1. François Meurens Aspirant FNRS Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Vétérinaires 2003/2004 Influence du délai de surinfection et de la parenté génétique sur la recombinaison de l’herpèsvirus bovin 1 Influence of superinfection delay and genetic relatedness on bovine herpesvirus 1 recombination UNIVERSITE DE LIEGE FACULTE DE MEDECINE VETERINAIRE Département des Maladies Infectieuses et Parasitaires Virologie, Pathologie des maladies virales et Epidémiologie

2. PLAN Introduction Ann. Méd. Vét., 2001, 145, 108-119 Virologie, 2003, 7, 319-328 Etude 1 : « Superinfection prevents recombination of the alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1 » J. Virol. 2004, 78, 3872-3879 Etude 2 : « Interspecific recombination between two ruminant alphaherpesviruses, bovine herpesviruses 1 and 5 » J. Virol., 2004, 78, 9828-9836 Etude 3 : « Mixed DNA concatemers reveal recombination between alphaherpesviruses originating from different animal species » Manuscrit en préparation Conclusions générales et perspectives Objectif

3. INTRODUCTION

5. Première description remonte au début des années 50 aux USA (Schroeder et Moys, 1954 ; Mc Kercher et al., 1954) Première description en 1841 par Büchner 1) La rhinotrachéite infectieuse bovine Rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR) Vulvovaginite infectieuse pustuleuse (IPV) « Bläschenausschlag » (Tromsdorf, 1894) INTRODUCTION

6. Limbourg et al. , 2002, Boelaert et al. , 2000 2) Enjeux Séroprévalence de troupeau en Belgique Conséquences cliniques et restrictions dans le commerce du bétail, des embryons et de la semence Ils peuvent en conséquence interdire l’importation d’animaux ou de certains produits d’origine animale en provenance des autres pays européens Indemnes 66,7 % FIN INTRODUCTION SWE CHE AUT DNK Bolzano

7. 3) L’herpèsvirus bovin 1 (BoHV-1) Morphologie des herpèsvirus Capside + ADN Tégument Glycoprotéines Enveloppe INTRODUCTION

8. 3 sous-familles Alphaherpesvirinae Betaherpesvirinae Gammaherpesvirinae 4 genres Simplexvirus Varicellovirus : herpèsvirus bovin 1 Mardivirus Iltovirus 4) Classification sur la base des propriétés biologiques INTRODUCTION

9. M uHV-1 Groupe Ex. LTR RTR R4 R3 R2 R1 U L I R T R U S Isomères 1 1 1 2 a n b b’ a’ n c ’ c a U L 4 1 D E F HHV-6 B o HV-4 HHV-4 B o HV‑1 H HV-1 A B C U s 5) Classification sur la base de l’organisation génomique INTRODUCTION α

11. 1) Attachement 1 2) Pénétration 2 3) Réplication 3 4) Clivage 5) Encapsidation 4 5 6) Maturation 7) Sortie 6 7 7) Cycle viral α β γ 6 INTRODUCTION HSV-1 Cercles roulants Concatémères

12. BoHV-1 BoHV-1.2 BoHV-1.1 Profil de restriction Acs monoclonaux 8) Les sous-types de BoHV-1 INTRODUCTION

13. 9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1 L’herpèsvirus bovin 5 (BoHV-5 , ex BoHV-1.3) méningo-encéphalite chez le bovin L’herpèsvirus des cervidés 1 (CvHV-1 , ex CerHV-1) kérato-conjonctivite chez le cerf L’herpèsvirus des cervidés 2 (CvHV-2 , ex RanHV-1) asymptomatique chez le renne L’herpèsvirus caprin 1 (CpHV-1 , ex CapHV-1) troubles génitaux chez la chèvre INTRODUCTION

14. Arbres phylogéniques (gB, gD). L’arbre A a été généré selon la méthode « neighbour joining », l’arbre B selon la méthode de parcimonie (Ros et Belàk, 1999) 9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1 CvHV-2 CvHV-1 BoHV-5 BoHV-1.2 BoHV-1.1 CpHV-1 PrV BoHV-1.1 BoHV-1.2 BoHV-5 CvHV-1 CvHV-2 CpHV-1 PrV INTRODUCTION

