenido de etanol en el medio de cultivo por encima del 12 % comienza a disolver los lípidos de la membrana celular de la levadura provocando su destrucción limitando así el pro- ceso industrial. /23/ Síntesis de proteínas La síntesis de proteínas necesita energía en forma de ATP y GTP. El ATP se origina en la propia vía de síntesis de etanol y el GTP en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La proteína en sí se genera mediante una vía compleja a nivel del citoplasma celular involucrando la información genética del DNA nuclear y el rol funcional de los ribosomas. Las membranas celulares y subcelulares además de lípidos poseen proteínas mientras que todo el rol funcional de la levadura, incluyendo la síntesis de etanol, está controlada y viabilizada por las enzimas que son proteínas. Inmovilización en alginato de calcio El alginato de sodio al interactuar con el bicloruro de calcio forma el alginato de calcio, polímero que forma una estructura en enrejado o malla. Dentro de estas esférulas quedan atrapa- das las células de levaduras como enjauladas. Las células de levaduras se multiplican por gemación. Cuando la levadura está inmovilizada de la mane- ra indicada incrementa mucho su densidad poblacional. Otra ventaja es que a través de los poros de la red del alginato ocurre la salida del etanol retirable en el proceso fabril sin necesidad de detener el proceso. Además, al salir el etanol y alejarse de las levaduras su afectación sobre ellas es menor. Los sustratos penetran por estos mismos poros. La levadura, protegida en esta red, incrementa su población y con ello la cantidad de proteínas en el cultivo. En estas ventajas de la inmovilización por atrapamiento en alginato de calcio y las interacciones de las vías de biosíntesis de etanol y proteínas radica el fundamento teóri- co que nos permite elevar los niveles de síntesis de etanol y de proteínas. /21, 36, 4/ Materiales y métodos Medios de cultivo del microorganismo Se emplearon los siguientes medios: medio YPG, descrito porHaritzu et al, 1992(citadopor Collins y Lyne, 1995); medio Melaza según Ca- bello (1989); como medio mínimo se empleó el reportado porKawai et al. l988 (citadoporCollins y Lyne, 1995). Todos los medios de cultivo fue- ron esterilizados a 121°C durante 20 min antes de los experimentos Cepa de microorganismo Se utilizó una cepa de Saccharomyces cerevisiae var. Scer 02 procedente del cepario del CEBI, Universidad de Oriente, originaria del cepario del ICIDCA, Ciudad Habana. Esta cepa fue mantenida en medio YPG des- crito por Horitsu et al. 1992 (citado por Collins y Lyne, 1995). Inmovilización de las levaduras Se realizó con alginato de sodio en CaCl2 por el procedimiento reseñado por Sutaret al. (1986), evaluándose su calidad mediante los índices por ciento de retención de la actividad funcional, el grado de inmovilización y la eficiencia de inmo- vilización, los que fueron calculados mediante las fórmulas siguientes /36, 38, 8, 17, 29/: EI% = #cél aplicadas #cél lavadas #cél aplicadas Eficiencia deinmovilización b g b g b g b g− *100 (2) GI =#cél / mg = #cél aplicadas #cél lavadas mLgel Grado de inmovilización b g b gb g− (1)
  • 3. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200346 Seguimiento de parámetros durante la fermentación alcohólica Medición del crecimiento celular Se llevó a cabo en los medios YPG y Melaza midiendo la densidad óptica del cultivo a 540 nm. /15/ Número de células El número de células se determinó por conteo en cámara de Neubauer. Para la fermentación clásica se tomó una muestra de cada tiempo con la cual se llenó la cámara y se realizó el conteo. En el caso de la fermentación con células inmovilizadas, primeramente, se tomó una mues- tra de cada tiempo equivalente a 1 mL y se llevó a 9 mL de una solución de NaOH 0,1N en la cual se disolvieron los gránulos de alginato con las células inmovilizadas y con esta suspensión se llenó la cámara para llevar a cabo el conteo. Medidas del pH Los cambios de pH se siguieron potenciomé- tricamente en cada una de las muestras. Acidez total La cuantificación de la acidez total se realizó por titulación con NaOH 0,1 N de una muestra fermentada. A la muestra (l0 mL) se le eliminó el contenido de CO2 