1. SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI
AMMINOACIDI MODIFICATI CON
GRUPPI FOTOATTIVI
Relatore:
Ch.ma Prof.ssa Simona Concilio
Candidata:
Giusy Procida
Matr. 0730200068
Anno Accademico 2009/2010
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI SALERNO
Tesi sperimentale in Chimica Generale ed Inorganica
2. Gli azocomposti sono composti che presentano il gruppo
funzionale R-N=N-R', in cui R e R' possono essere un arile o
un alchile.
I derivati più stabili contengono due gruppi arilici.
Gli azocomposti alifatici (R e/o R' = alifatico) sono meno
comuni dei loro corrispettivi arilici.
4. Gli Azobenzeni subiscono una isomerizzazione fotochimica reversibile cis-
trans. I due isomeri differiscono in geometria e dipolo.
Collocando l’azobenzene in prossimità del sito di legame di un ligando o di un
enzima, e modulando lo switch è possibile ad esempio controllare l’attività di
una proteina.
Mohua Bose, Dan Groff, Jianming Xie, Eric Brustad and Peter G. Schultz.The in corporation of a Photoisomerizable Amino Acid into Protein in E.Coli. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128 (2)
5. GLI AZO- AMMINOACIDI
Possono essere utilizzati per
Azo-Prodrugs Biomateriali Azo-Peptidi
Jovita Juodaityte and Norbert Sewald.Synthesis of photoswitchable amino acids based on azobenzene chromophores: building blocks with potential for photoresponsive biomaterials
journal of biotechnology volume 112, issues 1-2 26 August 2004, Pages 127-138
6. Obiettivo della tesi
Sintesi di “builnding blocks” potenzialmente
utili per la realizzazione di:
biomateriali intrinsecamente antimicrobici, con
la possibilità di “accendere/spegnere” l’attività.
peptidi antimicrobici.
7. L’incorporazione del motivo azobenzenico
nello scheletro di un polimero consente di
avere sistemi “on/off”.
Lo switch fotoindotto potrebbe
influenzare l’organizzazione
strutturale di sistemi polimerici e
modificarne l’attività, attivandola
e spegnendola.
Convenient preparations of azo-dye labeled amino acids and amines. 2008 Jul 7;6(13):2400-4. F. Karush, J. Phy. Chem., 1952, 56, 70
8. SCELTA DEI SUBSTRATI DI REAZIONE
(—) Fenilalanina (Phe, F)
(—) Tirosina (Tyr, Y)
Uno screening di diverse sequenze di AMP note ha mostrato un’abbondanza relativa
di questi residui amminoacidi, che son stati scelti pertanto come strutture di base
per la sintesi di diversi azo-monomeri. I residui utilizzati sono Fmoc protetti.
9. I perché della scelta
1. L’abbondanza dei residui amminoacidici Tyr e Phe ne favorisce una
buona sostituzione con i sistemi azo-amminoacidici prodotti.
2. I residui di tirosina e fenilalanina hanno un’elevata tendenza a ripartirsi
all’interfaccia della membrana favorendo il meccanismo d’azione tipico del
modello barrel-stave degli AMP.
3. Gli aminoacidi aromatici Phe, Tyr possiedono un fenile, al quale è possibile
connettere un gruppo diazoarile, per l’ottenimento di un azocomposto arilico
sull’amminoacido finale.
10. La protezione con il gruppo Fmoc è utile per lo step
successivo: la sintesi peptidica.
C
CH3
H3C
CH3
O C
O
Boc Fmoc
H2C
O C
O
1. Il Fmoc offre un’ alternativa ai gruppi rimovibili in ambiente acido.
2. Assorbe fortemente nell’UV, in particolare a 267 nm 290nm e 301 nm.
Questo permette in monitoraggio spettrofotometrico sia della reazione di
accoppiamento che di deprotezione.
3. La sintesi peptidica offre migliore purezza dei prodotti e rese più
soddisfacenti se condotta a partire da amminoacidi Fmoc protetti.
11. Solo poche strategie sintetiche sono disponibili per la
sintesi di derivati azobenzenici:
1. La reazione di diazocopulazione di uno ione
arendiazonio con composti aromatici ricchi di elettroni.
