Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung vonTramadol-Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit  Von der Fakultät f...
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum vom 01.04.1998 bis zum 28.02.2002 amInstitut   für   Organische   Chemie   der   ...
„Wenn wir wüßten, was wir tun,würden wir das nicht Forschung nennen.“                       (Albert Einstein)
DanksagungIch möchte mich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemieder RWTH Aachen bedan...
Teile dieser Arbeit wurden auszugsweise publiziert in:   Enzymatic resolution of analgesics: δ-hydroxytramadol, ε-hydroxyt...
InhaltsverzeichnisABKÜRZUNGSVERZEICHNIS                                                                                VII...
VERZEICHNISSE                                                                                                   II2.4.2.4 ...
III                                                                                     VERZEICHNISSE3.3.2.2   Darstellung...
VERZEICHNISSE                                                                                        IV3.3.4.3     Darstel...
V                                                                                     VERZEICHNISSE3.6.3.9   PPL-katalysie...
VERZEICHNISSE                                                                                          VI3.6.8.5   Versuch...
VII                                                                                       VERZEICHNISSE3.6.13.3 Chirazyme ...
VERZEICHNISSE                                                       VIII     Abkürzungsverzeichnis       AAV            Al...
IX                                                              VERZEICHNISSE     KOtBu          Kalium-tert-butylat     l...
1     Einleitung und ZielsetzungEnzymatische Transformationen gehören mittlerweile zu den Grundoperationen derpräparativen...
2                                                                     EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGDie Wirkstoffsynthese in d...
3Stereoisomers als Notwendigkeit verlangen, wird enantiomerenreinen Substanzen(enantiomerically pure compounds, EPC)31 von...
4                                                                      EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGdaher bemüht Medikamente ...
OPIOIDE ANALGETIKA                                                                                   5                 R1O...
6                                                                EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGVariation der Struktur des Atro...
TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA                                              71.2     Tramadol und analgetisch akt...
8                                                              EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG                                 ...
TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA                                           9            HO                         ...
10                                                                        EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG                      ...
111.3     ZielsetzungIn einem Tramadol-Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH sind ca. 2000Strukturanaloga synthetisiert wor...
12                                                                EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGZiel der vorliegenden Arbeit i...
2     Theoretischer Teil2.1     Darstellung        und      Charakterisierung        der     MPEG/PLE-        Katalysator ...
14                                                                    THEORETISCHER TEILbeispielsweise so von einem Aktivi...
DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER MPEG/PLE-KATALYSATOR PRÄPARATION          15daß es zu Reaktionen von funktionellen G...
16                                                                  THEORETISCHER TEIL2.2     Darstellung der racemischen ...
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA                                        17Tabelle 2.1:   Darstellung      der ...
18                                                                THEORETISCHER TEILdes Tramadoltyps, die starke Basen wie...
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA                                        19Fortsetzung Tabelle 2.2:      Substr...
20                                                                             THEORETISCHER TEILFortsetzung Tabelle 2.2: ...
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA                                                  21Zur Synthese des Phenylest...
22                                                                 THEORETISCHER TEILEs zeigte sich, daß bei pH 7.0 innerh...
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA                                                                         23   ...
24                                                                      THEORETISCHER TEILAufarbeitung analysiert werden k...
DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA                                           25rac-27 und rac-28 erhalten wurden...
26                                                                           THEORETISCHER TEIL2.3      Vorbemerkungen zu ...
VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE                                                                 272.5). Die Bildung des A...
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability
Nächste SlideShare
Wird geladen in …5
×

Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

1.209 Aufrufe

Veröffentlicht am

Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability (Language: GERMAN)

opioids, opiate, opioid, tramadol, narcotic, analgesic, drug, pharmacology, chemistry, organic chemistry, medicinal chemistry, medicine, pharmacy, enzymes, catalysis, resolution, enzymatic resolution

Veröffentlicht in: Bildung
0 Kommentare
0 Gefällt mir
Statistik
Notizen
  • Als Erste(r) kommentieren

  • Gehören Sie zu den Ersten, denen das gefällt!

Keine Downloads
Aufrufe
Aufrufe insgesamt
1.209
Auf SlideShare
0
Aus Einbettungen
0
Anzahl an Einbettungen
3
Aktionen
Geteilt
0
Downloads
9
Kommentare
0
Gefällt mir
0
Einbettungen 0
Keine Einbettungen

Keine Notizen für die Folie

Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

  1. 1. Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung vonTramadol-Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von Diplom-Chemiker Carsten Griebel aus Niebüll Berichter: Universitätsprofessor Dr. H.-J. Gais Universitätsprofessor Dr. D. Enders Tag der mündlichen Prüfung: 13. Dezember 2002 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
  2. 2. Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum vom 01.04.1998 bis zum 28.02.2002 amInstitut für Organische Chemie der Rheinisch Westfälischen TechnischenHochschule Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais angefertigt.
  3. 3. „Wenn wir wüßten, was wir tun,würden wir das nicht Forschung nennen.“ (Albert Einstein)
  4. 4. DanksagungIch möchte mich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemieder RWTH Aachen bedanken. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H.-J. Gais für dieengagierte Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit, die interessanten und anregendenDiskussionen sowie für die Bereitstellung der ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. AllenArbeitskreismitgliedern danke ich für die angenehme und freundschaftlicheArbeitsatmosphäre, die stete Diskussionsbereitschaft sowie für die gute Zusammenarbeit.Für die hilfreichen Anregungen bei der Fertigstellung der vorliegenden Arbeit danke ichHerrn Dipl.-Chem. Stefan Koep.Bei Frau Ing. Cornelia Vermeeren möchte ich mich besonders für die Lösung einer Vielzahlvon Trennproblemen und für ihre stete Hilfsbereitschaft bedanken. Besonderer Dank gebührtauch Frau Magdalena Grosch und Frau Ursula Ripkens für die durchgeführten HPLC-Trennungen.Für die Ausführung von analytischen Aufgaben möchte ich mich bei Frau Dittrich, FrauGlensk, Frau Kuyper, Frau Müller, und Herrn Dr. Runsink bedanken und für die Abwicklungorganisatorischer Aufgaben bei Frau Bertrand, Frau Renardy, Herrn Dr. Bettray und HerrnDr. Geibel.Meiner Forschungspraktikantin Frau Dipl.-Chem. Martina Mennicken danke ich für ihrepräparative Unterstützung und engagierte Mitarbeit.Ein großer Dank gebührt auch den Mitarbeitern der Grünenthal GmbH, die mich hilfsbereitunterstützt haben. Im besonderen möchte ich Herrn Dr. Helmut Buschmann für seineengagierte Unterstützung dieser Arbeit danken, ebenso Herrn Heinz-Günter Döteberg, HerrnDr. Michael Finkam, Herrn Dr. Bernd Sundermann, Herrn Dr. Oswald Zimmer und nichtzuletzt denjenigen Mitarbeitern, die es ermöglicht haben, daß mir die benötigten Substanzenzur Verfügung gestellt werden konnten.Ganz besonders möchte ich mich herzlich bei meiner Familie und meinen Freundenbedanken, die mich während meiner Promotionszeit unterstützt haben.
  5. 5. Teile dieser Arbeit wurden auszugsweise publiziert in: Enzymatic resolution of analgesics: δ-hydroxytramadol, ε-hydroxytramadol and O-desmethyltramadol. H.-J. Gais, C. Griebel, H. Buschmann, Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 917-928. Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung von Aminomethyl-Aryl- Cyclohexanol-Derivaten. H. Buschmann, D. Kaulartz, C. Griebel, H.-J. Gais, DE 10004926 A1, 04.02.2000 und WO 01/57232 A1, 09.08.2001; Chem. Abstr. 2001, 135, 179820.
  6. 6. InhaltsverzeichnisABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 11.1 Opioide Analgetika 31.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga 71.3 Zielsetzung 112 THEORETISCHER TEIL 132.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-Katalysator Präparation 132.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga 162.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen 242.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse 262.3.1 Kinetische Racematspaltungen 262.3.1.1 Der E-Wert 292.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien 352.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen Hydrolyse 382.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der enzymatischen Transacylierung 392.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga 422.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen 422.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino- methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) 492.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylamino- methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 592.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 632.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino- 1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 732.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl- amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) 752.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen 772.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 822.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 932.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 104
  7. 7. VERZEICHNISSE II2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)- 6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 1082.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino- methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 1132.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethyl- aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 1202.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 1382.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im präparativen Maßstab 1402.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 1442.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen 1542.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 1552.5 Zusammenfassung 1582.6 Ausblick 1633 EXPERIMENTELLER TEIL 1643.1 Allgemeine Vorbemerkungen 1653.1.1 Eingesetzte Computerprogramme 1653.1.2 Analytische Methoden und Geräte 1653.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien 1703.1.4 Verwendete Proteine 1703.1.5 Besondere Arbeitstechniken 1733.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen 1743.2.1 Darstellung von MPEG/PLE 1743.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE 1743.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen Racematspaltung 1763.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 1763.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen (AAV 1) 1763.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Phenolen (AAV 2) 1763.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3) 1773.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus den racemischen Basen (AAV 4) 1773.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung 1783.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexanol (rac-7) 178
  8. 8. III VERZEICHNISSE3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)- phenol (rac-8) 1793.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)- phenol (rac-11) 1803.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 1813.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 1833.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 1843.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse 1853.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 1853.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy- cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 1863.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy- 1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 1873.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 1893.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 1903.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy- cyclohexyl)-phenol (rac-20) 1913.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl- 1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 1933.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 1943.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 1953.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 1973.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino- methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 1983.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in der enzymatischen Transacylierung 1993.3.4.1 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Essigsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-47) 1993.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-46) 200
  9. 9. VERZEICHNISSE IV3.3.4.3 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- 4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24) 2013.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- 3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-45) 2033.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-Dimethylaminomethyl-1- (3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-nonan-3-on (rac-48) 2043.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-(trichlormethyl)-carbonat 2043.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol 2053.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate 2073.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen Substrat Ester (AAV 5) 2073.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15 2073.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 2073.4.4 Hydrolysestabilität des Esters rac-23 2083.4.5 Hydrolysestabilität des Esters rac-16 2083.4.6 Hydrolysestabilität des Esters rac-24 2093.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen 2103.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen Medium 2143.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 2143.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen System (AAV 6) 2143.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-organischen Zweiphasen System (AAV 7) 2143.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen Lösungsmitteln (AAV 8) 2153.6.2 Berechnung des E-Werts 2163.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 2173.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 2173.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2173.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur Darstellung von (+)-15 2183.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2193.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2193.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2203.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2203.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221
  10. 10. V VERZEICHNISSE3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2213.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 2223.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRL 2223.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit roher CRL 2233.6.3.13 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit aufgereinigter CRL 2243.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 2243.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem mir roher CRL 2243.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 7.0 2253.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei pH 8.0 2253.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl- 1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 2263.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8 unter Verwendung verschiedener Lipasen 2263.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 2273.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 2283.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 2293.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat 2303.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 2303.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino- 1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 2313.6.6.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem 2313.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem mit roher CRL 2323.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl- amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) unter Verwendung verschiedener Lipasen 2323.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino- methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 2333.6.8.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 2333.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 2343.6.8.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 2353.6.8.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system mit extraktiver Aufarbeitung 236