calentando a ebullición duran- te 30 s. Se colocan 200 mL de H2O destilada hervida en un erlenmeyer y se le adiciona 1 mL de solución de fenolftaleína al 1 %, se neutraliza con solución NaOH 0,1 N y se le agrega 5 mL de la muestra hervida y se valora con solución de NaOH 0,1N. Este dato se informa como gramos de ácido tartárico con el uso de la siguiente fórmula: Síntesis de etanol El análisis de la síntesis de etanol se realizó en el medio melaza con las levaduras inmovilizadas y no inmovilizadas durante 48 h, a pH 5,5. Las muestras fueron centrifugadas y el destilado se realizó en el sobrenadante. Los concentrados obtenidos fueron analizados por espectrofoto- metría acorde con el procedimiento descrito por. /30/ Cuantificación de las proteínas La cantidad de proteínas presentes en las mues- tras se determinó mediante el procedimiento Keldhal. /40, 5/ Preparación de la melaza Se toma la miel final procedente del central y se lleva de 80-90 °Bx a 40 °Bx mediante la técnica indicada en. /6/ Fermentación clásica Se realizó utilizando la metodología de /14/, con las siguientes particularidades: un cultivo de levadura en medio YPG líquido crecido hasta faseexponencialseinoculóenfrascoserlenmeyer de 250 mL de capacidad que contenían 100 mL del medio de producción. El análisis de los mos- tos de la fermentación se realizó a las 0, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 36 y 48 h, realizando cuatro réplicas para cada tiempo. Además, se preparó un blanco en un erlenmeyer con l00 mL del medio de producción sin añadirle el inóculo. Fermentación con células inmovilizadas Se prepararon varios erlenmeyer con l00 mL del medio de producción a los cuales se les añadieron los volúmenes con la levadura inmovilizada, estos fueron incubados a 32 °C. Aquí también se preparó un blanco en el cual los gránulos estaban formados por una mezcla de la suspensión de alginato y medio YPG líquido sin levaduras.Setomaroncuatroréplicasdelasmues- tras en los mismos intervalos de tiempos que en la fermentación clásica. (3)% *RAF = gramos de etanol / L Inmovilizado gramos de etanol / L Aplicado Retención de la actividad funcional b g b g b g100 (4)Ac. tartárico /100mL = mL NaOH N.75.100 1 000.5 b g. donde:mL(NaOH)sonlosmLdeNaOHconsumidos en la valoración y N es la normalidad de la solución.
  • 4. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 47 células muertas y se procedió a contar las células teñidas. Se calculó el por ciento de viabilidad para cada tiempo. /15/ Resultados y discusión Las figuras 1 y 2, respectivamente, mues- tran la producción y productividad de etanol por S, cerevisiae Scer 02, en las formas clásica e in-movilizada en alginato de calcio, en me- dio melaza y en fermentación batch durante 48 h. En la fermentación clásica los máximos de producción y productividad se lograron a las 24 y 48 h. En la forma inmovilizada en alginato los rendimientos mayores se lograron a las 6, 7 y 8 h de fermentación, y con valores muy superiores a los anteriores de la forma clásica. A igualdad de condiciones el rendimiento de etanol es superior en las formas inmovilizadas. concordando con lo reportado por la literatura. /26, 27, 23, 18, 19, 20/ Acidez volátil Este parámetro se cuantificó en un volumen de muestra destilada (5mL), ésta se tituló con una solución de NaOH 0,1 N, de la misma forma que para la acidez total y el dato se informa como gramos de ácido acético usando la siguiente fórmu- la: Azúcares reductores totales (ART) Los ART presentes en el mosto fermentado se (5)G de ac. acético / 100mL = mL NaOH N. .100 1 000.4 b g. 60 cuantificaron usando la técnica de Fehling, para este fin, a la muestra se le debe eliminar previa- mente el material orgánico mediante una defeca- ción. /39/ Viabilidad Se tomó 0,1 mL de la muestra y se le añadió una solución de azul de metileno para teñir las 0 5 10 15 20 25 0 3 4 5 6 7 8 24 36 48 Fermentación clásica C2 Inmov. en alginato TIEMPO (horas ) ETANOL (g/ L ) Fig. 1 Valores promedios de la producción de etanol por la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae Scer 02, en medio melaza y en dos condiciones de cultivo batch: la fermentación clásica y la fermentación con células inmovilizadas en alginato de calcio.