15. Thiry et al., 2002 9) Alphaherpèsvirus apparentés au BoHV-1 INTRODUCTION

16. 10) La recombinaison 4 types La recombinaison homologue La recombinaison spécifique de site La transposition La recombinaison illégitime La recombinaison, au sens génétique du terme consiste en la génération de nouvelles combinaisons de matériel génétique (Dressler et Potter, 1982 ; Bujarski, 1999 ; Umene, 1999) Umene, 1999 INTRODUCTION

17. 4 types La recombinaison homologue La recombinaison spécifique de site La transposition La recombinaison illégitime La recombinaison, au sens génétique du terme, consiste en la génération de nouvelles combinaisons de matériel génétique (Dressler et Potter, 1982 ; Bujarski, 1999 ; Umene, 1999) Umene, 1999 HERPESVIRUS 10) La recombinaison INTRODUCTION

19. 11) Recombinaison et alphaherpèsvirus -Le virus de la maladie d’Aujeszky (PrV) (Dangler et al., 1994 ; Glazenburg et al., 1994 ; Henderson et al., 1990) -Les herpèsvirus simplex 1 et 2 (HSV-1 et 2) (Brown et al., 1973 ; Halliburton et al., 1980 ; Umene, 1985 ; Javier et al., 1986 ; Preston et al., 1978) -Le virus de la varicelle et le zona (VZV) (Dohner et al. 1988 ; Muir et al., 2002) Identification de recombinants in vitro et in vivo -L’herpèsvirus félin 1 (FeHV-1) (Fujita et al. 1998) INTRODUCTION -Le BoHV-1 (Schynts et al., 2001, 2003) Fréquence +/- 30 % BoHV-1

20. 12) Facteurs influençant la fréquence de recombinaison Parenté génétique (Halliburton et al., 1977) Dose de virus inoculé Distance entre les sites d’inoculation Séparation temporelle des infections (2 h) Localisation des marqueurs de détection In vivo (Glazenburg et al., 1994) INTRODUCTION L’interférence L ’ensemble des mécanismes qui, suite à une infection virale, limitent et empêchent la multiplication d’un autre virus au sein des cellules saines ou infectées

22. Présentation de la prévention de la surinfection due à la glycoprotéine D chez le virus herpès simplex 1 (adapté d’après Campadelli-Fiume et al., 2000 ) PREVENTION DE LA SURINFECTION INTRODUCTION Récepteur primaire Récepteur secondaire gD sauvage gD mutante HSV-1 sauvage HSV-1 mutant Cellule sauvage Cellule sauvage Cellule exprimant gD Cellule exprimant gD et le récepteur secondaire

23. 14) Vaccination Plan de lutte en vigueur depuis le 1er septembre 1997 (arrêté royal du 30 août 1997) vaccins marqués gE- permettant la différenciation des animaux infectés des animaux vaccinés Vaccins « vivants » 1. vaccins atténués - par délétion de gènes (gène gE) 2. vaccins vectorisés - réplicatifs - non réplicatifs Vaccins inertes 1. vaccins inactivés délétés 2. vaccins sous unitaires - glycoprotéines 3. ADN plasmidique INTRODUCTION

24. Cette étude intervient dans l’évaluation du risque de recombinaison lié à l’utilisation de vaccins « vivants » INTRODUCTION

25. OBJECTIF

26. Préciser l’influence de deux paramètres sur la génération de virus recombinants 1) Le délai de surinfection 2) La parenté génétique Objectifs

27. Etude 1 Evaluer l’effet du délai entre infections sur la génération de virus recombinants Etudes 2 et 3 Evaluer les possibilités de recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants A l’issue du cycle viral 2 Au niveau des intermédiaires de réplication 3 Avant et à l’issue du cycle viral 1 Objectifs

28. ETUDE 1

29. La surinfection constitue un frein à la recombinaison de l’herpèsvirus bovin 1 Superinfection prevents recombination of the alphaherpesvirus bovine herpesvirus 1 F. Meurens, F. Schynts, G.M. Keil, B. Muylkens, A. Vanderplasschen, P. Gallego, and E. Thiry J. Virol. (2004) 78, 3872-3879