  11. 11. VERZEICHNISSE VI3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 2373.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasen- system 2373.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 2383.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 2383.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 2383.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 2393.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 2413.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 2423.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 2433.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 2443.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem 2443.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen Zweiphasensystem 2453.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasen- system 2463.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethyl- aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 2463.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Verwendung verschiedener Lipasen 2463.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 2473.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz von Triethylamin 2483.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino- methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 2493.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 2493.6.12.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 2493.6.12.3 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 2503.6.12.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 2503.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 2513.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 2513.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system 252
  12. 12. VII VERZEICHNISSE3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system 2523.6.13.4 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 2533.6.13.5 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrig-organischen Zweiphasen- system 2533.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 2543.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit extraktiver Aufarbeitung 2553.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen Einphasensystem 2563.6.13.9 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 2563.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen- system unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 2573.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22 (rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem 2583.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino- methyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23) 2613.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen Einphasen- system mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion 2613.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl- 1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) 2623.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 2623.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat 2633.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat 2643.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat 2673.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 2673.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 2683.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 2683.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure- 3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 2693.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im wäßrigen Einphasensystem 2693.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 2693.7 Anhang zum experimentellen Teil 2713.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch Verseifung von Buttersäureethylester 2714 LITERATUR 272
  13. 13. VERZEICHNISSE VIII Abkürzungsverzeichnis AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift Abb. Abbildung AChE Acetylcholinesterase abs. absolut APT attached proton test Äq. Äquivalent BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin) BCL Burkholderia cepacia Lipase c Umsatz (conversion) d Duplett d Tag dest. Wasser vollentmineralisiertes Wasser CAL-B Candida antarctica Lipase, Typ B CE Cholesterolesterase CRL Candida rugosa Lipase CVL Chromobacterium viscosum Lipase Da Dalton DC Dünnschichtchromatographie DCM Dichlormethan DiBAl-H Diisobutylaluminiumhydrid E-Wert Selektivitätsparameter nach Chen und Sih (Enantiomeric Ratio) ee Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess) EE Essigsäureethylester Et Ethyl EtOH Ethanol GC Gaschromatographie ges. gesättigt h Stunde HLE Pferdeleber-Esterase (horse liver esterase) HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie HV Hochvakuum J Kopplungskonstante
  14. 14. IX VERZEICHNISSE KOtBu Kalium-tert-butylat log P-Wert Logarithmus des Verteilungskoeffizienten eines Lösungsmittels zwischen Oktanol und Wasser m Multiplett MeOH Methanol Min. Minuten MPEG Polyethylenglykolmonomethylether MPEG/PLE Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase und Poly- ethylenglykolmonomethylether MTBE tert-Butyl-methylether MW Molekulargewicht n. b. nicht bestimmt NMR Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance) PLE Schweineleber-Esterase (porcine liver esterase) PLE/BSA/MPEG Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase, Poly- ethylenglykolmonomethylether und Rinderserum- Albumin PPL Schweinepankreaslipase (porcine pancreatic lipase) ppm parts per million Pr Propyl PrOH Propanol Rf Retentionsfaktor (ratio of fronts) Rfl. Rückfluß RT Raumtemperatur s Singulett Smp. Schmelzpunkt TEA Triethylamin TMS Tetramethylsilan t Triplett tR Retentionszeit U Aktivitätseinheit (Units) wfr. Wasserfrei
  15. 15. 1 Einleitung und ZielsetzungEnzymatische Transformationen gehören mittlerweile zu den Grundoperationen derpräparativen organischen Chemie. Es sind bis heute zahlreiche industrielle Prozessemit enzymatischen Schlüsselschritten etabliert, die weit über die enzymatischeRacematspaltung von Aminosäurederivaten hinausgehen.1,2 Die Vorteile vonBiokatalysatoren liegen vor allem in den milden Reaktionsbedingungen, dem damitverbundenen geringeren Sicherheitsrisiko3 und der geringen Neigung zur Bildungvon Nebenprodukten, da sie Prozesse mit hoher Chemo-, Regio- undStereoselektivität katalysieren.Enzyme aus der Klasse der Hydrolasen (Lipasen, Proteasen u. a.) sind fürtechnische Anwendungen besonders interessant, da sie in großer Zahl kommerziellerhältlich sind4, zur Entfaltung ihrer katalytischen Aktivität keine teuren und eventuellzu regenerierenden Cofaktoren benötigen und ein breites Substratspektrumakzeptieren.5,6,7,8 Lipasen werden zur Modifizierung von Fetten, zur Synthese vonEstern und zur kinetischen Racematspaltung eingesetzt.9,10,11 Hierbei ist dieStabilisierung und effektive Immobilisierung der Enzyme zur Erhöhung derBetriebsstabilität, zur leichten Abtrennung und zur Wiederverwendung bei derabsatzweisen Reaktionsführung von besonderer Bedeutung.9 Als aktuelle Methodenzur Stabilisierung von Enzymen sind vor allem die von der Firma ALTUS entwickelteQuervernetzung von Enzymkristallen (CLECs)12,13 und das von REETZ et al.entwickelte Verfahren zum Einschluß von Enzymen in hydrophobe Sol-Gele14,15 zunennen. Alternativen zur Immobilisierung von Enzymen auf unlöslichen Trägernstellen Systeme zur Enzymrückhaltung wie Enzym-Membran-Reaktoren (EMR)16,17oder die von der Firma SEPRACORE entwickelten Hohlfasermodule18,19 dar.Der Einsatz von nicht-wäßrigen Reaktionsmedien eröffnet der Enzymkatalyse denZugang zu einer Vielzahl von neuartigen Anwendungen.20,21 In Zukunft wird auch derEinsatz von Enzymen, die durch Mutationen optimiert wurden, eine wichtige Rollespielen. Solche Mutationen können zufällig eingeführt werden, so daß in einemanschließenden Selektionsverfahren dann Enzyme mit verbesserten Eigenschaftenidentifiziert werden können (directed evolution).22 Mutationen können auch gezieltvorgenommen werden, nachdem anhand der Proteinstruktur Aminosäurenidentifiziert wurden, deren Austausch verbesserte Eigenschaften erwarten läßt.23
  16. 16. 2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGDie Wirkstoffsynthese in der medizinischen Chemie ist ein ideales Einsatzgebiet fürbiokatalytische Methoden.10,24 Viele Wirkstoffe sind chiral, und es muß mitunterschiedlicher biologischer Aktivität der Enantiomeren gerechnet werden.25 EinRacemat wird daher als Gemisch zweier Wirkstoffe behandelt. Nur wenn beideEnantiomere annähernd identische Wirkung aufweisen oder synergistische Effektezwischen den beiden Wirkstoffe bestehen, kann ein Racemat als Medikamentzugelassen werden. Ausnahmen sind Substanzen, die unter physiologischenBedingungen racemisieren oder Substanzen die metabolisch deracemisiert werden,wie beispielsweise das Ibuprofen: (R)-Ibuprofen wird unter physiologischenBedingungen in das ungefähr viermal wirksamere (S)-Ibuprofen umgewandelt.26 1522 Wirkstoffe 426 (28 %) 1096 (72 %) Naturstoffe Synthetika 422 (99 %) 4 (1 %) 422 (38 %) 674 (62 %) enantiomerenrein achiral oder racemisch chiral achiral 52 (12 %) 370 (88 %) enantiomerenrein racemischAbb. 1.1: Statistik über die Aufteilung von Wirkstoffen (1982).27KLEEMANN und ENGEL haben 1982 eine repräsentative Auswahl an Arzneistoffenuntersucht und festgestellt, daß darunter fast alle eingesetzten Naturstoffe und derenDerivate chiral sind und in enantiomerenreiner Form vorliegen. In der Mehrheitwerden synthetisch gewonnene Arzneistoffe eingesetzt, von denen hingegen nur38 % chiral sind. Der überwiegende Teil davon (88 %) wurde 1982 noch als Racemateingesetzt (s. Abb. 1.1).27 Für die Neueinführungen der letzten Jahre hat sich diesesVerhältnis deutlich in Richtung zu enantiomerenreinen Substanzen verschoben. 1985betrug der Anteil enantiomerenreiner Wirkstoffe am pharmazeutischen Weltmarktnoch ca. 2 %. Dieser Anteil ist bis ins Jahr 1995 auf 20 % angestiegen und weiter auf32 % im Jahr 2000.28,29 Für die folgenden Jahre wird auch weiterhin ein wachsenderAnteil vorhergesagt.29Auch vor dem Hintergrund der Auflagen nationaler und internationaler 30Gesundheitsbehörden , welche die Erforschung der Wirkung jedes einzelnen