  • 5. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200348 Durante la producción de etanol es importan- te tener en cuenta el costo y el rendimiento /22/ . Atendiendo a esto durante la fermentación alco- hólica son objetivos importantes: el aumento de laeficienciadelprocesoenrelaciónconelsustrato utilizado y la energía gastada. Un segundo aspec- to es aumentar la productividad volumétrica. En este aspecto es de interés la tolerancia de la levadura a la concentración de etanol la que oscila entre el 8 y el 18 %, según las especies. El género Saccharomyces tolera hasta un 11 % de etanol. Este producto difunde pasivamente a tra- vés de la membrana celular de la levadura tratan- do de igualar las concentraciones dentro y fuera de la célula. Un nivel de etanol superior al 11 % tiene como consecuencia la disolución de los lípidos de las membranas celulares y la interfe- rencia en el metabolismo de éstos. A esos niveles de etanol no se forma ergosterol y otros lípidos saturados necesarios para las membranas. En la actualidad, a escala mundial, una de las sendas investigativas en este campo es la búsqueda de cepas que toleren concentraciones de etanol ma- yores que los niveles señalados. Otra alternativa estudiada es el arrastre del etanol que está siendo sintetizado mediante vapor. /23, 24, 25/ En la fermentación clásica se obtuvo un máxi- mo de 18,69 g/L de producción de etanol a las 36 h de iniciada la fermentación mientras que con las células inmovilizadas en alginato el valor máximo se obtuvo a las 6 h con 23,40 g/ L. Respecto a la productividad en la fermentación clásica fue de 0,54 g/L/h a las 8 h y en la fermentación con alginato fue de 3,90 g/L/h a las 6 h de fermentación. De acuerdo con los resulta- dos del análisis estadístico, p =0,05, la producti- vidad es mayor en la forma inmovilizada que en la fermentación clásica. /9, 35/ Durante la síntesis de etanol por la vía fermentativa fueron controlados diferentes fac- tores que influyen en la producción y la produc- tividad /23/, resultados que se exponen a conti- nuación. En las figuras 3 y 4 se muestra el comporta- miento de la acidez total y acidez volátil obser- vándose un incremento ligero de la acidez volátil durante las 10 h iniciales para luego mantenerse similares. En la fermentación clásica la acidez total posee un incremento más lento, lo que se corresponde con un metabolismo menor eviden- ciado por el nivel de etanol obtenido aunque en general, no existen diferencias significativas en los valores de estos dos índices excepto para el valor de la media de la fermentación clásica a tiempo cero que es significativamente inferior a las demás medias. Fig. 2 Representación comparativa de la productividad en gramos de etanol en la cepa de Saccharomyces cerevisiae Scer 02 en gramos de etanol por litro de medio melaza en horas (g/L/horas) en dos condiciones de cultivo: Fermentación clásica y células inmovilizadas en alginato de calcio. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4ETANOL ( g/L/h ) 0 3 4 5 6 7 8 24 36 48 TIEMPO ( horas ) PRODUCTIVIDAD DE ETANOL Ferm. clásica Inmov. en alginato
  • 6. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 49 La viabilidad fue superior en alginato de cal- cio a las 48 h de iniciada la fermentación (figura 5) con 80,22 % y es 67,06 % en la fermentación clásica. Durante todo el proceso fermentativo la viabilidad siempre fue superior en la fermentación con las leva- duras inmovilizadas en alginato de sodio, aunque estas diferencias no son estadísticamente significativas. Fig. 3 Representación comparativa de los valores de acidez total medida como gramos de ácido tartárico por cada 100 mL de medio melaza en cultivo batch de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae Scer 02 en las condiciones de fermentaciones clásica e inmovilizadas en alginato de calcio. Los resultados experimentales se obtuvieron mediante la fórmula 4. 