Este documento describe métodos de diagnóstico para Mycobacterium tuberculosis y Bartonella, las cuales son bacterias que causan tuberculosis y bartonelosis respectivamente. Para M. tuberculosis, los métodos incluyen microscopía directa, cultivo, prueba tuberculina e histopatología. Para Bartonella, los métodos son antecedentes epidemiológicos, frotis sanguíneo, hemocultivo, serología y PCR. El diagnóstico oportuno es importante para tratar estas enfermedades infecciosas.

1. UNIVERSIDAD CATÓLICA
SANTO TORIBIO DE MOGROVEJO
Facultad de Medicina
Escuela de Medicina
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Práctica N°05
Métodos de diagnóstico e identificación para
Mycobacterium, Bartonella
Jesús Alonso Custodio Marroquín
Código: 062ac03464
Ciclo 2009 - IV

2. Mycobacterium tuberculosis
El Mycobacterium tuberculosis o bacilo de Koch es el agente etiológico de la tuberculosis. Se trata de un
bacilo aerobio estricto, ácido-alcohol resistente, no tiene movilidad, es de crecimiento lento; esta
bacteria se inactiva con radiación ultravioleta y/o temperaturas por encima de 60°C. Varias especies
similares integran el complejo M. tuberculosis: M. bovis, M. africanum y M. microti. El bacilo BCG (M.
bovis atenuado) también puede ocasionar una enfermedad en pacientes inmunocomprometidos, la que
no se puede distinguir clínicamente de la tuberculosis. La infección se da principalmente a través de
secreciones respiratorias que son expulsadas del paciente en el momento de la tos. En el periodo de
incubación, que puede variar desde el momento de la infección hasta 90 días, la bacteria crece
lentamente en los macrófagos, pudiendo diseminarse a otras partes del cuerpo del hospedero. En la
mayoría de casos, esta enfermedad es controlada por la inmunidad celular, de los cuales un 10%
desarrollará la enfermedad activa a lo largo de su vida.1
La tuberculosis (abreviada TBC o TB) es una enfermedad infecciosa, causada por diversas especies del
género Mycobacterium, todas ellas pertenecientes al Complejo Mycobacterium Tuberculosis. La especie
más importante y representativa, causante de tuberculosis es el Mycobacterium tuberculosis o bacilo de
Koch.1 La TBC es posiblemente la enfermedad infecciosa más prevalente en el mundo. Otras
micobacterias como Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canetti, y
Mycobacterium microti pueden causar también la tuberculosis, pero estas especies no lo suelen hacer en
el individuo sano.2 Aunque la tuberculosis es una enfermedad predominantemente de los pulmones,
puede también verse afectando el sistema nervioso central, el sistema linfático, circulatorio,
genitourinario, gastrointestinal, el hueso, articulaciones y aún la piel.
Los signos y síntomas más frecuentes de la tuberculosis son: tos con flema por más de 15 días, a veces
con sangre en el esputo, fiebre, sudoración nocturna, mareos momentáneos, escalofríos y pérdida de
peso. Si la infección afecta a otros órganos por volverse sistémica, aparecen otros síntomas. Por lo
general, las personas que tienen contacto cercano con una persona diagnosticada con tuberculosis, son
sometidas a pruebas para descartar que estén infectados. La resistencia microbiana a los antibióticos
usados para el tratamiento de la tuberculosis se está volviendo un creciente problema en casos de
tuberculosis extensamente resistente a multi-drogas. La prevención de contraer tuberculosis radica en
programas de rastreo y vacunación, usualmente con BCG.
La tuberculosis se transmite por el aire, cuando el enfermo estornuda, tose o escupe. En 1999 la OMS
cifró en 3.689.833 nuevos casos de tuberculosis en el mundo, aunque este organismo cifró en 8.500.000
casos totales con una tasa global de 141/100.000 habitantes. En el informe OMS de 2003, se estima en 8
millones (140/100.000) de nuevos casos de TBC, de los cuales 3,9 millones (62/100.000) son bacilíferos y
674.000 (11/100.000) están coinfectados con VIH. La tuberculosis mantiene una prevalencia de
245/100.000 habitantes, y una tasa de mortalidad de 28/100.000. En el informe OMS de 2006 3 Se
calcula que 1,6 millones de personas murieron por tuberculosis en 2005. La tendencia epidemiológica
de la incidencia de TBC sigue aumentando en el mundo, pero la tasa de mortalidad y prevalencia están
disminuyendo (OMS-2003).2