2. La condensazione dei nitroso-composti con l’anilina.
STRATEGIE SINTETICHE
12. Azo-amminoacido ottenuti
via nitrosobenzene
Azo amminoacidi sintetizzati tramite
diazocopulazione
N
N
HO
H
N
OHO
Fmoc
N
N
OH
HO
H
N
OHO
Fmoc
HO N
N
HO
NH2
O
OH
O
OH
HN
Fmoc
N
N
1) AzoTyr-Fmoc
2) CH3AzoTyr-Fmoc
3) NO2 –OH-AzoTyr-Fmoc
5) OH-AzoTyr-Fmoc
6) OH-CH3-AzoTyr
4) AzoPhe-Fmoc
A partire da Fmoc-Tyr e Fmoc-Phe sono stati sintetizzati:
OH
N
N
HO
HN
O
OH
N+
O
-
O
Fmoc
13. Metodologie sperimentali di caratterizzazione
1) Osservazione al
microscopio in luce
polarizzata 2) Spettroscopia di
risonanza magnetica
nucleare ( 1
H NMR)
3) Spettroscopia UV-VIS
4) Spettroscopia di
Fluorescenza
5) Spettroscopia IR
Le misure IR sono state effettuate in
ATR (riflessione totale attenuata)
grazie al “performer plate ZnSe flat”,
direttamente su polveri di campione.
6) Calorimetria
differenziale a scansione
(DSC)
14. Composto 1:
AzoTyr-Fmoc
A) Formazione del sale di diazonio 0-5°C
B) Formazione dello ione fenato
pH=9-10
C) Reazione di Sostituzione Elettrofila
Aromatica (diazocopulazione)
pH=9-10 T= max 15°C
Resa del 70%
NH2
HO
COOH
NHFmoc
HCl (aq)
NaNO2 (aq)
0-5 °C NaOH (acq)
NaHCO3 (acq)
N2
+
-
O
COOH
NHFmoc
+
NaOH
15°C
HO
COOH
NHFmoc
N
N
anilina
15. Il prodotto mostra un aspetto microcristallino.
1) Osservazione al microscopio
AzoTyr-Fmoc: caratterizzazione
2) Spettroscopia di risonanza
magnetica nucleare ( 1
H NMR)
OH
HN
O
HO
N
N
O
O
6.88
7.15
7.62
3.16;2.91 4.85
11.0
8.0
5.0
7.937.46
7.46
7.46 7.93
4.70
4.46
7.55
7.28
7.38
7.84
7.84
7.38
7.28
7.55
16. Lo stretching del gruppo azo è visibile a
1500 cm-1
.
4) Spettroscopia IR
Il composto fonde a 153,3 °C, ma non subisce alcuna
cristallizzazione in raffreddamento.
5)Calorimetria differenziale a scansione
(DSC)
I segnali a λmax = 262 nm, 285 nm e 301 nm sono
attribuibili al Fmoc
La banda a λmax = 330 nm, è attribuibile
all’azocomposto.
3)Spettroscopia UV-VIS
Segnali del Fmoc
Banda dell’ Azo-composto
OH
C=O
N=N
17. Composto 2:
CH3AzoTyr-Fmoc
A) Formazione del sale di diazonio
0-5°C
B) Formazione dello ione fenato
pH=9-10
C) Reazione di Sostituzione Elettrofila
Aromatica (diazocopulazione)
pH=9-10 T= max 15°C
Resa del 90%
NH2
HO
COOH
NHFmoc
HCl (aq)
NaNO2 (aq)
0-5 °C
NaOH (acq)
NaHCO3 (acq)
N2
+
-
O
COOH
NHFmoc
+
NaOH
15°C
HO
COOH
NHFmoc
N
N
p-toluidina
CH3
CH3
H3C
18. Il composto ha un aspetto polveroso.
1) Osservazione al microscopio
CH3AzoTyr-Fmoc: Caratterizzazione
N
N
HO
H
N
OHO
O
O
7.26
7.26
7.81
7.81
6.88
7.15
7.62
2.35
5.0
3.16;2.91
4.85
8.0
11.0
4.46
7.55
7.28
7.38
7.84
7.84
7.38
7.28
7.55
4.70
2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1
H NMR)
19. I segnali a λmax=263,33 nm e a 300 nm sono attribuibili al Fmoc
mentre la banda a λmax=345 nm, è attribuibile all’azo composto.
Lo stretching del gruppo
azo è visibile a 1510 cm-1.
3)Spettroscopia UV-VIS
4) Spettroscopia IR
Il picco del punto di fusione è visibile a 190 °C.