  17. 17. 3Stereoisomers als Notwendigkeit verlangen, wird enantiomerenreinen Substanzen(enantiomerically pure compounds, EPC)31 von der pharmazeutischen Industrie einvermehrtes Interesse entgegengebracht.10,32 Daneben können auch patentrechtlicheÜberlegungen von Unternehmen eine Rolle spielen, da nach Ablauf einer Schutzfristeines Racemats anschließend das aktiviere Enantiomer geschützt werden kann(chiral switch). So können verlängerte Schutzfristen für Wirkstoffe erzielt werden.33Die vermehrte Bedeutung enantiomerenreiner Verbindungen erfordert die Suchenach neuen Zugängen zu diastereo- und enantiomerenreinen Produkten bei derEntwicklung neuer Pharmaka. In den letzten Jahren sind zur Syntheseenantiomerenreiner Wirkstoffe viele Methoden eingesetzt worden: asymmetrischeSynthese, katalytische kinetische Racematspaltung und Racematspaltungen durchChromatographie an chiraler stationärer Phase (CSP) oder durch stereoselektiveKristallisation.34,35 Trotz der Fortschritte auf dem Gebiet der asymmetrischenSynthese, basieren die Synthesen vieler chiraler Wirkstoffe noch auf der Trennungder racemisch synthetisierten Verbindung.36 Unter den genannten Methoden spielenbiokatalytische Verfahren als Schlüsselschritt eine wichtige Rolle.35 ExtracelluläreLipasen sind hierbei besonders attraktive Katalysatoren für synthetischeVerfahren.9,371.1 Opioide AnalgetikaDie Behandlung von Schmerzen hat in der Medizin eine große Bedeutung. Esbesteht zur Zeit noch ein weltweiter Bedarf an gut wirksamen Schmerztherapien füreine patientengerechte und zielorientierte Behandlung. Zentralwirksame Opioide38,die auch als stark wirksame (morphinartige) Analgetikaa bezeichnet werden, werdenseit langem in der Schmerztherapie eingesetzt, obwohl sie ein dem Morphinähnliches Wirkungsprofil haben. Sie rufen eine Reihe von Nebenwirkungen wieSucht, Abhängigkeit, Atemdepression, gastro-intestinale Hemmwirkung und 39Obstipation in unterschiedlicher Stärke hervor. Die moderne Analgesieforschung ista algos (griech.) = Schmerz
  18. 18. 4 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGdaher bemüht Medikamente zu entwickeln, die eine schmerzstillende Wirkung, nichtaber die für Opioide typischen Nebenwirkungen, zeigen.40Die hohe Spezifität der Wirkung stark zentralwirksamer Analgetika hat ihre Erklärunggefunden, nachdem es gelang, Opioid-Rezeptoren im Organismus nachzuweisen.41Diese Rezeptoren werden normalerweise mit körpereigenen, morphinartig wirkendenPeptiden, den Endorphinenb und Enkephalinen, die endogene Agonisten dieserRezeptoren sind, aktiviert.26,42,43,44 Das endogene schmerzhemmende System hat dieFunktion die lähmende Schmerzreaktion zu unterdrücken, so daß dem Organismusseine Handlungsfähigkeit erhalten bleibt.Opioid-Rezeptoren kommen in unterschiedlicher Dichte sowohl prä- als auchpostsynaptisch im Zentralnervensystem vor.44 Außerhalb des Zentralnervensystemsfindet man Opioid-Rezeptoren vor allem im Dünndarm. 41 Wie bei anderenNeurotransmitter-Rezeptoren werden auch bei den Opioid-Rezeptoren verschiedeneSubtypen unterschieden, die man als µ-, κ- und δ-Rezeptoren bezeichnet45. Seitkurzem kennt man einen weiteren neuen Rezeptor, den ORL1-Subtyp (Opioid-Receptor-Like 1), und dessen endogenen Liganden, das Peptid Nociceptin.46 Dabeiist je nach Rezeptorsubtyp eine bestimmte pharmakologische Wirkung möglich. Beider supraspinal analgesierenden Wirkung spielt beispielsweise der µ-Rezeptor einedominante Rolle.47 Jeder Subtyp ist jedoch auch für ganz bestimmteNebenwirkungen verantwortlich. µ-Rezeptoren sind vor allem für die durch Opiateausgelöste Atemdepression und Abhängigkeit verantwortlich.44 Durch eineunterschiedliche Affinität zu den verschiedenen Rezeptoren kann das variableWirkungsprofil verschiedener Opioide erklärt werden.Morphinc (1, s. Abb. 1.2) ist eines der wenigen Beispiele eines Naturstoffs, der auchheute noch in seiner ursprünglichen Form in der Therapie eingesetzt wird.48SERTÜRNER isolierte 1806 das Morphin erstmals aus Opium. Die Klärung der Strukturdes Morphins, an der viele Forscher beteiligt waren, hat über 120 Jahre gedauert.Die 1925 von ROBINSON und GULLAND angegebene Strukturformel wurde 1952 vonGATES und TSCHUDI bestätigt, denen die Totalsynthese des Morphins und damit auchdie Klärung der Stereochemie gelang. Diese vielstufige Synthese hat allerdings keinepraktische Bedeutung erlangt, da Morphin bis heute aus Opium gewonnen wird.49b Endo-Morphinec Morpheus = griech. Gott des Schlafs
  19. 19. OPIOIDE ANALGETIKA 5 R1O OH O H O N CH3 Me N R2O OH Morphin (1): R1 = R2 = H 1 Codein (2): R1 = Me, R2 = H Heroin (3): R1 = R2 = AcetylAbb. 1.2: Morphin in einer konventionellen Darstellung nach Robinson (links) und in einer Stereoformel (rechts).Morphin stellt den Prototyp und auch den Standard der stark wirksamen Analgetikazur Behandlung heftiger akuter und chronischer Schmerzen dar.50 Auf der Suchenach analgetisch wirksamen Verbindungen ist die Struktur des Morphins vielfältigvariiert worden. Dabei zeigte sich, daß auch sehr weit abgewandelte Derivate typischmorphinartige Eigenschaften besitzen können.51 Die Forschung auf demMorphingebiet zeigt weiter, wie aus einem komplexen Naturstoff durch systematischeStrukturvariation leichter herzustellende, strukturell einfache Analoga mit identischerWirkung, zum Teil sogar mit höherer Spezifität der Wirkung, gewonnen werden.26Erste Abwandlungsprodukte wie Codein, der Methylether von 1, oder Heroin, dasDiacetylderivat von 1, waren ebenfalls Naturstoffe. Codein ist zwar schwächerwirksam als Morphin, weist aber auch ein geringeres Suchtpotential auf. Für Herointrifft das Gegenteil zu, es weist ein sehr großes Suchtpotential auf.26 CH3 O O CH3 N O O CH3 CH3 N H 3C N N CH3 CH3 4 (-)-5 6 Pethidin Levomethadon FentanylAbb. 1.3: Verschiedene opioide Wirkstoffe.Pethidin52 (4, s. Abb. 1.3), das erste vollsynthetische Schmerzmittel vom Morphintyp,wurde 1939 von EISLEB bei der Suche nach krampflösenden Wirkstoffen durch
  20. 20. 6 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGVariation der Struktur des Atropins entdeckt.26,41,46 Das ebenfalls vollsynthetischeMethadon (rac-5) wurde 1941 von BOCKMÜHL und EHRHART gefunden. Als sichherausstellte, daß nur das (−)-(R)-Enantiomer des Methadons für die analgetischeWirkung verantwortlich ist, wurde es als Levomethadon53 ((−)-5, s. Abb. 1.2)eingeführt. Es wird durch Racematspaltung mit (+)-(2R,3R)-Weinsäure ausMethadon erhalten.41,47 Levomethadon wird hauptsächlich in der Schmerztherapieeingesetzt, wohingegen racemisches Methadon, oral verabreicht, in derErsatztherapie bei Opioid-Abhängigkeit verwendet wird.54 Pethidin und Methadonbesitzen nur etwa ein fünftel bis ein viertel der analgetischen Wirkung des Morphins.Zwar sind auch die Nebenwirkungen entsprechend schwächer ausgeprägt26,41,44,jedoch ist ein entscheidender Fortschritt mit diesen Substanzen nicht erreichtworden.Fentanyl (6, s. Abb. 1.3), das ebenfalls synthetisch hergestellt wird, ist eines der amstärksten wirksamen Analgetika, das etwa 100mal stärker wirksam ist als Morphin.Es wirkt hauptsächlich über den µ-Rezeptorsubtyp.47 Fentanyl wird wegen seinerrelativ kurzen Wirkungsdauer von etwa 30 Minuten ebenfalls in derNeuroleptanalgesie eingesetzt. Darunter versteht man ein Verfahren bei dem einNeuroleptikum gleichzeitig mit einem stark wirksamen Analgetikum injiziert unddadurch ein Zustand induziert wird, bei dem der Patient sediert und angstfrei ist. Sokönnen kleinere Eingriffe (wie beispielsweise Endoskopien) vorgenommen werden,bei denen das Erwachen ohne Desorientierung vor sich geht und eine postoperativeAnalgesie gewährleistet ist.41,44,55 Fentanyl und dessen Derivate mit einem hohenMißbrauchspotential („Designer Drogen“)56 zeigen die typischen Nebenwirkungenstarker µ-Opioide und führen zu einer physischen Abhängigkeit, ähnlich wie beimMorphin.Neben Molekülen mit einer agonistischen Wirkung gibt es auch Morphin-Antagonisten (s. Abb. 1.6, S. 9), die eingesetzt werden, um die Wirkung von opioidenAnalgetika aufzuheben, im besonderen zur Aufhebung der Atemlähmung bei akuterVergiftung.41,47
  21. 21. TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 71.2 Tramadol und analgetisch aktive AnalogaTramadol57 (rac-7, s. Abb. 1.4) nimmt unter den stark wirksamen Analgetika eineSonderstellung ein, da dieser Wirkstoff eine starke Schmerzhemmung ohne die fürOpioide typischen Nebenwirkungen hervorruft.58 Das Suchtpotential ist so gering43,das dieser Wirkstoff nicht unter Kontrollmaßnahmen von Narkotika fällt, inDeutschland das Betäubungsmittelgesetz. Tramadol, das 1976 von der GRÜNENTHALGmbH in die Schmerztherapie eingeführt wurde, wird von der WORLD HEALTHORGANISATION (WHO) auf Stufe zwei der Schmerztherapie krebskranker Patientenempfohlen.59 Tramadol wird weltweit vermarktet und ist eines der wichtigstenzentralwirksamen Schmerzmittel.59 OH OH (S) (R) OCH3 H3CO (R) (S) H3C N N CH3 CH3 H3C (+)-(1R,2R)-Tramadol (−)-(1S,2S)-TramadolAbb. 1.4: Die Enantiomere des Tramadols ((+)-7, (−)-7).Tramadol ist ein Racemat aus (+)-(1R,2R)- und (−)-(1S,2S)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol. Das in der Therapie eingesetzte Tramadolhydrochlorid ist ein partieller Opiat-Agonist, dessen Wirkstärke etwa 1/10 bis 1/5 derdes Morphins entspricht, jedoch mit stark reduzierter Opioidwirkung.44 Tramadol zeigteine µ-opioide und eine nicht-opioide Wirkung. Die nicht-opioide Wirkung ist eineInhibierung der spinalen Schmerzleitung durch Inhibierung der Wiederaufnahme derNeurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5HT).Dieses wird durch das (−)-(1S,2S)-Enantiomer bewirkt, wohingegen das (+)-(1R,2R)-Enantiomer ein starker µ-Agonist ist und für die opioide Wirkung verantwortlich ist.Die analgetische Wirksamkeit des Tramadols resultiert aus einer synergistischenKombination beider Enantiomere auf die die beiden Wirkmechanismen verteiltsind.38,47,60,61,62 Zusätzlich trägt auch der in vivo durch oxidative Dealkylierunggebildete Hauptmetabolit O-Desmethyltramadol (8, M1), der eine wesentlich höhereµ-Opioidrezeptor-Affinität besitzt, zur komplexen Gesamtwirkung bei.46,47,61,63,