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 0 10 20 30 40 50 60 TIEMPO (horas ) GdeACIDOTARTARICO/100mL Ferm. clásica Inmov. en alginato Fig. 4 Comparación de la acidez volátil en las fermentaciones clásica e inmovilizadas en alginato de calcio y en medio melaza por S. cerevisiae Scer 02 en un cultivo batch. Los resultados experimentales se obtuvieron mediante la fórmula 5. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 10 20 30 40 50 60 TIEMPO (horas ) GDEACIDOACETICO/100mL Ferm. clásica Inmov. en alginato
  • 7. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200350 En la figura 6 aparecen los contenidos de azúcares reductores observándose que los resul- tados se mantienen más altos en la fermentación clásica indicando una menor utilización de éstos. En la fermentación en alginato es inferior, donde a las 48 h sólo quedaba el 2,37 % frente a 4,49 % en la fermentación clásica. El nivel de los azúca- res reductores descendió significativamente a las 36 h (fermentación clásica) en relación con el nivel de su utilización a las 7 y 8 h. La mayor densidad poblacional y las restantes ventajas de la inmovilización explican estas diferencias. En la síntesis fermentativa del etanol siempre existe un incremento en el número de células y es mayor en la inmovilización con alginato (figura 7). En correspondencia con esto la viabilidad Fig. 5 Comparación de la viabilidad en la cepa de levadura S. cerevisiae Scer 02 durante la fermentación alcohólica en medio melaza en las condiciones de fermentación clásica e inmovilizada en alginato de calcio. VIABILIDAD DE LAS LEVADURAS 60 65 70 75 80 85 0 3 4 5 6 7 8 24 36 48 TIEMPO (horas) %DEVIABILIDAD Ferm. clásica Inmov. en alginato Fig. 6 Comportamiento de los azúcares reductores durante la síntesis de etanol en el medio melaza durante las fermentaciones clásica e inmovilizada en alginato de calcio. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 10 20 30 40 50 60 TIEMPO (horas ) %DEAZUCARESREDUCTORES Ferm. clásica Inmov. en alginato
  • 8. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 51 (figura5) también resultó superior en la fermenta- ción con alginato. Estos resultados concuerdan con la mayor producción y productividad en la forma inmovilizada respecto a la forma clásica (figuras 1 y 2). Hay un descenso del nivel de los azúcares reductores siendo mayor en las formas inmovilizadas, lo que se corresponde con el nivel del producto (figura 1). A las 48 h el número de células fue de 1,1E7/mL en la fermentación clásica y 3,25E7/mL en la inmovilización en alginato. Realizada la inmovilización de la cepa de Saccharomyces en estudio se procedió a evaluar ésta, según. /36/ Para ello se calculó: a) El grado de inmovilización mediante la fór- mula (1): Siendo en el alginato: b) Eficiencia de Inmovilización ( EI) mediante la fórmula (2): En alginato: c) % de Retención de Actividad Funcional (% RAF) mediante la fórmula (3): En el alginato : La eficiencia de la inmovilización fue muy buena, lo que queda corroborado por los altos por cientos de la misma, lo cual es indicativo del bajo nivel de errores experimentales y, al ser la reten- ción de la actividad funcional también alta, es posible evaluar las inmovilizaciones realizadas de muy buena calidad. Tanto en la forma inmovilizada como en la forma clásica existe incremento en el rendi- miento de proteínas concordando con el incre- mento en el número de células en ambos casos, pero resultó ser mayor en la forma inmovilizada dada a un incremento superior en la densidad poblacional (figura 8). De acuerdo con estu- dios previos estas proteínas unicelulares son de buena calidad y no existen problemas de toxicidad presentando, adicionalmente, un ín- dice de digestibilidad aceptable, característi- cas