5)Calorimetria differenziale a scansione (DSC)
Fmoc Azo
OH C=O
N=N
CH3
20. Composto 3:
NO2-OH-AzoTyr-
Fmoc
A) Formazione del sale di diazonio 0-5°C
B) Formazione dello ione fenato
pH= 9
C) Reazione di Sostituzione Elettrofila
Aromatica (diazocopulazione)
pH= 8,5-9 T= max 10-12°C
Per aggiunta di acido acetico è interrotta la
reazione. pH finale=5.5
Resa del 53%
SALE DI DIAZONIO ISOLATO IN
FORMA SOLIDA
NH2
HO
COOH
NHFmoc
HCl (aq)
NaNO2 (aq)
0-5 °C
NaOH (aq/EtOH)
NaHCO3 (aq/EtOH)
N2
+
-
O
COOH
NHFmoc
+
HO
COOH
NHFmoc
N
N
NO2
NO2
O2N
HO
OH
HO
isolato in forma solida
10-15°C
21. 1) Osservazione al microscopio
NO2-OH- AzoTyr-Fmoc: caratterizzazione
Al M.O il composto appare cristallino.
2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1
H NMR)
HO N N
HO
HN
O
OH
N+
O
-
O
O
O7.86 8.02
7.95
5.0
6.88
7.15
7.62
5.0
3.16;2.91
4.85
8.0
11.0
4.70
4.46
7.55
7.28
7.38
7.84
7.84
7.38
7.28
7.55
22. Si notano due bande di assorbimento, una incentrata a
λmax=396 nm, attribuibile all’assorbimento del sistema
azobenzene coniugato, e a λmax = 267, 291 e 300 nm, ritroviamo
il Fmoc.
3) Spettroscopia UV-VIS
4) Spettroscopia IR
ll gruppo azo è
confermato a 1500
cm-1.
Il picco del punto di fusione è visibile a 140 °C.
Il composto subisce una decomposizione
termica, per cui non sono evidenti segnali di
cristallizzazione in raffreddamento
5) Calorimetria differenziale a
scansione (DSC)
Fmoc
Azo
C=O
N=N
NO2
23. Composto 4:
AzoPhe-Fmoc
Facendo reagire i nitrosoderivati
aromatici con le ammine aromatiche
primarie in soluzione di acido acetico,
si ottengono derivati azobenzenici
(reazione di Mills). Il meccanismo di
reazione proposto per questa sintesi
è diverso dalla diazocopulazione.
Resa del 33%
Anspon, H.D., "p-Phenylazobenzoic Acid", Org. Synth. . 1955 Vol. 3: p. 711.
H2N
COOH
N
H
O
O
Nitrosobenzene
N
O
acido acetico glaciale 8h
N
HOOC
NH
O
O
N
24. Il composto è stato isolato in due forme
cristalline, una ottenibile per precipitazione da
CH2Cl2/MeOH (Tf = 167°C) e l’altra per
cristallizzazione da THF/acqua (Tf =230°C).
1) Osservazione al microscopio
O
OH
HN
O
O
N
N
7.32
7.32
7.88
7.88
3.16;2.91
4.85
11.0
8.0
4.46
7.55
7.28
7.38
7.84
7.84
7.387.28
7.55
4.70
7.93
7.46
7.46
7.46
7.93
2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1
H NMR)
25. I picchi visibili nello spettro sono facilmente attribuibili tramite i
valori di assorbanza al gruppo azo λmax= 330 e al gruppo Fmoc.
4) Spettroscopia IR
3) Spettroscopia UV-VIS
Lo stretching del
gruppo azo è
visibile a 1500 cm-1
Il composto non cristallizza in discesa e il punto di fusione è ben
visibile a 231°C.
5) Calorimetria differenziale a scansione (DSC)
Fmoc Azo
N=N
26. PROCEDURE SINTETICHE IN VIA DI
OTTIMIZZAZIONE
Composto 5: OH-AzoTyr-Fmoc
Composto 6: OH-CH3
-AzoTyr
Il difficile ottenimento di questi
ulteriori azo-prodotti, ci ha posti
dinanzi alla necessità di procedere
con ulteriori studi, al fine di
ottimizzare la procedura sintetica
considerata e raggiungere l’obiettivo
proposto.
OH
NHFmoc
O
HO
N
NHO
OH
NH2
O
HO
N
NH3C
HO
27. Formazione del Sale di diazonio T = 0-5°C;
Evito la formazione di prodotti secondari.
pH compreso tra 9 e 10
Facilito l’attivazione dell’amminoacido.
SOLUZIONE PROPOSTA
Eccesso di nitrito rispetto alle moli della tirosina
Sposto l’equilibrio verso la formazione dell’azo composto.
BASSE RESE
PROCEDURE SINTETICHE IN VIA DI OTTIMIZZAZIONE
Temperature di reazione tra 5°C e 10-12°C e pH compreso tra 7,5-8
durante la SEA favoriscono la copulazione.
28. Conclusioni
Sono state realizzate unità azo-monomeriche,
che aprono la strada a numerose possibilità di
applicazione.