  22. 22. 8 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG OH OH O H3C HO CH3 N N OH CH3 (−)-1 (+)-8Abb. 1.5: Strukturelle Ähnlichkeit zwischen Morphin und (+)-O-Desmethyltramadol.Das (+)-(1R,2R)-Enantiomer des Tramadols und insbesondere das (+)-(1R,2R)-Enantiomer des O-Desmethyltramadols lassen sich als stark vereinfachte Derivatedes physiologisch aktiven (−)-Morphins auffassen, deren Struktur durch Wegfall vonRinganteilen flexibler wird (s. Abb. 1.5).Sowohl für Opioide als auch für Endorphine und Enkephaline, die an diesenRezeptoren eine analgetische Wirkung auslösen, sind intensive Untersuchungen zurStruktur-Aktivitäts-Beziehung durchgeführt worden.26,57,64 Demnach ist für ein aktivesMolekül ein in 1-Stellung arylsubstituiertes Cycloalkangrundgerüst, welches in 2-Stellung aminoalkyliert ist, essentiell. Bei systematischen Variationen des Tramadol-grundgerüsts stellte die GRÜNENTHAL GmbH fest, daß eine meta-Hydroxyfunktion amPhenylring zur stärksten analgetischen Wirkung führt und daß die agonistischeWirkung an die Dimethylaminogruppe gebunden ist. Bei Variationen der Ringgrößehat sich der Sechsring als optimal herausgestellt.57 Eine freie Hydroxyfunktion amquarternären Zentrum erweist sich außerdem als günstig, da die analgetischeWirkung durch Substitution mit Chlor oder Wasserstoff verringert wird, beiVeresterung geht sie völlig verloren.57Daß sich das Agonist/Antagonist-Verhältnis eines Moleküls über die Stickstoff-substitution beeinflussen läßt, zeigt sich im Naloxon (9) und Naltrexon (10) (s. Abb.1.6, S. 9). Hier ist unter anderem ein N-Methylrest gegen einen Allyl- oder einenMethylencyclopropyl-Rest ersetzt worden: beide Verbindungen sind dadurch Opioid-Antagonisten. Des weiteren ist die räumliche Anordnung dieser Gruppen für dieAnalgesiewirkung entscheidend. Allerdings kann eine vollständige Struktur-Aktivitäts-Beziehung immer noch nicht aufgestellt werden.38
  23. 23. TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 9 HO HO O OH O OH N N CH2 O O Naloxon (9) Naltrexon (10)Abb. 1.6: Opioid-Antagonisten.Die Synthese des racemischen Tramadol hydrochlorids erfolgt durch Grignard-Reaktion von 2-(Dimethylaminomethyl)-cyclohexanon, welches durch Mannich-Reaktion65 von Cyclohexanon, Formaldehyd und Dimethylamin hydrochlorid erhaltenwird, und dem Grignardreagenz des 3-Bromanisols. Aus dieser Reaktion wird einecis /trans (cis : trans = 85 : 15) Mischung erhalten. Das gewünschte cis-Isomer wirddurch Kristallisation des diastereomerenreinen Hydrochlorids erhalten. Das trans-Isomer kann unter Verwendung starker Säuren epimerisiert werden.47,57,66Präparative Verfahren zur Racematspaltung von Tramadol sind seit langemdokumentiert. Die wichtigsten basieren auf der „klassischen“ diastereomerenSalzbildung unter Verwendung von Weinsäure67, O,O´-Dibenzoyl-weinsäure66,68,Mandelsäure69 und seit neustem auch O,O´-Di-para-toluoyl-weinsäure70. DieAnwendbarkeit von chromatographischen Trennverfahren in einem präparativenMaßstab ist ebenfalls demonstriert worden (unter Verwendung der simulated movingbed Technologie, SMB).71 Analytisch lassen sich die Enantiomere chromato-graphisch durch HPLC an chiraler stationärer Phase (s. Kap. 3.5, S. 210), durchKapillarelektrophorese (CE)72 oder spektroskopisch durch 1H-NMR-Spektroskopie inGegenwart von paramagnetischen Verschiebungsreagenzien73 identifizieren.GRIGG et al. gelang die erste Festphasensynthese racemischen Tramadols mittelseines „Linker“-Systems74, welches auf Hydroxylamin basiert.75 Das in der Mannich-Reaktion eingesetzte Iminiumsalz wurde nach einer modifizierten Variante vonSCHROTH et al.76 aus einem N-Trimethylsilylamin mit einem Chlormethyletherhergestellt (s. Abb. 1.7).
  24. 24. 10 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1) TMSCl, TEA O O CH3 2) ClCH2OEt O N N H OTMS CH3 57 % RMgBr H3CO OH H3CO (H3C)2N 1) MeOTf OH 2) TEA O N rac-7, de = 92 % CH3Abb. 1.7: Festphasensynthese von Tramadol nach GRIGG et al.Einen ersten Ansatz zur asymmetrischen Festphasensynthese von Tramadolverfolgten ENDERS et al., die einen „Linker“ auf Basis der THP-Schutzgruppe vonELLMAN77 mit einem Derivat des Auxiliars (S)-2-Methoxy-methyl-pyrrolidin (SMP)funktionalisierten. In dieser Syntheseroute wurde die chirale Mannich-Base vompolymeren Träger abgespalten und dann in flüssiger Phase mit demGrignardreagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Das Produkt (+)-7 konnte hierbei nurmit einem Enantiomerenüberschuß von 38 % erhalten werden (s. Abb. 1.8).78 Danach dieser Methodik andere Mannich-Basen mit hoher Enantioselektivitätdargestellt wurden79, ist zu vermuten, daß enantiomerenangereicherte Mannich-Basen unter Grignardbedingungen partiell racemisieren. O O O O O O O OCH3 OCH3 N N H OCH3 67 % (H3C)2N CH2I OH 1) THF / verd. HCl O O O OCH3 N(CH3)2 2) Extraktion + N 3) 3 Äq. RMgBr N(CH3)2 (+)-7, 78 % de 38 % eeAbb. 1.8: Asymmetrische Festphasensynthese von Tramadol nach ENDERS et al.
  25. 25. 111.3 ZielsetzungIn einem Tramadol-Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH sind ca. 2000Strukturanaloga synthetisiert worden. Ziel dieses Projekts ist es, die Opioid-Wirkungals auch die Wiederaufnahmehemmung in einem enantiomerenreinen oder achiralenMolekül zu vereinigen. Die vorgenommenen Strukturvariationen lassen sich wie inAbb. 1.9 dargestellt zusammenfassen. Einführung zusätzlicher Eliminierung oder Substitution sekundärer OH-Gruppen der tertiären OH-Gruppe OH O CH3 Aromaten- N substitution offenkettige Strukturen H3C CH3 oder -variationAbb. 1.9: Zusammenfassung der relevanten Strukturvariationen im Tramadol- Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH.Für die pharmakologische und toxikologische Evaluierung dieser neuen Tramadol-Analoga müssen, sowohl für die Entwicklung eines einzelnen Enantiomers als auchfür die eines Racemats, beide Enantiomere dargestellt werden.Tramadol-Analoga sind als Racemate auf der Basis der Tramadol-Syntheseroutesehr gut darzustellen. Eine alternative asymmetrische Synthese dieser Verbindungenist wegen der partiellen Racemisierung der Mannich-Basen bei ihrer Umsetzung mitGrignard-Verbindungen noch nicht durchführbar. Dies macht eine Racematspaltungnotwendig, die gerade die Bereitstellung beider Enantiomere zu leisten vermag.Bei der Racematspaltung von Tramadol und seinen Derivaten durch Kristallisationdiastereomerer Salze konnten bisher noch keine allgemeinen Richtlinien zurPrädiktivität entwickelt werden, da schon geringe strukturelle Variationen häufig zueinem nicht vorhersagbaren Verhalten in der Umsetzung mit denKristallisationsreagenzien führen. Präparative chromatographische HPLC an chiralerstationärer Phase ist nur bedingt zur Bereitstellung kleiner Substanzmengen (1 bis10 g) geeignet.
  26. 26. 12 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGZiel der vorliegenden Arbeit ist es daher, in Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHALGmbH beide Enantiomere von Tramadol-Analoga durch eine Hydrolasen-katalysiertekinetische Racematspaltung enantiomerenrein darzustellen. MöglicheFunktionalitäten von Substraten auf Tramadol-Basis, die als Angriffspunkt für eineHydrolasen-katalysierte Reaktion dienen können, sind in Abb. 1.10 dargestellt. Zusätzliche sekundäre tertiäre OH-Funtion OH-Funktionen OH phenolische OH-Funktion O CH3 N offenkettige Strukturen H3C CH3Abb. 1.10: Mögliche Angriffspunkte für eine Hydrolasen-katalysierte kinetische Racematspaltung von Tramadol-Analoga.Das solche Tramadol-Analoga Substrate für Hydrolasen sind, konnte bereits ineigenen Vorarbeiten am Beispiel eines Phenylesters des O-Desmethyltramadols(rac-15) gezeigt werden.80 Dieses Ergebnis soll als Ausgangspunkt für eine möglicheOptimierung der Racematspaltung von Phenylestern des O-Desmethyltramadolsdienen. Es sollen ebenfalls Substrate eingesetzt werden, bei denen eine zusätzlicheHydroxyfunktion in den Cyclohexylring eingefügt ist. Eine Vielzahl unterschiedlichsubstituierter, racemischer Cyclohexanole sind bereits als Substrate in der Lipasen-katalysierten Hydrolyse oder Acylierung untersucht worden.5-8 Diese Gruppecyclohexanolischer Substrate sollte somit ideal für eine Hydrolasen-katalysiertekinetische Racematspaltung sein.In dieser Arbeit sollen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung beide möglichenVerfahrensweisen eingesetzt werden: die Acylierung von racemischen Alkoholenoder Phenolen im organischen Medium und die Hydrolyse der entsprechenden Ester.Im Hinblick auf eine Optimierung der Reaktionsführung sollte der Einflußverschiedener Reaktionsparameter untersucht werden. Mögliche Variablen sind:Lösungsmittel, Acyldonoren, verschieden Additive sowie pH-Wert, Cosolventien unddie Art der Estergruppe. Im Hinblick auf eine mögliche synthetische Anwendung sollweitergehend untersucht werden, ob sich eine solche Enzym-katalysierte Reaktion ingrößeren Maßstäben realisieren läßt.