3. DIAGNÓSTICO CLÍNICO POSITIVO
Contempla los siguientes aspectos:
1. Cuadro clínico.
2. Pruebas inmunológicas.
3. Microbiología.
4. Estudios radiográficos.
5. Resultados histopatológicos.
CUADRO CLINICO
En la tuberculosis de reinfección, los síntomas pueden ser lo suficiente mente intensos para motivar la
preocupación del enfermo y hacerlo concurrir al médico. La mayoría presenta un cuadro clínico
sugestivo de la enferme dad. Algunas de las formas clínicas de comienzo de la enfermedad suelen ser:
1. Catarral: tos, crónica, expectoración, a menudo atribuido al hábito de fumar.
2. Aguda respiratoria: comienzo brusco con fiebre, malestar y tos húmeda, generalmente
confundida con la gripe epidémica.
3. Insidiosa: febrículas vespertinas, pérdida de peso y astenia.
4. Hemoptoica: esputos hemoptoicos y más raramente con franca hemoptisis.
5. Pleural: dolor torácico, disnea, roce pleural.
6. Combinada: presencia de 2 o más de las formas anteriores.
En infectados por el VIH, los síntomas suelen ser alarmantes en ocasiones y otras veces, presentarse de
manera asintomática.
En ocasiones los síntomas son vagos, no preocupan al enfermo y por tanto no se consulta al médico o lo
hacen refiriendo síntomas menos importantes pero que lo molestan más. Este grupo de enfermos con
enfermedad subclínica es menor, pero no por ello menos importante.
No puede dejarse de mencionar la posibilidad de que algunos casos se presenten casi asintomáticos o al
menos sin percepción real de su problema.
INMUNOLOGIA
La prueba tuberculina constituye un instrumento diagnóstico de alta sensibilidad y baja especificidad,
sobre todo para la localización de casos en la población adulta y en vacunados con BCG. En los niños,
puede ser un elemento muy útil para el diagnóstico, en dependencia del antecedente de vacunación
con BCG.
La presencia de reacción a la tuberculina PPD-RT, indica infección por el M. tuberculosis. Esto requiere
de una interpretación cuidadosa cuando el diámetro de la reacción está entre 6 y 9 mm en personas
vacunadas con BCG; una reacción por encima de 15 mm se informa como hiperérgico. En no vacunados,
una inducción de 6 mm y más puede ser sugestiva de enfermedad.
En infectados por el VIH la reacción puede ser de anergia total o positividad variable, todo dependiendo
del conteo global de linfocitos T-4. Por debajo de 200 linfocitos por mm 3, la probabilidad de anergia
está aumentada y en el orden pronóstico, la evolución es más desfavorable.

