Este documento describe varios métodos para el estudio de la célula, incluyendo técnicas fisicoquímicas como la centrifugación, cromatografía y electroforesis, y técnicas morfológicas como la microscopía óptica y electrónica. Explica cómo estas técnicas permiten aislar, identificar y observar los componentes celulares a nivel molecular y estructural, lo que contribuye al entendimiento de la composición y función celular.

1. PRACTICA N°2
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA
I. OBJETIVOS
Que el alumno conózcalas técnicas de estudio celular
Practicar y dominar las técnicas de estudio celular
II. FUNDAMENTO
Clasificaremos los métodos que se utilizan para el estudio de la célula en dos grandes
grupos:
1) Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la composición y relacionar
esta composición con las estructuras celulares. Estos métodos son:
a) Centrifugación
b) Cromatografía
c) Electroforesis
d) Cultivos "in vitro"
2) Técnicas para el estudio morfológico de la célula. Nos permiten conocer como es su
forma, su tamaño y su estructura. Son, fundamentalmente:
a) Microscopia óptica
b) Microscopia electrónica
Microscopio electrónico de Trasmisión (MET)
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
1) TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO FISICOQUÍMICO DE LA CÉLULA
Se utilizan para el aislamiento, localización e identificación de las sustancias que
constituyen la materia viva.
Presentan dos problemas principalmente:
a) Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas.
b) La mayoría de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de una
gran complejidad.
A) CENTRIFUGACIÓN
Consiste en la separación de los componentes de una
mezcla en función de las diferencias entre las
velocidades que presentan al someterlos a elevadas
aceleraciones (g). Esto se consigue haciendo girar la
mezcla en un rotor a un gran número de vueltas por
minuto. Los aparatos empleados con este fin se
denominan ultracentrifugas.
Esta técnica requiere los siguientes pasos:
1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACION: El
material biológico, por ejemplo: un fragmento de tejido
del hígado, es triturado para disgregarlo y romper las
membranas celulares.
La rotura de las membranas deja en libertad los
orgánulos celulares y el contenido del hialoplasma. Si la
homogeneización se realiza suavemente, los orgánulos
permanecerán intactos. Obtendremos así una "papilla"
que estará compuesta de restos de membranas,
orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua.
2) CENTRIFUGACION: Las ultracentrífugas son
maquinas que consiguen velocidades de rotación muy
elevadas, hasta 500.000 v/mn. Los materiales biológicos
sometidos a estas aceleraciones se desplazan hacia el
fondo de los recipientes que los contienen con
velocidades que dependen de su masa, de su forma y
volumen, y de la naturaleza del medio en el que se
realice la centrifugación.
B) CROMATOGRAFÍA
Se fundamenta en la separación de los componentes de
una mezcla por sus diferencias de absorción. Estas
diferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van der
Wals que se establecen entre los componentes de la
mezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria.

2. Según la naturaleza de la fase estacionaria, tendremos
los siguientes tipos de cromatografía:
1) CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL: Se emplea para la
separación de sustancias químicas que presenten
propiedades muy parecidas. Se opera de la siguiente
manera. Una pequeña cantidad de la mezcla a separar se
deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que
quedara embebida. A continuación se introduce el borde
del papel en una sustancia en la que sean solubles los
componentes de la mezcla que queremos separar. El
disolvente se desplazara por capilaridad y los ira
arrastrando. Los componentes de la mezcla viajaran más
o menos rápido según establezcan fuerzas más o menos
grandes con las moléculas del papel. Para observar los
componentes ya separados se emplean reacciones
coloreadas específicas.
2) CROMATOGRAFIA DE GASES: Consiste en un
serpentín largo y delgado cuyas paredes están
impregnadas de un liquido (fase estacionaria). La mezcla
a separar se vaporiza y atraviesa el serpentín transportada
por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los
diferentes componentes de la mezcla. Estos se detectan
cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo
que aumenta la conductividad eléctrica del detector. Este
método tiene la ventaja de necesitar pequeñísimas
cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias
muy parecidas químicamente; por ejemplo: ácidos grasos,
azucares u hormonas.
C) ELECTROFORESIS
En este método, la mezcla a separar se deposita en una
cubeta sobre un soporte de tipo poroso (acetato de
celulosa o también gel de almidón). A continuación se
establece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte. Las sustancias que
componen la mezcla se desplazaran en función de su carga eléctrica.
Naturalmente este método se empleara con sustancias que presenten cargas eléctricas
(proteínas y ácidos nucleicos)
D) CULTIVOS IN VITRO
Estos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismo
en condiciones favorables a su multiplicación.
La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biológico y su
estandarización.
Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones
físicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son
capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada
tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos periodos de tiempo.
2) MÉTODOS MORFOLÓGICOS
El ojo humano puede distinguir a 25 cm dos objetos separados entre si 0,2 mm. Este es el
poder separador o poder de resolución del ojo. Las células de mamífero suelen tener unos
0,01 mm, por lo que no es posible verlas a simple vista y mucho menos observar en ellas
detalles estructurales. El microscopio va a permitir su observación al aumentar el poder de
resolución del ojo.
CLASES DE MICROSCOPIOS
A) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
A1) EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET)
El microscopio electrónico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos teóricos de
De Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partículas. Como
ondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al ser
partículas negativas pueden ser desviadas por campos eléctricos que actúan como lentes.
En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio óptico. Un cátodo emite un haz