  27. 27. 2 Theoretischer Teil2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE- Katalysator PräparationEs ist bekannt, das native PLE im Gegensatz zu Lipasen nur eine sehr geringeAktivität im organischen Medium aufweist. Für einige Lipasen ist gezeigt worden, daßdurch Zusatz von Proteinen oder amphiphilen Verbindungen wie Polyethylenglycolsie vor Änderung ihrer Konformation und somit Verminderung ihrer katalytischenAktivität geschützt werden können. GAIS et al. konnten dieses Konzept auf die PLEerweitern und zeigen, daß eine Aktivierung durch Methoxypolyethylenglycol (MPEG)möglich ist.81,82,83 Die besten Erfolge wurden hier durch Colyophilisierung von PLEmit MPEG erzielt, wobei eine aufwendige kovalente Modifizierung des Enzyms nichtnotwendig ist.84 Durch die gemeinsame Gefriertrocknung von PLE und MPEGwerden vermutlich nicht-kovalente Komplexe zwischen Enzym und Polymer gebildet,die, sofern sie nicht durch Lösungsmitteleinflüsse zerstört werden, zu einerAktivitätssteigerung führen. Das MPEG kann weiterhin geringe Mengen Wasser, diefür die katalytische Aktivität des Enzyms benötigt werden und auf der Oberfläche desEnzyms gebunden sind, bereitstellen.Das Colyophilisat aus MPEG/PLE wurde nach einer bekannten Methodedargestellt.84,85 Hierzu wurde die PLE unter Eiskühlung entsalzt und diezurückbleibende wäßrige Enzymlösung anschließend mit MPEG5000 versetzt. Nachvollständiger Auflösung wurde die Lösung in flüssigem Stickstoff eingefroren unddanach gefriergetrocknet. Es entstand ein weißes, flockiges und gut handhabbaresPulver in quantitativer Ausbeute.Die Standardaktivität von PLE wird im Rahmen dieser Arbeit durch Hydrolyse von0.25 M Buttersäureethylester fein emulgiert in 0.1 M Phosphatpufferlösung pH 8.0bei Raumtemperatur bestimmt.86 Um eine direkte Vergleichbarkeit von Standard-aktivitäten der PLE oder anderen Enzymen zu erhalten, muß gewährleistet sein, daßdiese unter einheitlichen Bedingungen gemessen werden. Häufig variieren aber dieReaktionsbedingungen bei verschiedenen Quellen. HORGAN et al. berichten
  28. 28. 14 THEORETISCHER TEILbeispielsweise so von einem Aktivitätstest zur Bestimmung der PLE-Aktivität, derdurch Hydrolyse von 0.0125 M Buttersäureethylester bei pH 7.5 und 38 ºCdurchgeführt wird.87Die beobachtete spezifische Aktivität der colyophilisierten PLE/MPEG war verglichenmit der Aktivität der PLE-Ammoniumsulfat Suspension ca. 15 % geringer. Bei derLyophilisierung nativer PLE wurden im Vergleich dazu Aktivitätsverluste von 30 -50 % beobachtet.85 In dieser Arbeit wurde auch ein Colyophilisat ausPLE/BSA/MPEG eingesetzt. Die spezifische Aktivität dieses Katalysators entsprachder des MPEG/PLE-Colyophilisats.Eine Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit und auch der Selektivität derMPEG/PLE-katalysierten Transacylierung vom Wassergehalt der Reaktionslösung istbekannt.21,81,82 Hier zeigte sich, daß ein zu großer Wassergehalt in enzymatischenTransacylierungen zu hydrolytischen Nebenreaktionen führen kann, in denen dasAcylierungsmittel bevorzugt verseift wird.88 Dies führt zu Aktivitätsverlusten, da beider enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters die entsprechende Carbonsäureentsteht, die den pH-Wert in der Umgebung des Enzyms drastisch reduziert und sozur Deaktivierung des Enzyms führt. Weiterhin kann der in der Transacylierunggebildete Ester vom Enzym hydrolysiert werden. Da in diesem Fall das bevorzugtgebildete Enantiomer auch bevorzugt hydrolysiert werden würde, würde dies zu einerSelektivitätserniedrigung führen. Daher ist es notwendig eingesetzte Reagentienunter dem Aspekt Wassergehalt zu charakterisieren, um Bedingungen, die zuhydrolytischen Nebenreaktionen in der Transacylierung führen können, zuvermeiden.Der Wassergehalt von MPEG/PLE ist bereits durch zwei Methoden bestimmtworden. Nach der ersten Methode wird MPEG/PLE bei 2.5·10-4 mbar und 120 ºC für12 Stunden getrocknet und anschließend der Wassergehalt durch denGewichtsverlust ermittelt. Hiernach wurde ein Wassergehalt der MPEG/PLE(colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) von 1 – 2 % bestimmt.84 Die zweiteMethode stellt die Karl-Fischer-Titration der MPEG/PLE dar. Bei der Karl-Fischer-Titration besteht die Möglichkeit von Fehlern in der Wassergehaltsbestimmungdadurch, daß fest gebundenes Wasser teilweise zu langsam abgegeben wird und
  29. 29. DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER MPEG/PLE-KATALYSATOR PRÄPARATION 15daß es zu Reaktionen von funktionellen Gruppen des Proteins mit dem Reagenzkommen kann.89 Nach dieser Methode wurde der Wassergehalt einer vergleichbarenMPEG/PLE Probe (colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) zu 1.2 % bestimmt.Bei einer Verlängerung der Trocknungsdauer auf 72 h sank der Wassergehalt auf0.6 %.85 Aufgrund der unterschiedlichen Temperaturen, die bei der Gefriertrocknungunterschiedlicher Chargen herrschen, können die so erhaltenen Werte aber nur eingrober Anhaltspunkt sein.90Diese Ergebnisse zeigen, daß durch den MPEG/PLE Katalysator keine erheblichenWassermengen in die Reaktionslösung eingebracht werden. Der in dem Katalysatorvorhandene Wassergehalt wird wahrscheinlich sogar vom Protein benötigt.
