Práctica Formula Roja

1. FORMULA ROJA
INTRODUCCION.
La eritropoyesis es el proceso que corresponde a la generación de los glóbulos rojos (también conocidos como
eritrocitos o hematíes). Los eritrocitos son los elementos formes cuantitativamente más numerosos de la
sangre. La hemoglobina es uno de sus principales componentes, y su objetivo es transportar el oxígeno hacia
los diferentes tejidos del cuerpo. Los eritrocitos humanos carecen de núcleo y de mitocondrias, por lo que
deben obtener su energía metabólica a través de la fermentación láctica.
FUNDAMENTO.
Este Tipo De Prueba Consiste En El Estudio Cualitativo Y Cuantitativo De Los Eritrocitos. Es por eso que se lleva
a cabo diferentes pruebas que son: determinación de la hemoglobina, hematocrito, recuento de glóbulos
rojos e índices hematocritos; que estos a su vez nos ayudan a descartar enfermedades que con estos estudios
se puedan realizar.
Vamos a resumir estas técnicas:
Los índices Los índices eritrocitarios son una serie de parámetros que expresan diferentes características de
los hematíes.
Los tradicionales se calculan a partir de los valores obtenidos, previamente, del
número de hematíes (en millones por mm3), del hematocrito (en %) y de la concentración de hemoglobina en
la sangre (en g/dl).
Para el conteo de eritrocitos, se usan métodos sistemáticos que son más rápidos y precisos, y los métodos
manuales.
Todo método manual de recuento celular incluye 3 fases:
ü Dilución de la sangre
ü Muestreo de la sangre diluida en un volumen
ü Recuento de células en ese volumen
La determinación de hemoglobina es una prueba la cual mide los gramos en decilitro en la sangre, es un
técnica muy sencilla.
Y por últimos la técnica de hematocrito. Este examen mide el volumen (cantidad) de glóbulos rojos en la
sangre, comparado con otros componentes. Los resultados del examen se informan como un porcentaje o
como un fragmento decimal de sangre entera. Este examen puede ser usado para evaluar o manejar
enfermedades
OBJETIVO.
Que el alumno a través de esta práctica que la forman tres técnicas diferentes las sepa llevar a cabo en un
laboratorio clínico, y sepa llevar a cabo la prueba y las fórmulas de los resultados obtenidos en dicha prueba.

2. PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES.
RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS
MATERIAL.
 pipeta de Thoma para glóbulos rojos (perla roja)
 Equipo para venopuncion (Tubo lila)
 Boquilla roja
 Tubo de plástico
 Tubos de ensayo
 Papel parafin
 Cámara de Neubauer
 Cubrehematimetro
 Microscopio
 Gasas
SUSTANCIAS
 Alcohol al 70%
 Sangre venosa
 Liquido de Hayem
PROCEDIMIENTO.
1. Preparación de la muestra.
2. Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer
Se toman 10 uL de la mezcla preparada en el paso 1 con la micropipeta.
1) Se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer, y se coloca en posición horizontal sobre la mesa,
en un lugar donde nos sea cómodo pipetear.
2) se introduce una punta desechable en el extremo de la micropipeta,
3) se ajusta la micropipeta para succionar 10 uL de líquido. Generalmente este ajuste se realiza girando el
botón del embolo para seleccionar el volumen deseado.
4) se introduce la punta de la micropipeta en la muestra
5) Se pulsa el pistón o embolo superior de la pipeta suavemente hasta que se siente como el pistón llega al
final de su recorrido.
6) Se saca la punta de la pipeta de la muestra, y siempre manteniéndola en posición vertical se lleva hasta la
cámara de Neubauer.