30. TROIS APPROCHES ELECTROPHORESE A CHAMP PULSE IMMUNOFLUORESCENCE CYTOMETRIE EN FLUX Etude 1

31. 1) Influence du délai de surinfection : immunofluorescence Isolement et caractérisation des virus générés Suspension virale résultant des infections Isolement des virus par repiquage Réplication des isolats Caractérisation des isolats par immunofluorescence MDBK Etude 1 Lam gC-gE+ Lam gC+gE- Coinfection & Surinfections

32. 4 populations virales générées gC-gE+, gC+gE-, gC-gE- (R), gC+gE+ (R) 1) Influence du délai de surinfection : immunofluorescence Etude 1

33. A B Temps entre les infections BoHV-1 gC-gE+ et gC+gE- (h) Temps entre les infections BoHV-1 gC+gE- et gC-gE+ (h) Pourcentages relatifs des populations virales générées 1) Influence du délai de surinfection : immunofluorescence Etude 1 gC+gE+ gC-gE- Recombinants gC-gE+ gC+gE- Parentaux

34. 2) Influence du délai de surinfection : cytométrie en flux Analyse des cellules par cytométrie en flux afin de déterminer le niveau d’expression de la  -gal Etude 1 MDBK Incubation Coinfection & Surinfections ST STBG gE-  -gal+ gE+

35. FL2 : fluorescence liée à gE FL1 : fluorescence liée à  -g al ST 0/ STBG 0 h ST 0/ STBG 2 h ST 0/ STBG 4 h ST 0/ STBG 8 h ST 0/ STBG 6 h 2) Influence du délai de surinfection : cytométrie en flux Etude 1

36. 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulsé Analyse par électrophorèse à champ pulsé pour détecter la présence de concatémères mixtes signalant des événements de recombinaison MDBK Incubation Etude 1 Coinfection & Surinfections ST STBG gE-  -gal+

37. ST (135 301 pb) B o HV-1 STBG est digéré par Xba I B o HV-1 ST n’est pas digéré par Xba I 114 212 124 006 - 1714 pb (gE) = 122 292 pb STBG (138 118 pb) 7488 611 102 918 114 212 126 842 138 118 Xba I 122 325 126 207 2 Virus La coinfection produit des concatémères mixtes gC gD gE 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulsé ß - gal Etude 1

38. I R T R U L U S ST STBG XbaI XbaI XbaI XbaI 134 kpb 409 kpb 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulsé Concatémères mixtes Etude 1 XbaI 409 kpb 134 kpb

39. 3) Influence du délai de surinfection : électrophorèse à champ pulsé Etude 1 Xba I Xba I Xba I Xba I 134 kbp 271 kbp 409 kbp ST STBG Xba I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MW 10 MIX kbp 50 100 150 200 271 409 134 ST/STBG MIX 2 4 6 8 Xba I kbp 271 134 A B C 271 409 134 19 ST STBG MIX 1X MIX ST STBG ST STBG MIX Concatémères Mixtes

40. CONCLUSIONS Un intervalle de plus de 2 h entre les infections réduit drastiquement la génération de virus recombinants La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est possible que dans un laps de temps restreint Le choix des virus peut influencer l’établissement plus ou moins rapide de la barrière à la surinfection Etude 1

41. ETUDE 2

42. Recombinaison interspécifique entre deux alphaherpèsvirus de ruminants, les herpèsvirus bovins 1 & 5 Interspecific recombination between two ruminant alphaherpesviruses, bovine herpesviruses 1 & 5 F. Meurens, G.M. Keil, B. Muylkens, S. Gogev, F. Schynts, S. Negro, L. Wiggers, and E. Thiry J. Virol. (2004), 78, 9828-9836

43. Evaluation de la recombinaison entre le BoHV-1.2 mutant & Le BoHV-1.2 Le BoHV-1.1 Le BoHV-5 Le CvHV-2 Le CpHV-1 Tous ces virus peuvent potentiellement se rencontrer en conditions naturelles Etude 2

44. Protocole BoHV-1.2 mutant Etude 2 a b c GFP cassette gC 10kbp UL46 U L U S gE --gD gI 1kbp RFP cassette ----- IR TR BoHV-1.2/  gC-GFP-  gI-RFP