que permiten su utilización en la alimenta- ción animal. /31/ GI = 31,25 - 10,25 100 = 85 % 25 * EI% = 31,25*10 31,25*10 100 = 97 % 7 7 − 0 75 107 , * . c h % .RAF = 16,72 g / L 17,13 g / L 100 = 97,6 % Fig. 7 Comparación del número de células promedio (biomasa) en el crecimiento en medio melaza de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae Scer 02. en la fermentación clásica e inmovilizada en alginato de calcio. En los dos casos es cultivo batch. Los valores del eje Y se multiplican por 107 y corresponden a 1 mL del medio de cultivo. BIOMASA CELULAR 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 3 4 5 6 7 8 24 36 48 TIEMPO (dias ) NUMERODECELULAS Ferm. clásica Inmov. en alginato
  • 9. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 200352 Fig. 8 Obtención de proteínas a partir de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae Scer 02 en medio melaza de caña, en cultivo batch, en las formas movilizadas e inmovilizadas. Contenido de proteínas 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 3 4 5 6 7 8 24 36 48 Tiempos (Horas) g/mLdeproteínas Clásica Alginato Conclusiones La producción y la productividad de etanol y la obtención de proteínas unicelulares por parte de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae Scer 02 es mayor cuando la levadura está inmovilizada en alginato de calcio comparada con la forma no inmovilizada, ambas en medio melaza de caña y cultivo batch. Bibliografia 1. Abeles, Robert H.; Perry A., Frey; William P., Jencks; Biochemistry, London, Edit. Jones and Bartlett Publishers, 1992. 2. Blanco, Gladis; Herryman, Maribel, "Evaluación económica de la producción de alcohol con dife- rentes tecnologías", en Revista ICIDCA, vol. XXI, núm. 2, 1987, págs. 17-20. 3. Cabello Velazco, A.; Microbiología Industrial. Manual de laboratorio, IPN México, 1989. 4. Chávez, María de los Ángeles, Ingeniería de las Proteínas, Curso de postgrado, Universidad de La Habana, 1996. 5. Chechetkin, A. V.; Voronianski, V. I.; Pokusay G. G. et al., Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral, Moscú, Editorial Mir, l984. 6. Colectivo de autores, Manual de prácticas de bioquímica de las proteínas, Universidad Haba- na, Impresora Universitaria, 1983. 7. Collins, G. H.; Lyne, P. M., Microbiological Methods, 5ta ed., London, Butterworth and Co, 1995. 8. Cougill, R. W.; Pardec, A. B.; Técnicas de inves- tigación bioquímica, Madrid, Editorial Alhambra S.A., l997. 9. Dixon, Wilfrid J.; J. Massey Frank: Introducción al Análisis Estadístico, La Habana, Instituto Cu- bano del Libro, Cuba, 1968. 10.García, José L.; Suárez, Manuel, "Producción discontinua de alcohol con células inmovilizadas, Reactor de 200 L", en Revista ICIDCA, vol. XXVI, No. 2- 1, l992. 11.GonzálezPérez,Manuel;GrossCobas,Pedro;Ramos, Vito De Deus, Estudio de la producción de etanol por una cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio y a temperatura ambiente,MemoriasConferenciadeQuímicaenRevis- ta de Química, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba, 2000. 12.González Anadón, Gloria; Economics and optimization in design and operation of fermentation processes, Monografía Curso de In- geniería de los Procesos Biotecnológicos, Bellaterra, España, 14.1-14.19, 1993. 13.Grost, W. J.; Kraayenbrink, M. R.; Van Der Lans,