3. 7) Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de la cámara de Neubauer. Se
trata de dejar que el líquido penetre entre la cámara y el cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad.
8) Se suelta el pistón suavemente mientras se supervisa que el líquido está entrando correctamente y de
forma uniforme en la cámara.
9) En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya salido bien, repetir la
operación
Ya tenemos la cámara de Neubauer cargada, lista para el recuento celular.
PASO 3. Preparación y enfoque del microscopio.
1) Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. En este ejemplo vamos a contar 5 cuadros
grandes de una cámara de NeubauerImproved de 0,1mm de profundidad.
2). Realizar el recuento de células en el primer cuadro.
En caso de que la concentración celular sea muy alta, y sea fácil perderse en el recuento, se suele utilizar un
orden de conteo en forma de zig-zag, como el descrito en la Fig.7
3). Anotar en una hoja de resultados la cantidad de células contadas en el primer cuadro.
4). Repetir el proceso para el resto de los cuadros que deseamos contar, anotando el resultado de cada uno
de ellos. Cuantos más cuadros contemos, más precisión obtendremos en nuestra medida.
PASO 4. Cálculo de la concentración.
Aplicamos la fórmula del cálculo de concentración celular.
Número de células
Concentración (cel / ml) = -------------------------
Volumen (en ml)
El número de células es la suma de todas las células contadas en todos los cuadros.
El volumen es el volumen total de todos los cuadros donde hemos hecho el recuento.
Como el volumen de 1 cuadro grande es:
0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie
0,01 cm2 * 0,1 mm (profundidad) =

4. 0,01 cm2 * 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0,0001 ml
La fórmula para recuento con cuadros grandes en cámara de Neubauer
Número de células x 10.000
Concentración = --------------------------------------
Número de cuadros
En el caso de que hayamos aplicado una dilución, deberemos trasformar la concentración obtenida durante el
recuento celular en la concentración de la muestra original.
En este caso tendremos que dividir el resultado por la dilución aplicada.
La fórmula quedará:
Número de células x 10.000
Concentración = --------------------------------------
Número de cuadros x dilución
Ejemplo:
Para una dilución de 1: 10. Dilución = 0,1
Para una dilución de 1: 100, Dilución = 0,01
Valores de referencia
(Millones de células/mm3)
Hombres:………………………………..4 500 000-5 500 000
Mujeres:…………………………...…….4 000 000-5 000 000
Niños (4 años):……….........................4 200 000-5 200 000
Lactantes (1-6 meses):....…………….3 800 000-5 200 000
Recién nacidos:………………………..5 000 000-6 000 000

5. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA:
Material y Equipo:
 Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.
 Una pipeta de vidrio graduada de 5 mil
 Pipeta semiautomática
 Tubos de ensayo.
 Cubetas cuadradas.
 Gradilla
 gasa
Reactivos:
 EDTA
 Reactivo Drabkin
 Ferrocianuro de potasio
 Cianuro de potasio
 Bicarbonato de potasio
 Solución estándar de cianometahemoglobina
Reactivos biológicos:
· Sangre venosa con EDTA.
Técnica:
1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mil de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P).
2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).
3.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la
muestra.

6. 4.-Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mil (20 μL) de sangre total, limpiar
luego la punta de la pipeta.
5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3
veces y se mezcla.
6.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución (utiliza para film para
tapar los tubos, recuerda que el reactivo tiene cianuro, el cual es un VENENO).
7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se efectúe la reacción.
8.-Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca
que se encuentra y se procede la lectura.
9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.
Antes de hacer la medición con el espectrofotómetro hacer el siguiente procedimiento
PARA HACER LA MEDICION DE TRANSMITANCIA HACER EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO:
Medición de Transmitancia:
1.- Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después seleccione la longitud de onda deseada (540
nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>. Aparecerá en la pantalla el valor numérico.
2.-Presine < %T> para Transmitancia.
Aparecerá en la pantalla “T”.
3.-Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100
%>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.
4.-Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.
Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.
5.-Si desea imprimir, oprima <PRINT> para aance de papel y/o una segunda vez para la impresión en el papel
del espectrofotómetro o <SECND REMOTE> para mandar a un dispositivo externo (a la computadora).
6.-Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y guárdela).
8.-Si no va usar más el aparato, apáguelo y cúbralo, si desea continuar trabajando, elija el modo de trabajo
siguiente y continúe.
Cálculos:
Hb total = concentración de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).
En espectrofotómetro se aplica la siguiente formula:

7. muestra/ estándar x 15 = Hb
Valores de referencia:
Niños al nacer…………………………….. 13,6 - 19,6 g/dL
Niños de 1 año…………………………..... 11,3 - 13,0 g/dL
Niños de 10 -12 años……………………... 11,5 - 14,8 g/dL
Mujeres……………………………………... 11,5 - 16,5 g/dL
Hombres……………………………………. 14,0 - 18,0 g/dL
DETERMINACION DE HEMATOCRITO
 Tubo de Wintrobe graduado de 0-100 mm
 Pipetas Pasteur
 Equipo para venopuncion (Tubo lila)
 Tubos capilares azules o rojos
 Plastilina
 Encendedor o cerillos
 Centrifuga
 Micro centrifuga
SUSTANCIAS:
 Alcohol al 70%
 Sangre venos
PROCEDIMIENTO:
Para macro hematocrito:
1. Una vez seleccionada, se desinfecta la zona con alcohol al 70%, y se practica punción venosa. La sangre
es recogida en un tubo lila con EDTA
2. Llenar el tubo de Wintrobe con la sangre extraída con anticoagulante ayudándose de una pipeta Pasteur,
comenzando desde el fondo hasta la marca superior de 100 mm, teniendo cuidado de no provocar
espuma ni dejar burbujas en el tubo.
3. Se recomienda como medida de precaución tapar el tubo con un tapón de goma para evitar la
evaporación
4. Centrifugar a 3000 rpm durante 30 minutos
5. Leer directamente de la graduación la columna de glóbulos rojos y anotar resultados

8. Para Micro hematocrito:
1. Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del dedo, o utilizar capilares azules sin
heparina para sangre venosa con anticoagulante EDTA. Debe llenarse aproximadamente 70-80% del
capilar, sin dejar burbujas de aire.
2. Ocluir (tapar) el extremo del capilar que no estuvo en contacto con la sangre, con plastilina o sellando con
fuego
3. Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de la micro centrifuga, con el extremo ocluido adherido
al reborde externo de la plataforma
4. Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 y 12 000 rpm
5. Para leer el resultado, se lleva a cabo una regla de tres, midiendo el volumen total de plasma y eritrocitos
o por medio de la regleta.
6. Para la regleta, se sostiene el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna de eritrocitos,
quede exactamente al mismo nivel de la línea horizontal correspondiente al cero
7. Desplazar el tubo a través de la escala hasta que la línea marcada con el 1.0 quede al nivel del tope del
plasma. El tubo debe de encontrarse completamente en posición vertical
8. . La línea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicara la fracción del volumen de
estos.
Valores de Referencia
Hombres: 47.0
Mujeres: 42.0
Niños (5 años) 38%-44%
Lactantes (3 meses): 37-42%
Recién nacidos: 50-58%
DETERMINACION DE INDICES ERITROCITARIOS
Material.
 Tubos de ensayo de 13 x 100mm
 Pipeta de Thoma para glóbulos blancos
 Cámara de Neubauer
 Microscopio
 Boquillas
 Gasa
 Sangre capilar o venosa con anticoagulante
Reactivos:
 EDTA (sal disódica) al 10 %
 Liquido de Turk:
Ácido acético glacial 3.0 ml
Agua destilada c.b.p. 100 ml
Adicionar 1 o 2 gotas de azul de metileno

9. Procedimiento
1.- Llenar la pipeta con sangre bien mezclados hasta la marca de .5
2.- Limpiar cuidadosamente la pipeta por fuera
3.- Aforar con solución de Turk hasta la marca de II
4.- Agitar la pipeta durante 3 min.
5.- Se desechan las primeras 4 o 5 gotas de la pipeta y se carga la cámara de Neubauer
6.-Dejar reposar la cámara durante 3 min.
7.- En el microscopio con el objetivo de 10x, se cuentan los leucocitos presentes en los cuatro cuadros
grandes de los extremos
8.- Multiplicar por 50 el promedio de los leucocitos con la siguiente fórmula
Células contadas x 20 (dilución) x 10 (corrección de altura) /
4 (núm. De cuadro de 1mm contados)
Este factor varía si se cambia la dilución y o el número de cuadros contados
*En caso de existir normoblastos (eritrocitos nucleados) deberá hacer la cuenta diferencial leucocitaria
Valores de referencia:
Leucocitos:
-Adultos: 5000 - 10 000 / mm3
- Recién nacidos: 10 000 - 25 000 / mm3
-Niños: 8000 - 15 000
BIBLIOGRAFIA.
 http://html.rincondelvago.com/manual-de-hematologia.html
 http://es.scribd.com/doc/29033747/Determinacion-de-Hb-en-Sangre-Metodo-Espectrofotometro
 http://edurirom.blogspot.mx/2012/03/practica-no-4-cuenta-de-eritrocitos.html
 http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/Hemoglobina.html
 http://www.tuotromedico.com/temas/eritrocitos.htm