3. de electrones que son acelerados por la aplicación de una diferencia de potencial entre el
cátodo y el ánodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primera
lente magnética que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra.
Una segunda lente magnética, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Una
tercera lente, el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen final
es proyectada sobre una pantalla o fotografiada.
Los microscopios electrónicos permiten aumentos útiles que van de 2000 a 100.000
pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrónicos son aparatos de hasta 2 m
de alto y llegan a pesar 500 kg.
FIJACION. Las células son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los mas
corrientes son el tetroxido de osmio (OsO4), el formaldehido (HCHO) y el permanganato
potásico (MnO4K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan selectivamente a
las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan mas los metales aparecerán
mas oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo de fijador utilizado.
DESHIDRATACION e INCLUSION. La pieza es deshidratada e infiltrada mediante una
resina o plástico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte.
CORTE. Los cortes se realizan mediante ultra micrótomos de cuchilla de vidrio o de
diamante. Los cortes más finos (0,03μ) son depositados sobre un tamiz y dispuestos
para su observación al microscopio.
A2) MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB)
Este tipo de microscopio permite obtener imágenes tridimensionales del objeto a estudiar.
Primero se efectúa un sombreado metálico de la superficie de la muestra, y la réplica
obtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se forman
son captados y convertidos en imágenes sobre una pantalla de televisión. Estos
microscopio son muy útiles para revelar estructuras anatómicas submicroscopicas, sin
embargo su aumento no suele pasar de 20.000.
B) MICROSCOPIO ÓPTICO O FOTÓNICO
Funciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa envía rayos de luz a una primera
lente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar.
Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagen
aumentada de este. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por el
objetivo. Esta última imagen es la que será recibida por el observador.
PREPARACION DEL MATERIAL:
CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados
microtomos. Estos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor,
corrientemente entre 3 μ y 20 μ. El tejido destinado al corte debe congelarse o incluirse en
parafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad.
FIJACION. Su fin es matar a las células con la menor alteración de las estructuras posible,
para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismo
celular o por la descomposición. Como fijadores se emplean determinadas sustancias
químicas (por ejemplo: formaldehido y tetroxido de osmio).
DESHIDRATACION. La extracción del agua del interior de las células permitirá también
una mejor conservación y la penetración de los colorantes. Para deshidratar el material a
observar se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduación que por dilución irán
extrayendo el agua
TINCION. Es la coloración de las células o de partes de estas para que resalten y
posibilitar así su observación. Algunos colorantes son selectivos pues tiñen partes
concretas de la célula.
MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre un
porta-objetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y
"cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duración limitada y solo
sirven para la observación momentánea o a lo sumo de unos días. Si se desea una mayor
duración debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina.
III. PROCEDIMIENTO

4. ANEXO DE PRÁCTICA: MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
Introducción a técnicas microscópicas de uso común en Biología Celular y a
herramientas básicas para el manejo de microscopios fotónicos.
II. FUNDAMENTO
Una célula animal típica mide entre 10 y 20 μm de diámetro, muy por debajo del tamaño más
pequeño que puede apreciar el ojo humano (100 μm). Para observar estructuras tan pequeñas
y para distinguir detalles dentro de éstas, es necesario el uso de lentes magnificadoras. Una
lente convexa constituye un microscopio simple, pero generalmente no logra aumentos
mayores a 10 veces el tamaño real del objeto. Para obtener magnificaciones mayores se
desarrolló el microscopio compuesto, el cual está constituido por un sistema de lentes que
logran magnificaciones de más de 1000 veces el tamaño del objeto.
En el microscopio compuesto existen básicamente dos sistemas de lentes, uno ocular y otro
objetivo, además de todo el sistema mecánico encargado de darle soporte. Dentro de los
componentes no ópticos del microscopio se encuentran la base o pie y el brazo del
microscopio, los cuales en su conjunto se denominan estativo. En la base del microscopio se
localiza la fuente de luz del mismo, o el espejo responsable de dirigir la luz natural hacia la
muestra. La platina constituye un soporte sobre el cual se coloca el espécimen, y posee un
orificio que permite el pasaje de la luz. Asociados a esta platina existen dos tornillos que
permiten el desplazamiento en el plano xy del espécimen. A ambos lados del estativo se
disponen, generalmente, de forma concéntrica los tornillos de enfoque del microscopio
(macrométrico y micrométrico), encargados de mover hacia arriba y abajo la platina para poner
en foco el espécimen. Por encima de la platina se localiza el revólver portaobjetivo donde se
encuentran las lentes objetivas de distinto aumento. La rotación del revólver coloca a cada una
de las lentes en el eje óptico. Siguiendo el camino del eje óptico se encuentra el tubo donde se
localizan elementos del sistema óptico.
La parte óptica propiamente dicha está constituida por el condensador, la lente objetiva y la
ocular. El condensador es una lente convergente que toma los rayos de luz provenientes de la
fuente y forma un cono de rayos convergentes sobre la muestra. El condensador posee un
tornillo de enfoque que permite su movimiento hacia arriba y abajo para lograr una óptima
iluminación del espécimen. Además posee un diafragma o iris que regula la cantidad de luz que
atraviesa el condensador y llega al espécimen, así como el ángulo del cono de luz. Las lentes
ocular y objetiva son lentes convergentes, que describiremos en detalle más adelante.
Figura 1: Esquema del funcionamiento
de un microscopio compuesto. La luz
proveniente de una fuente pasa a través
de una lente condensadora y luego
atraviesa al espécimen localizado en el
soporte o platina del microscopio. La lente
objetiva forma luego una imagen real (es
decir que puede ser proyectada en una
pantalla) intermedia que se proyecta
justamente en el diafragma fijo de la lente
ocular. Esta imagen es posteriormente
aumentada aún más por la lente ocular
generándose una imagen virtual (no
puede ser proyectada en una pantalla)
invertida del objeto que es percibida por
el ojo como si estuviese a 2.5 cm de
distancia.
Características de las lentes objetivas:
La lente objetiva está compuesta por un conjunto de lentes, de las cuales la más frontal
(primera lente que atraviesan los rayos de luz en la lente objetiva) se encarga de generar una