4. MICROBIOLOGÍA
La microscopia directa resulta un procedimiento de alta sensibilidad y especificidad. Mediante ella se
puede realizar el diagnóstico al 75 y 80 % de los adultos enfermos en dependencia de la endemicidad de
la enfermedad en la población y la pericia de quienes la ejecutan. El bacilo tuberculoso es fino, a veces
algo encorvado, con los extremos redondeados. Tiene una longitud de 1,3 a 3,5 milimicras y de 0,3 a 0,5
milimicras de ancho. La pared bacilar se caracteriza por contener abundantes ácidos grasos de cadenas
largas. Son ácidos resistentes al alcohol y de esto depende su coloración específica con fucsina fenicada
de Ziehl-Nelsen. Epidemiológicamente tiene valor relevante al permitir la identificación de las
principales fuentes de infección que son las que mantienen la transmisión en la comunidad. Esta técnica
es de bajo costo.
El cultivo es la prueba diagnóstica más sensible y específica, es más costosa y requiere de recursos
humanos de alta calificación y de mayor cantidad de recursos materiales. Los cultivos corroboran el
diagnóstico en la mayoría de los casos y en otros lo realizan, y adquieren mayor porcentaje de
positividad del diagnóstico en la medida que se controla la enfermedad y disminuyen los grandes
excretores bacilares. Para el cultivo se utiliza habitualmente el medio de Lowestein-Jensen. En éste las
colonias son visibles generalmente a partir de la cuarta semana y a lo sumo a las 8 semanas. Esto
depende del lento crecimiento del bacilo.
RADIOLOGÍA
No se recomienda para los programas de localización de casos a pesar de tener alta sensibilidad porque
tiene baja especificidad para establecer el diagnóstico además de ser de costo elevado y requerir de
personal especializado.
Los estudios radiográficos cobran importancia sobre todo en personas sintomáticas respiratorias de
semanas de evolución. Un enfermo con imagen radiográfica sugestiva de TB, con al menos 2
baciloscopias y un cultivo negativo, puede ser considerado como una tuberculosis pulmonar no
confirma da bacteriológicamente y previa valoración individual, puede ser ratificado y tratado como
caso de tuberculosis.
En los pacientes inmunodeprimidos no son infrecuentes los exámenes radiográficos negativos en el
curso de una TB pulmonar sobre todo en aquéllos que proceden de alguna área epidémica de la
enfermedad.
Las lesiones radiográficas más características en la tuberculosis pulmonar del adulto son los infiltrados
fibroexudativos en regiones subclaviculares y de los vértices. En pacientes con SIDA, estas lesiones
afectan frecuentemente las bases pulmonares. Las cavernas no son infrecuentes en ambos grupos de
pacientes.
Los derrames pleurales de causa no precisada, son con alguna frecuencia tuberculosos. Deberá
insistirse en el cultivo de éste para tratar de aislar el agente causal, además de realizar su estudio
citoquímico. En algunos casos suele utilizarse la prueba terapéutica.
RESULTADOS HISTOPATOLÓGICOS
El tubérculo característico de la TB está constituido por una zona de necrosis caseosa rodeada de una
masa de células epitelioides gigantes mononucleares, células gigantes multinucleares de Langhans y en
la periferia los linfocitos. En la zona central se encuentran los bacilos.3

5. Resultados:
BK Negativo BK +
BK ++

6. Bartonella
Bartonelosis es una enfermedad infecciosa producida por la bacteria del género Bartonella. Las
especies del género Bartonella causan enfermedades tales como la enfermedad de Carrión, fiebre de
las trincheras y enfermedad por arañazo de gato, así como otras enfermedades tales como la
angiomatosis bacilar, peliosis hepatis, bacteremia crónica, endocarditis, linfadenopatía crónica y
enfermedades neurológicas.
Miembros del género Bartonella son bacterias intacelulares facultativos, alpha 2 subgrupo
Proteobacteria. El género comprende:
Reservor
Bartonella spp. Enfermedad
io
Bartonella
humanos enfermedad de Carrión/Verruga peruana
bacilliformis
fiebre de las trincheras, bacteremia, angiomatosis bacilar,
Bartonella quintana humanos
endocarditis
enfermedad por arañazo de gato, angiomatosis bacilar,
Bartonella henselae gatos
bacteremia, endocarditis
Bartonella
ratas endocarditis
elizabethae
Bartonella grahamii retinitis
Bartonella vinsoni perros endocarditis, bacteremia
Bartonella
roedores miocarditis
washonsis
Bartonella
gatos bacteremia
clarridgiae