45. GFP RFP BoHV-1.2 BoHV-1.1 BoHV-5 CvHV-2 CpHV-1 BoHV-1.2/ D gC-GFP- D gI-RFP Protocole Coinfections GFP-/RFP- GFP+ / RFP+ Parentaux Etude 2 X GFP+/ RFP- GFP- /RFP+ Recombinants

46. BoHV-1.2/ BoHV-1.1/ BoHV-5/ CvHV-2/ CpHV-1/ BoHV-1.2  gC-GFP-  gI-RFP Pourcentages relatifs des populations virales générées Situations de coinfection GFP-/ RFP+ GFP+ /RFP- Recombinants GFP-/RFP- GFP+ / RFP+ Parentaux Caractérisation des virus issus des coinfections Etude 2 2

47. Pas de recombinants avec : CvHV-2 CpHV-1 Pourrait être dû à une trop grande désynchronisation des cycles viraux de ces virus par rapport au BoHV-1 1) Etablissement des cinétiques de pénétration et de multiplication virale des virus utilisés 2) Coinfections différées sur base des résultats obtenus de manière à favoriser l’émergence de recombinants avec le CvHV-2 et le CpHV-1 Etude 2

48. % protected time (min) time p.i. (h) titer (log 10 pfu/ml) Cinétique de pénétration Cinétique de multiplication BoHV-1.2  gC-GFP-  gI-RFP < < CvHV-2 CpHV-1 BoHV-1.1 BoHV-5 BoHV-1.2 < CvHV-2 CpHV-1 < BoHV-5 BoHV-1.1 BoHV-1.2 BoHV-1.2  gC-GFP-  gI-RFP CpHV-1 CvHV-2 BoHV-5 BoHV-1.1 BoHV-1.2 BoHV-1.2/  gC-GFP-  gI-RFP Etude 2 CpHV-1 CvHV-2 BoHV-5 BoHV-1.1 BoHV-1.2 BoHV-1.2/  gC-GFP-  gI-RFP

49. CvHV-2 >> BoHV-1.2  gC-GFP-  gI-RFP Introduction de délai entre l’infection par le BoHV-1.2 mutant et le CvHV-2 T0 : BoHV-1.2 mutant T+2 h : CvHV-2 Etude 2 Pourcentage relatif des populations virales générées Situation de coinfection CvHV-2/ BoHV-1.2  gC-GFP-  gI-RFP GFP-/RFP- GFP+ / RFP+ Parentaux Recombinants Avec le CpHV-1 Idem

50. Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5 Marquage Réactivité des différents anticorps monoclonaux contre le BoHV-1, le BoHV-5, et les 2 recombinants obtenus des coinfections BoHV-1/BoHV-5 Ac BH35 gE du BoHV-1 Ac 1507 gC du BoHV-1 Ac 2F12 gI/gE du BoHV-1 Ac 2915 gC du BoHV-5 Ac 1624 BoHV-5 Etude 2

51. Caractérisation des recombinants BoHV-1/BoHV-5 Profil de restriction Profil de restriction HindIII des virus parentaux et recombinants 1 : BoHV-1.2  gC-GFP-  gI-RFP , 2 : BoHV-5, R1 : Recombinant 1, R2 : Recombinant 2 , 3 : BoHV-1.2  gC-GFP , 4 : BoHV-1.2  gI-RFP Localisation du crossover simple potentiel chez R1 & R2 R1 R2 Dominante BoHV-5 Dominante BoHV-1 Etude 2 MW 5 4 8 6 10 23.1 50 100 kpb 3 4 R1 R2 1 2 1 2 3 CO U L U S GFP RFP IR TR gC BoHV-5 gE BoHV-1.2 R1 R2

52. CONCLUSIONS Deux recombinants BoHV-1/BoHV-5 ont été isolés La recombinaison entre alphaherpèsvirus n’est détectable que lorsqu’ils sont phylogéniquement très proches R1 est proche du BoHV-5 et R2 du BoHV-1 La méthode sélectionnée permet d’évaluer rapidement et facilement la recombinaison entre alphaherpèsvirus Etude 2

53. ETUDE 3

54. Les concatémères mixtes révèlent la recombinaison entre alphaherpèsvirus provenant d’espèces différentes Mixed DNA concatemers reveal recombination between alphaherpesviruses originating from different animal species F. Meurens, B. Muylkens, G.M. Keil, F. Schynts, A. Vanderplasschen, D. Ziant, and E. Thiry Manuscrit en préparation