  30. 30. 16 THEORETISCHER TEIL2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-AnalogaIm Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche enzymatischeReaktionswege untersucht: die Enzym-katalysierte Transacylierung racemischerAlkohole (s. Tabelle 2.1) und die Hydrolyse der entsprechenden racemischen Ester(s. Tabelle 2.2). Die eingesetzten Substrate lassen sich in zwei Gruppen einteilen.Die Erste besteht aus Substraten mit einer phenolischen OH-Gruppe und denentsprechenden Estern, die sich durch O-Demethylierung von Tramadol undAnalogen ableiten lassen. Die zweite Gruppe besteht aus Substraten mit einerzusätzlichen sekundären Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst des Tramadols undden dazugehörigen Estern. Aufgrund der unterschiedlichen Reaktivität derphenolischen und der sekundären Hydroxylgruppe werden beide Substratgruppen inden folgenden Abschnitten dieser Arbeit dementsprechend getrennt diskutiert.Innerhalb der Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL GmbH wurden Vorstufen zu denSubstraten zur Verfügung gestellt, so daß alle in dieser Arbeit eingesetztenVerbindungen durch Standardreaktionen aus den zur Verfügung stehendenVerbindungen zugänglich waren. Auf die einzelnen bei GRÜNENTHAL durchgeführtenSyntheseschritte zur Darstellung der bereitgestellten Substanzen wird in Kapitel 2.2.1näher eingegangen.Die racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung wurden in der Regelin Form ihrer Hydrochloride, die einfach zu handhaben sind, zur Verfügung gestellt.Lediglich das Phenol rac-8 wurde in Form des Hydrochlorids der entsprechendenO-methylierten Verbindung Tramadol (rac-7) bereitgestellt (Tabelle 2.1). Allebereitgestellten Hydrochloride waren über Monate bei Raumtemperatur lagerstabil.Zur Freisetzung der racemischen Basen aus ihren Hydrochloriden werden diese ineiner Emulsion aus dest. Wasser und Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe vonäquivalenten Mengen Natronlauge können die freien Basen nahezu quantitativ (97 -98 % Ausbeute) extrahiert werden (s. AAV 1, S. 176).91
  31. 31. DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 17Tabelle 2.1: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung Substrat zur enzymatische Transacylierung Darstellung(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)- 1. Freisetzen der Base rac-7cyclohexanol (rac-8): aus dem Hydrochlorid. OH 2. O-Demethylierung von rac-7 OH mit DiBAl-H. Me2N(±)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OH Me2N(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OMe HO Me2N(±)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13): Freisetzen der Base aus OH OH dem Hydrochlorid. OMe Me2N(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14): Freisetzen der Base aus OH dem Hydrochlorid. OMe HO Me2NDas phenolische Substrat rac-8 und das zur Synthese des Esters rac-21 benötigte3-(6-Dimethylamino-methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20) wurden ausrac-7 und rac-13 dargestellt, in denen die phenolische Hydroxylgruppe noch alsMethylether vorliegt. Eine bekannte Methode zur Etherspaltung bei Verbindungen
  32. 32. 18 THEORETISCHER TEILdes Tramadoltyps, die starke Basen wie Natrium- oder Kaliumhydrid in Gegenwartvon Thiophenol und Diethylenglycol verwendet92, ergibt jedoch O-Desmethyltramadol(rac-8) aus rac-7 nur in unbefriedigenden Ausbeuten.91 Zur Etablierung derphenolischen Hydroxylgruppe wurden daher die Methylether rac-7 und rac-13 durchReaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol unter Rückfluß in gutenbis sehr guten Ausbeuten (88 - 93 %) demethyliert.91 Eine Dealkylierung amStickstoff war in keinem Fall zu beobachten.Die Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse erfolgtedurch Acylierung der entsprechenden Phenole und Alkohole unter den angegebenReaktionsbedingungen (Tabelle 2.2).Tabelle 2.2: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung(±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 8 mit O Pr Buttersäureanhydrid. Me2N O(±)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 8 mit O Me Essigsäureanhydrid. Me2N O(±)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17): Pyridin katalysierte OH Veresterung von 11 mit O Pr Buttersäureanhydrid. Me2N O
  33. 33. DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 19Fortsetzung Tabelle 2.2: Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy- Darstellung des Alkoholats3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18): aus 12⋅HCl mit KOtBu und O OH OMe Acylierung mit Buttersäure- Pr O chlorid bei RT. Me2N(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19): Darstellung des Alkoholats O aus 13 mit KOtBu und Acylierung mit Buttersäure- Pr O OH OMe chlorid bei –10 ºC. Me2N(±)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl- 1. O-Demethylierung von 131,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21): mit DiBAl-H zum Phenol 20. 2. Darstellung des Phenolats OH OH O Pr aus 20 mit NaHCO3-Lsg. und Veresterung mit Butter- Me2N O säureanhydrid.(±)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Buttersäure- Pr O chlorid bei RT. Me2N O(±)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-23): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Hexansäure- C5H11 O chlorid bei RT. Me2N O
  34. 34. 20 THEORETISCHER TEILFortsetzung Tabelle 2.2: Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung(±)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy- Darstellung des Alkoholats4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-24): aus 14⋅HCl mit KOtBu und OH OMe Acylierung mit Essigsäure- Me O chlorid bei RT. Me2N O(±)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester Pyridin katalysierte(rac-25): O O Veresterung von 13 mit Pr O O Pr Buttersäureanhydrid. OMe Me2NAllgemein verliefen die Veresterungen mit guten Ausbeuten. Als Nebenreaktion tratin manchen Fällen in einem geringen Ausmaß eine unerwünschte Acylierung dertertiären Hydroxylgruppe auf. Lediglich bei der Veresterung von rac-13 mitButtersäurechlorid in Gegenwart von Kalium-tert-butylat bei Raumtemperatur istdiese Nebenreaktion so groß, daß als Hauptprodukt der Diester rac-25 nahezuquantitativ (96 % Ausbeute) anfällt. Ein Absenken der Reaktionstemperatur auf-10 ºC liefert aber neben nicht umgesetztem Edukt schon bevorzugt den Monoesterder sekundären Hydroxylgruppe, rac-19, in 58 %iger Ausbeute. Ebenfalls nicht zuvernachlässigen war die Bildung eines Diesters bei der Darstellung von rac-24. Indiesem Fall ist nach chromatographischer Aufreinigung eine Mischung vonMonoacetat und Diacetat im Verhältnis 4 : 1 (Verhältnis der Signale der Protonen derMethoxygruppe im 1H-NMR) erhalten worden, die sich nicht weiter auftrennen ließund somit in weiteren Reaktionen als Mischung eingesetzt worden ist. Bei einererneuten Synthese von rac-24, sollte daher versucht werden dieReaktionstemperatur herabzusenken, um einer Bildung des Diesters entgegen-zuwirken.
  35. 35. DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 21Zur Synthese des Phenylesters rac-21, wurde eine Methode zur selektivenAcylierung der phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit einer sekundären benötigt.Bei einer zunächst versuchten Acylierung von rac-20 mit einem Säurechlorid unterPhasentransferkatalyse mit Tetrabutylammoniumbromid, wie von ILLI beschrieben93,konnte lediglich das eingesetzte Edukt zurückgewonnen werden. RICE et al. gelangbei Untersuchungen zu substituierten 3,14-Dihydroxy-17-methyl-4,5α-epoxy-morphinanen die selektive Acylierung einer phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheitsekundärer Hydroxylgruppen nach einer modifizierten Methode von WELSH94 et al.95Analog zu der von RICE beschriebenen Prozedur wurde rac-20 mit 10 ÄquivalentenButtersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt.Bevor die in Tabelle 2.2 vorgestellten Substrate in eine Enzym-katalysierte Hydrolyseeingesetzt wurden, wurde ihre Hydrolyse-Stabilität unter den verwendetenReaktionsbedingungen ohne Zugabe des Katalysators überprüft, um eventuelle nichtEnzym-katalysierte Reaktionen auszuschließen. Eine nicht-enzymatischeAutohydrolyse würde zu racemischen Produkten führen, die, sollten sie während derEnzym-katalysierten Reaktion ebenfalls entstehen, einen niedrigeren ee-Wert desProdukts und damit eine niedrigere Selektivität der enzymatischen Katalysevortäuschen würden. Eine Autohydrolyse-Stabilität ist daher eine wichtigeVoraussetzung der zu verwendenden Substrate. Alle in Tabelle 2.2 gezeigten Esterder Buttersäure waren unter den Reaktionsbedingungen im Bereich von pH 7.0 bispH 8.0 stabil gegen eine nicht Enzym-katalysierte Hydrolyse.Dahingegen zeigten rac-16 und rac-24, beides Ester der Essigsäure, nur eineunbefriedigende Autohydrolysestabilität. Die Stabilität von rac-16 ist beiverschiedenen pH-Werten überprüft worden (Tabelle 2.3).Tabelle 2.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer- Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol. pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC) 7.0 2h 0.1 % rac-8 8.0 2h 1.2 % rac-8 8.0 16 h 15.0 % rac-8
  36. 36. 22 THEORETISCHER TEILEs zeigte sich, daß bei pH 7.0 innerhalb von 2 Stunden noch tolerierbare Mengen anHydrolyseprodukt detektiert worden sind. Bei pH 8.0 wurde allerdings eine merklicheAutohydrolyse von bereits 1 % nach 2 Stunden und 15 % nach 16 Stundenbeobachtet. Eine Enzym-katalysierte Reaktion erscheint bei diesem pH-Wert wenigsinnvoll.Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde in wäßriger Phosphatpufferlösung(pH 7.5) mit Aceton (16 %Vol) als Cosolvens überprüft. Nach vier Tagen beiRaumtemperatur konnten 2 % Hydrolyseprodukt detektiert werden. Da der ein-gesetzte Ester rac-24 noch das Diacetat rac-14 als nicht zu entfernendeVerunreinigung enthält, wurde auf eine detaillierte Untersuchung zur Hydrolyse-beständigkeit, wie beispielsweise bei verschiedenen pH-Werten verzichtet.Um die Ansatzgrößen der enzymatischen Transacylierungen möglichst klein haltenzu können und um schnell zuverlässige Daten auch in der enzymatischen Hydrolysezu erhalten, wurde die gesamte Analytik der Reaktionsgemische auf gas- undflüssigchromatographische Analyse aufgebaut. Zur Validierung von Analyse-bedingungen wurden zunächst separat die reinen racemischen Substrate undProdukte und danach dieselben als Mischung untersucht. Auf diese Art war eineeindeutige Zuordnung der Verbindungen in den Chromatogrammen möglich (Abb.2.1). Um ebenfalls eine zuverlässige, schnelle sowie möglichst einfache Bestimmungder Enantiomerenverhältnisse von Edukten und Produkten bei den enzymatischenReaktionen zu gewährleisten, wurden Mischungen der racemischen Edukte mit denjeweiligen racemischen Produkten durch Gas- oder Flüssigchromatographie anchiralen stationären Phasen getrennt. Anschließend wurden unter den erhaltenenBedingungen zur eindeutigen Identifizierung der Verbindungen nochmals dieracemische Edukte und Produkte separat analysiert. Bis auf wenige, anentsprechender Stelle explizit genannte Verbindungen, konnten sowohl die Signalebeider Enantiomere des Substrats als auch des Produkts in einem Chromatogrammbasisliniengetrennt erhalten werden (Abb. 2.2).