7. Bartonella
humanos sindrome parecido a la enfermedad de Carrión
rochalimae
Diagnóstico
Uno de los aspectos más importantes en el diagnóstico de la enfermedad es el antecedente
epidemiológico; si bien desde hace varias décadas se sabe que la mayoría de los pacientes
que desarrollan la fase aguda son foráneos, en los últimos años cada vez más personas
nativas presentan esta fase; esto es de particular importancia en los rebrotes de la
enfermedad.
En la fase aguda de la bartonelosis el diagnóstico es básicamente a través del frotis
sanguíneo, en el cual se observa un 100% de parasitismo de los glóbulos rojos, que
muestran formas bacilares (jóvenes), cocoides (viejas) o cocobacilares.
El hemograma muestra leucocitosis con desviación izquierda, la gran mayoría desarrollan
anemia severa (Hcto.< 20%) de carácter hemolítico.
Como respuesta a la mayor destrucción hemática se da una hiperplasia del tejido
eritropoyético de la médula ósea y eventualmente de otros órganos, como el bazo.
El hemocultivo y el mielocultivo en medios especiales son útiles para confirmar el
diagnóstico.
El análisis de las pruebas hepáticas revela un compromiso importante en los pacientes en
fase aguda; 60% de estos pacientes tienen valores aumentados de las bilirrubinas, con
predominio de la bilirrubina directa.
Se demuestra que la prueba de ELISA cuando se analiza toda la fracción de la bacteria tuvo
alta positividad (95.2%), al igual que el Western Blot: el 100% de las muestras fueron
positivas.
Recientemente se han utilizado la técnica de PCR para detectar la bacteria, en especial
cuando hay poco parasitismo en sangre.
Últimos estudios de Western Blot realizados por Kosek y cols. Demuestran que esta prueba
tuvo mayor positividad en los pacientes eruptivos que los agudos. 4

8. La Bartonelosis o enfermedad de Carrión es producida por la Bartonella bacilliformis, que se presenta en
forma endémica en el Perú; el hombre al invadir el hábitat puede ser infectado y luego desarrollar la
enfermedad. El antecedente epidemiológico de haber visitado una zona verrucosa es un dato
importante en la historia clínica, pues nos puede orientar hacia la sospecha clínica; sin embargo, el
periodo largo de incubación, el olvido del paciente de este antecedente o el no darle la importancia
necesaria hace que el médico no piense en esta patología y se pueda demorar el diagnóstico y poner en
peligro la vida del paciente, como ha sucedido recientemente en un caso que ha producido
preocupación en la población.
La sospecha clínica debe ser necesariamente corroborada por el diagnóstico de laboratorio, existen
pruebas muy sensibles como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que está disponible en los
laboratorios del Instituto Nacional de Salud, pero en un establecimiento de salud, muchas veces en
corto tiempo, deben establecer el diagnóstico probable para empezar un tratamiento y como un cultivo
lleva mucho tiempo entonces este diagnóstico depende del examen de un frotis sanguíneo coloreado
con Giemsa.5

9. V. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento de la tinción Ziehl – Neelsen y qué utilidad tiene?
La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la
identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y
Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patólogo.
Este método se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácido graso|
ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con
colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia|bacilos ácido-alcohol resistentes o
BAAR. Las Mycobacterium como Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium marinum y los parásitos
coco (bacteria)|coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol
resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante
atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.6
La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la
preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante.
La solución decolorante elimina el colorante primario excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes.
(BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación.
Esta tinción es útil en la detección de bacterias del género Micobacterium en muestras de esputo. La
presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis.