  • 10. TECNOLOGÍA QUÍMICA Vol. XXIII, No. 1, 2003 53 R. G. J. M.; Lyben, K. Ch. A. M., "Ethanol production in an integrated fermentation / membrane sistem process simulation and economics", en Bioprocess Engineering, núm. 8, 1993, págs. 189-201. 14.Hachn, H., Bioquímica de las fermentaciones, Madrid, Ediciones Aguilar S.A., l956. 15.Herrera Guirola, Alberto L., Manual de medios de cultivo, La Habana, Editorial Científico-técnica, l985. 16.ICIDCA; La industria de los derivados de la caña de azúcar, La Habana, Editorial Científico Técni- ca, 1986. 17.Klein, J.; Vorlop, K. D.; Inmobilization Techniques Cells, in Moo-Young, A. E. Humprey (eds) Comprehensive Biotechnology , vol. II, Oxford, Pergamon Press, 1994. 18.Klibansky Delgado, Miriam, Alcohol etílico. Ca- pítulo XII en La industria de los derivados de la caña de azúcar, 1986, pág. 341-349. 19._____________________, Bioquímica de las fer- mentaciones, Curso de post-grado, ICIDCA, Ciu- dad Habana, l998. 20.Kleman, Gary I.; WILLIAM R. STROHL (1993), High cell density and high productivity microbial fermentation. Current Biology Ltd, 1619: 93-99. 21.LEHNINGER A.: Bioquímica, Ediciones Omega S.A, Casanova, 1991. 22.MAJORELA, B. L.; H. W. BLANCH AND C. R. WIKE (1984), Economic Evaluation of Alternative Ethanol Fermentation Processes. Biotechnology and Bioenginering, vol. XXVI:1003-1025. 23.MANRESA, ANGELA: Transformación de resi- duos orgánicos por microorganismos. Curso de postgrado, Universidad de Oriente, Universidad de Barcelona, (CEBI), Santiago de Cuba, p 74, 1998. 24.MARTÍNEZ (A), ELENA; GUTIRREZ, LILIAN; CHAMIZO, ADA Y OTROS (l987), Potencialidad de levaduras deficientes respiratorias para la pro- ducción de etanol. Revista ICIDCA, Vol XXI, No 2: 1-3. 25.MARTINEZ (B), ALBIS; PILAR VLLAR E. VALDES (1987), Las mieles de blanco directo en la fermentación alcohólica. Revista ICIDCA, Vol. XXI, 1: 1-4. 26.MATOS, LLORENTES EUDIS: Estudio de la pro- ducción de etanol por las cepas Saccharomyces cerevisiae Scer02 y Saccharomyces cerevisiae EV 98 inmovilizadas en agar, Tesis de grado, Depar- tamento de Biología, Universidad de Oriente, Pp 55, 1999. 27.MELO RAMOS, VITO DE DEUS: Estudio de la producción de etanol por las cepas Saccharomyces cerevisiae Scer 02 y Saccharomyces cerevisiae EV 98 inmovilizadas en alginato de sodio, Tesis de grado, Departamento de Biología, Universidad de Oriente, p 70, 1998. 28.MICHELENA, GEORGINA Y KASTANEK, FRANCISCO (1991), Modelo de flujo de un biorreactor de células inmovilizadas para la pro- ducción de etanol. Revista ICIDCA, vol. 25, No 1- 2:5-10. 29.MOAT, A. G. (1959), Selection and isolation of auxotrophic yeast mutants with the aid of antibiotics. J. Bacteriology, 7: 673-675. 30.NATELSON SAMUEL: Microtécnicas de Quími- ca Clínica, Ediciones Toray, S. A., Barcelona, España, 1964. 31.OTERO, MIGUEL A. ( 1985): Proteína unicelular para el consumo humano. Editorial Científico- técnica. Habana, Cuba. 32.PÉREZ PARDO, JOSÉ LUCAS: Generación de levaduras Saccharomyces cerevisiae en destilería de alcohol etílico: una alternativa para la alimen- tación animal.(No publicado).Centro de Investi- gaciones de Bioalimentos, Morón, Ciego de Avila, p 14, 1998. 33.ROIG, HEINE Y JOSÉ NAVARRO: Influencia de la concentración celular en la fermentación alco- hólica, Monografía, Departamento de Biología, Universidad de Oriente, 1988. 34.SAINZ, PASCUAL (1993), Strategies in the improvement of the production of metabolites of industrial interest by microorganism, Ingeniería de los Procesos Biotecnológicos, Barcelona: 7.1- 7.27. 35.SIGARROA, A.: Biometría y diseño experimen- tal, 2da parte, Editorial Pueblo y Educación, Ciudad de la Habana, 1985. 36.SUTAR, H. G.; VOSTAK, J.; SRINIVASAN, M.C. AND SIVA RAMAN H. (l986): Production of alkaline protege by inmovilized mycelium of comidiobulus. Microb. Technol. Vol 8, October: 632-634. 37.TANAKA, HIDEO NIIHARIGU; HIROSHI KUROSAWA HITACHI; MIZUO YAJIMA : No- vel inmovilized cells and fermentation method utilizing the same. Patente número 5,037,740 (USA), 1991. 38.38. TAYLOR, R. F.: Protein inmovilization, Fundamentals and applications, Ed. Marcel Decker Inc., N. Y., 1991. 39.WILCHER, F..J., Standart Methods of Chemical Analysis, Six Edditian., Vol. 2., Part 3, New York, 1968. 40.WINTON, A. L. AND WINTON, K. E. (1968): Análisis de los Alimentos. Editorial Ciencia y Técnica.