  37. 37. DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 23 OH OMe Pr O Me2N O rac-22 OH OMe HO Me2N rac-14Abb. 2.1: Gaschromatographische Trennung von (±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3- methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) und (±)-Buttersäure-3- dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester (rac-22) an einer CP-Sil-8-Säule. Me2N OH OMe O O Pr (−)-22 OH OMe Pr O Me2N Me2N OH O (+)-22 OMe HO (−)-14 OH OMe HO Me2N (+)-14Abb. 2.2: HPLC Trennung von (−)- und (+)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4- hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester ((−)-22, (+)-22) sowie von (+)- und (−)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan- 1,4-diol ((+)-14, (−)-14) an einer OD-H-Säule mit chiraler stationärer Phase.Dies ermöglichte es, daß Proben direkt aus der Reaktionsmischung, nachAbtrennung der hochmolekularen Proteine durch Filtration, ohne weitere
  38. 38. 24 THEORETISCHER TEILAufarbeitung analysiert werden konnten. Mittels dieser effektiven Analytik ließen sichdetaillierte Informationen über den gesamten Reaktionsverlauf einer enzymatischenReaktion unter Einsatz geringer Substanz- und vor allem Enzymmengen gewinnen.2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen96Die von der GRÜNENTHAL GmbH verwendeten Synthesewege zur Darstellung dercyclohexanoiden Ausgangsmaterialien rac-14⋅HCl97, rac-12⋅HCl98 und rac-13⋅HClbasieren auf der in Kap. 1.2 beschriebenen Tramadol-Syntheseroute, so daß vieleErfahrungen aus diesem Produktionsprozeß in die Reaktionen eingebracht werdenkonnten. O CH3 1) BrMg OMe O N Cl H 3C N(Me)2 O THF O O H 3C Cl O O 2) Trennung der Diastereomeren MeCN 3) H OH OH OMe NaBH4 OMe HO O Me2N Me2N rac-27 rac-14Abb. 2.3: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-14.Zur Einführung der neuen sekundären Hydroxylgruppe wurde anstelle vonCyclohexanon ein als Monoketal geschütztes 1,4- bzw. 1,3-Diketon in die Mannich-Reaktion eingesetzt (Abb. 2.3 und Abb. 2.4). Aus der Mannich-Reaktion des3,3-Dimethyl-1,5-dioxa-spiro[5.5]undecan-8-on (26, Abb. 2.4) wurde nur dasgewünschte 9-Alkylierungsprodukt erhalten. Das unerwünschte 7-Alkylierungs-produkt wurde wahrscheinlich aufgrund von sterischer Hinderung nicht gebildet. Dieerhaltenen jeweiligen Mannich-Basen wurden danach in einer Grignard-Reaktion mitdem Grignard-Reagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Es wurden in beiden Fällencis /trans Mischungen erhalten, aus denen die gewünschten cis-Isomere abgetrenntwurden und nach Abspaltung der Ketal-Schutzgruppen mit Mineralsäure die Ketone
  39. 39. DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 25rac-27 und rac-28 erhalten wurden. Die Ketone rac-27 und rac-28 wurdenanschließend mit Natriumborhydrid zu den gewünschten Alkoholen reduziert. ImFalle der Reduktion des Ketons rac-27 konnte unter optimierten Bedingungen dasgewünschte (1RS,2RS,4SR)-konfigurierte 1,4-Diol rac-14 erhalten werden. EineBildung des (1RS,2RS,4RS)-konfigurierten Epimers konnte nicht beobachtet werden.Im Falle der Reduktion des Ketons rac-28 wurde eine Epimerenmischung aus(1RS,3SR,6RS)-konfigurierten 1,3-Diol rac-12 und dem (1RS,3RS,6RS)-konfigurierten Diol rac-13 erhalten, die anschließend getrennt worden sind. Aufdiesem Weg war es möglich beide in dieser Arbeit eingesetzte Epimere aus einerReaktion zu erhalten (Abb. 2.4). 1) CH3 O H 2C N Cl 1) Trennung der O OH CH3 Diastereomeren O OMe 2) 2) H Me2N O BrMg OMe 26 rac-28 OH OH OH NaBH4 OMe OMe HO + Me2N Me2N 32 % 45 % rac-12 rac-13Abb. 2.4: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-12 und rac-13.
  40. 40. 26 THEORETISCHER TEIL2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse2.3.1 Kinetische RacematspaltungenDer Reaktionsmechanismus von Lipasen und Esterasen entspricht weitgehend demvon Serinproteasen.99 Typisch für diese Enzyme ist eine katalytische Triade imaktiven Zentrum, die aus in dichter räumlicher Nähe stehendem Serin (Ser), Histidin(His), Asparaginsäure (Asp) beziehungsweise Glutaminsäure (Glu) und verschiedenstabilisierenden Aminosäureresten gebildet wird. Darüberhinausgehend zeigen allebisher untersuchten Lipasen eine ähnliche dreidimensionale Struktur, dasα/β-Hydrolasen Faltungsmotiv100,101 dessen zentrales Element acht nahezu paralleleβ-Faltblätter sind, die von α-Helices an beiden Seiten umgeben werden (Abb. 2.5).102 Abb. 2.5: α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv aus β-Faltblättern (Pfeile 1 bis 8) und α-Helices (Zylinder A bis F) mit katalytischer Triade und einem Bereich zur Stabilisierung von Oxyanionen.Im Katalysezyklus (Abb. 2.6) wird der primär gebildete Enzym-Substrat-Komplex (A)nukleophil vom aktiven Serinrest der katalytischen Triade angegriffen. Imentscheidenden Katalyseschritt bildet sich über einen tetraedrischenÜbergangszustand (B) eine kovalente Bindung zwischen dem Serinrest und demAcylrest des Substrates zum Acylenzym (C). Der negativ geladeneÜbergangszustand (B) wird durch das Enzym stabilisiert (Oxyanion-Bereich in Abb.
  41. 41. VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 272.5). Die Bildung des Acylenzyms ist eine Gleichgewichtsreaktion und stellt eineUmesterung zwischen dem Enzym und dem eingesetzten Ester dar. (A) (B) (C) Ser Ser Ser O O O O H R1 OR2 R1 OR2 R1 O + R2OH O Ser Ser Ser O O O O R1 OR3 H R1 O + R3OH R1 OR3 O (D) (E) (F)Abb. 2.6: Katalysemechanismus bei Hydrolasen (ping-pong Mechanismus).Entsprechend reagiert das Acylenzym in einer weiten Umesterung mit einemNukleophil, wie einem Alkohol (Transacylierung) oder Wasser (Hydrolyse), zu demfreien Enzym und dem Produkt einem Ester (Transacylierung) oder Säure(Hydrolyse) weiter (F). Kinetisch wird diese Reaktionsfolge als ping-pongMechanismus bezeichnet.103 In den meisten Reaktionen ist die Deacylierung desAcylenzyms der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Katalyse.6Die Hydrolasen-katalysierten Reaktionen lassen sich in zwei prinzipielleReaktionstypen unter Beteiligung chiraler Moleküle einteilen: Desymmetrisierung undkinetische Racematspaltung (s. Abb. 2.7).

×