Sono state utilizzate procedure sintetiche
semplici ed economiche per sviluppare nuove
molecole utilizzabili come “building blocks” per
l’ottenimento di nuovi materiali.
29. La progettazione di unità azo-amminoacidiche
può risultare di notevole interesse, sia per
sfruttare la fotoattività dei suddetti sistemi in
materiali polimerici, sia per la realizzazione di
nuovi peptidi antimicrobici.
Nonostante gli studi siano da ampliare, le possibilità offerte
dal presente lavoro aprono la strada a numerose
prospettive future.
30. Grazie a tutti per
l’attenzione!
Un grazie alla mia prof. Simona,
a Stefano
e ai ragazzi del laboratorio con cui ho condiviso tanto in
questo tempo.
31.
32. Potenziali Applicazioni degli azo-
polimeri antimicrobici
Materiali per uso biomedico (in odontoiatria, nei fili di
sutura, come patch o sistemi mucoadesivi etc..);
Superfici antimicrobiche per prevenire infezioni
batteriche;
Food packaging
35. Costruzione di Probe
New Product - Azobenzene phosphoramidite for the introduction of photo-regulated functions in DNA
Investigare sui meccanismi di formazione e dissociazione dell’elica.
37. Reazione1 Reazione 2 Reazione 3 Reazione 4 Reazione 5
H2
0 14,3 mL 5,2 mL 9,6 mL 20 mL 9,6 mL
HCl 3,7 mL (0.045 moli) 1.3mL (0.016 moli) 2,4 mL (0,029 moli) 5 mL (0,06 moli) 2,4 mL (0,029
moli)
p-amminofenolo 1.20g (0.011 moli) 0,54 g (0.0049) 1,20 g (0.011 moli) 1,20 g (0.011 moli) 1,20 g (0.011 moli)
Nitrito di sodio
Sciolto in mL 2.4
di H2
O
0.84g (0,012 moli) 0.37g(0,0054 moli) 0,84 g (0,012 moli) 0,84 g (0,012 moli) 0,84 g (0,012 moli)
SOLUZIONE BASICA
per formare lo
ione fenato
NaOH 0.09 g Na2
CO3
in EtOH NaOH 0.09 g NaOH 0.09 g NaOH 0.022 g
NaHCO3
0.34 g
NaHCO3
in EtOH NaHCO3
0.034 g
NaHCO3
0.034 g
NaHCO3
0.085 g
Fmoc-Tyr 2 g (0.0049 moli) 2 g (0,0049moli) 1g (0,0025 moli) 1g (0,0025 moli) 1g (0,0025 moli)
TEMPERATURA di
reazione per la
S.E.A
10- 15 °C T ambiente 0-5 °C 10-12 °C 5°C
pH durante la S.E.A. 9-10 9-10 7,5– 8 7,5- 8 7,5 -8
RISULTATO Il prodotto non si è
formato
Il prodotto non si è
formato
Il Prodotto non si è
formato
Bassa resa Bassa resa
DIVERSE CONDIZIONI DI REAZIONE USATE PER L’OH-AzoTyrFmoc
38. L’analisi al M.O mostra un composto che fonde
intorno ai 230°C.
1) Osservazione al microscopio
OH-AzoTyr-Fmoc caratterizzazione
N
N
OH
HO
H
N
OHO
O
O
6.93
6.93
7.76
7.76
6.88
7.15
7.62
5.0
5.0
3.16;2.91
4.85
8.0
11.0
4.46
7.55
7.28
7.38
7.84
7.84
7.38
7.28
7.55
4.70
2) Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( 1
H NMR)
Hinweis der Redaktion
Gli azocomposti alifatici R-N=N-R’ (R e/o R' = alifatico) sono meno comuni dei loro corrispettivi arilici, infatti ad elevate temperature o sottoposti a irradiazione, i legami carbonio-azoto (C-N) di queste molecole si rompono con perdita di azoto gassoso, generando radicali liberi. A causa di questo processo, alcuni azocomposti alifatici sono utilizzati come iniziatori radicalici e per la loro instabilità occorre prestare attenzione mentre si maneggiano.
Gruppi foto modulabili possono essere usati per il controllo temporaneo di una varietà di processi biologici o regolare direttamente l'attività di recettori,di enzimi, canali ionici o modulare le concentrazioni intracellulari di varie molecole di segnalazione. Le possibili applicazioni come probe risiedono per lo più nel campo della diagnostica, nella caratterizzazione di proteine, nello studio di reazioni enzimatiche e nella valutazione dell’attività di specifici inibitori. Inoltre probe fluoresenti trovano ampio impiego nello studio di acidi nucleici e nello studio dei recettori.