55. Deux aspects Recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants au niveau concatémérique Inhibition de la surinfection entre alphaherpèsvirus de ruminants Au niveau concatémérique Au niveau de l’expression de la GFP du virus surinfectant Etude 3

56. Analyse de la recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants au niveau concatémérique I R T R U L U S VIRUS 1 VIRUS 2 Enz Enz Enz Enz X kpb 3X kpb Couples d’alphaherpèsvirus testés : Etude 3 BoHV-1.2 ST PrV CvHV-2 CvHV-1 BoHV-1.2 ST CpHV-1 BoHV-1.1 CvHV-2 BoHV-1.2 ST CvHV-1 BoHV-1.2 STBG BoHV-5 BoHV-1.1 BoHV-5 BoHV-1.2 ST BoHV-1.1

57. Analyse de la recombinaison entre alphaherpèsvirus de ruminants au niveau concatémérique Etude 3 Fragments de grande taille CvHV-2/BoHV-1.1 BoHV-1.1/BoHV-1.2 ST BoHV-5/BoHV-1.1 CvHV-2/CvHV-1 Concatémères mixtes Recombinaison entre concatémères

58. Inhibition de la surinfection entre alphaherpèsvirus de ruminants Au niveau concatémérique T 0 T x Etude 3 A BoHV-1.2 ST/BoHV-1.1 2 h BoHV-5/BoHV-1.2 STBG B 2 h BoHV-1.2 STBG/CvHV-2 C 2 h BoHV-1.2 ST/CpHV-1 D 4 h

59. Inhibition de la surinfection entre alphaherpèsvirus de ruminants T0 : alphaherpèsvirus T+4 h : BoHV-1.2 GFP Au niveau de l’expression de la GFP du virus surinfectant Etude 3 BoHV-1.2 GFP Un intervalle de 4 h ne permet plus l’expression de la GFP du BoHV-1.2 surinfectant

60. CONCLUSIONS L’inhibition de la surinfection est conservée parmi les alphaherpèsvirus de ruminants La recombinaison est détectée au niveau concatémérique entre BoHV-1.1 BoHV-1.2 BoHV-5 BoHV-1.1 CvHV-2 BoHV-1.1 CvHV-1 CvHV-2 Etude 3

61. Conclusions générales et perspectives

62. Etapes Contraintes -Prévalence des infections -Spécificité d’hôte -MOI -Interférence virale -Virulence et invasivité -Clairance immune rapide -Prévention de l’infection secondaire - Management -Biologie de l’hôte -Site d’entrée, d’inoculation VIRUS HOTE -Inhition de la surinfection -Spécificité -Virulence et invasivité VIRUS -Réponse immune (INF) -Sensibilité et permissivité cellulaire -Accessibilité cellulaire -Cycle cellulaire CELLULE -Homologie génétique -Virulence et invasivité VIRUS -Réponse immune HOTE Virus recombinants + - - - + + Viabilité Dominance Compétition 1) COINFECTION DE l’HOTE 2) COINFECTION CELLULAIRE 3) REPLICATION & RECOMBINAISON 4) SELECTION Paramètres influençant la recombinaison Conclusions

63. Conséquences : 1) Vaccination Risque de recombinaison entre les virus sauvages et vaccinaux suite à l’utilisation de vaccins vivants (IN) lors d’épidémies d’IBR La recombinaison survient en situation de coinfection La recombinaison survient en situation de surinfection lorsque le délai est court

64. Conséquences : 2) Evolution La recombinaison dépasse la barrière d’espèce, des recombinants interspécifiques peuvent être générés Evolution Epidémiologique

65. Perspectives Etude 1 : étude in vivo , mécanisme(s) d’inhibition de la surinfection (gD, attachement, pénétration) Etude 2 : étude in vivo des recombinants BoHV-1/BoHV-5, génération de recombinants in vivo , carte précise des recombinants (localisation des crossovers), étude de la recombinaison avec le BuHV-1 et l’ElkHV-1 Etude 3 : identification de recombinants BoHV-1/CvHV-2, tester de nouvelles combinaisons d’alphaherpèsvirus Conclusions

66. Merci pour votre attention