10. 2.- ¿Por qué se emplea el medio Lowestein Jensen para el aislamiento de Mycobacterium?
Es esta una base para la preparación de varios medios destinados al aislamiento, cultivo y
diferenciación de micobacterias.
Fundamento
Los nutrientes de este medio basal, más los aportados por el agregado de la mezcla de huevos,
constituyen un rico soporte para el crecimiento de una gran variedad de micobacterias. El verde de
malaquita inhibe a gran parte de la flora acompañante. Con el agregado de glicerina se estimula el
crecimiento de Mycobacterium tuberculosis, aunque gran parte de M. bovis es inhibido. Agregando un
5% de NaCl, se pueden seleccionar micobacterias tolerantes a la sal, como es el caso de M. smegmatis.7
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Fosfato monopotásico 2.5 Suspender 37,3 g del polvo en 600 ml de agua
Sulfato de magnesio 0.24 destilada y agregar 12 ml de glicerina. Calentar
agitando continuamente y hervir un minuto.
Citrato de magnesio 0.6
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
Asparragina 3.6 minutos. Enfriar a 50°C aproximadamente.
Harina de papa 30.0 Mezclar asépticamente un litro de huevo íntegro,
evitando la formación de burbujas de aire y
agregar al medio base. Mezclar el huevo y la base
hasta uniformar. Distribuir en recipientes estériles
Verde de malaquita 0.4
adecuados y tapar herméticamente. Colocar los
mismos en posición inclinada y coagular a 85-90°C
durante 45 minutos.
pH final:4.8 ± 0.1
Siembra
Se recomienda, en procedimientos de rutina, inocular la muestra previamente decontaminada, sobre la
superficie del medio de cultivo.
Incubación
A 35-37°C. A los 7 días de incubación, se observa por primera vez si hubo crecimiento. Luego, observar
cada semana, hasta un total de 8 semanas.
Resultados
Observar las características morfológicas y la presencia o ausencia de pigmento en las colonias.
Microorganismos Crecimiento Características de las colonias
Mycobacterium tuberculosis Excelente Grandes, secas, amarillentas, granulares
Mycobacterium avium Excelente Lisas, sin pigmentos
Mycobacterium gordonae Excelente Lisas
Mycobacterium bovis --- ---
Características del medio

11. Medio preparado: verde pálido, opaco.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC
VI. CONCLUSIONES
• Mycobacterium se tiñe con tinción de Ziehl-Neelsen y crece en el medio de cultivo Lowestein
Jensen.
• Bartonella se tiñe con la tinción Guiemsa y crece en hemocultivos.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Barrón H. Diagnóstico molecular de Mycobacterium tuberculosis en biopsias pleurales
embebidas en parafina. Anales de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor
de San Marcos [Revista en Internet] 2006-[acceso el 19 de septiembre de 2009]; 67(1).
Disponible en: http://www.scielo.org.pe/pdf/afm/v67n1/a03v67n1.pdf
2. Wikipedia.org. Tuberculosis [Sede Web]. España: Wikipedia.org; 2009- [actualizado el 28 de
agosto de 2009; acceso el 18 de septiembre de 2009]. Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Tuberculosis
3. Armas L. Elementos del diagnóstico clínico y el tratamiento de la tuberculosis. Revista cubana
de Medicina General [Revista en Internet] 2006–[acceso el 18 de septiembre de 2009]; 12(1).
Disponible en: http://bvs.sld.cu/revistas/mgi/vol12_1_96/mgi09196.htm
4. Gonzáles C. Bartonelosis. Medicina y Seguridad del trabajo [Revista en Internet] 2006–[ acceso
el 18 de septiembre de 2009]; 58(209). Disponible en:
http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0465-546X2007000400006&script=sci_arttext
5. Zerpa L. Bartonelosis: Una nueva visión. Revista Peruana de Medicina Experimental Salud
Pública [Revista en Internet] 2006-[acceso el 18 de septiembre de 2009]; 23(3). Disponible en:
http://sisbib.unmsm.edu.pe/BvRevistas/Medicina_Experimental/v23_n3/pdf/a13v23n3.pdf
6. Wikipedia.org. Tinción Ziehl – Neelsen [Sede Web]. España: Wikipedia.org; 2009- [actualizado
el 28 de agosto de 2009; acceso el 18 de septiembre de 2009]. Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl_Neelsen
7. Britanialab.com. Tinción Lowestein-Jensen [Sede Web]. Argentina: Britanialab.com; 2009-
[acceso el 18 de septiembre de 2009] Disponible en:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lowesteinjensen.htm