Aula prática: Teste de atividades de neutrófilo

1. TESTES DE ATIVIDADE DE NEUTRÓFILOS Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em outubro de 2003

2. Os neutrófilos polimorfonucleares são leucócitos derivados da medula óssea , com tempo de sobrevida determinado, que desempenham um papel central na defesa do hospedeiro contra a infecção.

3. Leucograma A avaliação inicial das deficiências de fagócitos inclui a contagem total e diferencial de leucócitos . Leucopenia ou leucocitose persistentes podem requerer um estudo da medula óssea. A presença de grânulos gigantes em leucócitos, por sua vez, estabelece o diagnóstico de síndrome de Chediak- Higashi. Veja:

4. Avaliação da capacidade de migração A migração espontânea e a quimiotaxia podem ser estudadas pela técnica da câmara de Boyden. Consiste no uso de um filtro, membrana com microporos , colocado entre dois compartimentos de uma câmara , através do qual os leucócitos migram em direção ao compartimento contendo uma substância quimiotática. A migração celular é avaliada medindo-se a distância percorrida pelas células através do filtro, por observação microscópica, anotando–se as variações micrométricas.

5. Câmara de Boyden Sangue heparinizado Membrana filtrante Fator quimiotático Incuba-se por 1 hora, a 37 C

6. Neutrófilos Avaliação da migração dos neutrófilos no filtro:

7. Avaliação do metabolismo oxidativo. O metabolismo oxidativo é um evento peculiar dos fagócitos quando expostos a estímulos apropriados que resultam em aumento repentino do consumo de oxigênio, fenômeno descrito como “respiratory burst”. Assim eles produzem ânions superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidroxil e oxigênio “singlete”, que compõem o mais importante sistema microbicida dessas células. O teste de redução de NBT detecta esses produtos. O “nitro blue tetrazolium” (NBT), é um corante solúvel amarelo , que serve como receptor de elétrons. Quando reduzido pela ativação do metabolismo oxidativo, forma um produto azul escuro insolúvel denominado formazan.

8. Produção de O 2 - / H 2 O 2 + LPS de bactérias Adiciona NBT Teste do NBT neutrófilo Cristais de formazan ...fagocitados pelo neutrófilo

9. Avaliação da capacidade de aderência O método de imunofluorescência direta , que utiliza anticorpos monoclonais para identificação de moléculas na superfície de neutrófilos , é considerado mais sensível e específico para a confirmação de deficiências de moléculas de adesão como as glicoproteínas CD11/ CD18. anticorpos monoclonais fluoresceinados contra marcadores de neutrófilos. CD11/CD18

10. Atividade fagocitária e microbicida Bactérias ou partículas marcadas, são colocadas em contato com fagócitos em suspensão em meio líquido ou aderidos a uma lamínula de vidro. Após um período de incubação, as células são fixadas e analisadas quanto ao número de partículas. Permite a avaliação simultânea das atividades fagocitária e microbicida dos fagócitos.

11. 1) Método convencional células fagocitárias + bactérias opsonizadas incubação 37 C lise dos fagócitos diluições cultura bacteriana bactérias viáveis . sobrenadante lavagem

12. 2) Método de coloração com fluorocromo vital células fagocitárias + bactérias opsonizadas lavagem coloração com alaranjado de acridina lavage m microscópio de luz U.V. bactérias viáveis(pretas) bactérias mortas(vermelhas) sobrenadante