Azostrutture possono essere introdotte nel backbone di poliammidi generando materiali fotoresponsivi. Ciò consente di avere un controllo foto-reversibile delle propreità chimiche e fisiche del polimero.
La transizione da una forma all’altra avviene soltanto a ben precise lunghezze d’onda: in particolare, se investito da luce ultravioletta (360nm) si ha isomerizzazione trans-cis, mentre la transizione inversa (isomerizzazione cis-trans) avviene se il composto è investito da luce blu (488nm).
La fotoisomerizzazione dell’azobenzene è molto rapida e avviene su una scala temporale dell’ordine dei picosecondi, mentre il tempo necessario affinché abbia luogo il rilassamento dell’azobenzene dalla forma cis, meno stabile, a quella trans varia a seconda del composto in cui è contenuto.
Da diversi anni, gli azobenzeni e la loro fotochimica stanno ricevendo molta attenzione e sono pertanto utilizzati in molteplici campi, sfruttando proprio le loro caratteristiche di foto isomerizzazione. Nel tentativo di migliorare efficacia e/o specificità di azione dei peptidi antimicrobici naturali, sono state proposte diverse modifiche strutturali sugli amminoacidi costituenti.
A causa della più bassa attività proteolitica in confronto a quella del piccolo intestino, anche la regione del colon è stata considerata come un possibile sito di assorbimento per i peptidi e le proteine somministrate oralmente. Molti idrogel sono stati correntemente studiati come potenziali dispositivi per il rilascio di farmaci colon-specifici. Questi includono polisaccaridi reticolati chimicamente o fisicamente, come destrano, gomma guar e poli ( acido acrilico ) azo-crosslinked.Essi sono progettati per essere altamente rigonfiati o degradati in presenza di enzimi del colon o della microflora, provvedendo alla colon-specificità nel rilascio del farmaco.(drug delivery systems).
La presenza di molecole fotocromiche in un materiale polimerico può conferire al materiale caratteristiche di “interruttore ottico”. Questo comportamento è dovuto alla capacità del composto di esistere in due stati aventi configurazione elettronica o molecolare diversa, che si convertono l'uno nell'altro in seguito ad eccitazione luminosa.
La scelta di composti protetti da Fmoc è legata al fatto che questo gruppo protettore offre una serie di vantaggi. Primo fra tutti offre un’alternativa ai gruppi rimovibili in ambiente acido in quanto in queste condizioni avvengono una serie di reazioni collaterali a carico di altri amminoacidi (Met, Tyr, Trp, Asp) dovute alla formazione di specie carbocationiche altamente reattive che si formano nel processo di rimozione. I trattamenti con TFA nella sintesi in fase solida via Boc danno luogo, anche se in misura ridotta, al distacco del peptide dalla resina.
Gli azocomposti sono intensamente colorati, ciò è dovuto al fatto che il gruppo azo, ―N=N―, consente di estendere la coniugazione tra i due anelli aromatci. Questa coniugazione porta ad un esteso sistema di elettroni π -delocalizzati con conseguente assorbimento della radiazione nella regione del visibile, e precisamente nell’intervallo tra 300-350 nm.
L’obiettivo del lavoro di ricerca è però molto più ampio. La realizzazione delle strutture azo-monomeriche proposte, potrebbero essere sfruttate per la realizzazione di sistemi antimicrobici ottenuti sia per sintesi di nuovi polimeri ed oligomeri analoghi strutturalmente a peptidi recentemente scoperti, sia attraverso la modifica chimica di materiali già esistenti per inserzione di gruppi funzionali sulla matrice polimerica.
La mucoadesione, ossia l’adesione di un polimero naturale o sintetico ad un substrato biologico, è un metodo pratico per l’immobilizzazione o la localizzazione dei farmaci ed un importante nuovo aspetto del loro rilascio controllato. Un dispositivo mucoadesivo a rilascio controllato può inoltre permettere l’individuazione del farmaco e la sua localizzazione in uno specifico sito corporeo. Gli idrogel sono polimeri reticolati, tridimensionali, idrofilici, capaci di incorporare grandi quantità di acqua o di fluidi biologici. Molti idrogel sono stati correntemente studiati come potenziali dispositivi per il rilascio di farmaci colon-specifici. Questi includono polisaccaridi reticolati chimicamente o fisicamente, come destrano, gomma guar, e poli ( acido acrilico ) azo-crosslinked. Essi sono progettati per essere altamente rigonfiati o degradati in presenza di enzimi del colon o della microflora, provvedendo alla colon-specificità nel rilascio del farmaco.