5. imagen magnificada del objeto. El resto de las lentes se encargan de corregir aberraciones
ópticas. La aberraciones (distorsiones) esféricas o cromáticas son inherentes al diseño de toda
lente. Las aberraciones de tipo esféricas hacen que el campo se vea curvo cuando en realidad
es plano. Las aberraciones cromáticas son producto de los distintos índices de refracción de
las diferentes longitudes de onda que componen la luz blanca, y hacen que los objetos se vean
borrosos. Las lentes objetivas que presentan correcciones para ambos tipo de aberración se
denominan planapocromáticas.
La lente objetiva tiene inscripciones que indican ciertas características, tales como su
magnificación, apertura numérica, correcciones, etc. (figura 2). Las lentes objetivas de un
microscopio, que poseen distinto poder de magnificación, suelen estar diseñadas para
proyectar la imagen intermedia en el mismo punto del tubo, de manera que es necesario hacer
únicamente pequeñas correcciones con los tornillos de enfoque cuando se cambia de lente
durante la observación. Los microscopios que poseen este tipo de lentes se denominan
parafocales. Además, el centro del campo de observación es el mismo en los distintos lentes,
por lo cual se denominan paracentrales.
Iluminación:
Para obtener buenas imágenes es importante el uso de una correcta iluminación, utilizando
tanto fuentes naturales como artificiales de luz. La iluminación debe ser brillante y uniforme en
toda la muestra, lo cual se logra en los microscopios actuales utilizando el sistema de
iluminación Köhler. En este sistema, una lente colectora colocada por delante de la fuente
generadora de luz proyecta una imagen aumentada de la fuente de luz, cuyo foco se localiza
exactamente en el diafragma o iris del condensador. Al atravesar el condensador se genera un
haz de rayos paralelos que iluminan de manera uniforme la muestra. El diafragma del
condensador regula el ángulo del cono de luz que alcanza el espécimen. Modificando la
posición del condensador con el tornillo de ajuste del condensador y variando también la
apertura del diafragma iris del condensador se logra que el filamento de la fuente de luz se
localice en el plano focal de la lente objetiva. Es así que se obtienen condiciones óptimas de
iluminación de la muestra.
La función de un microscopio será entonces generar una imagen magnificada del objeto, esto
es una imagen de mayor tamaño que el objeto real, y que permita apreciar los detalles del
mismo, es decir que debe tener resolución. Generalmente a magnificaciones mayores, mayor
será la resolución de la imagen, aunque esto no siempre es cierto. Es importante comprender
entonces las diferencias entre magnificación (tamaño de la imagen) y resolución (detalles en la
imagen). Sin resolución, no importa cuán aumentada esté la imagen del objeto, esta no
aportará información al observador, la magnificación deja de aportar información útil para
transformarse en “magnificación vacía”.
Límite de resolución:
El límite de resolución se define como la menor distancia que puede haber entre dos puntos
para ser distinguidos como dos entidades independientes. Para el ojo humano esta distancia es

6. de 100 μm, es decir que dos puntos que estén separados una distancia menor a 100 μm serán
percibidos por el observador como un único punto.
La capacidad de distinguir (separar) detalles
pequeños será entonces el poder de resolución del
microscopio.
Teniendo en cuenta esta definición, el poder de
resolución de un microscopio aumenta cuando la
mínima distancia entre dos puntos que pueden distinguirse como dos objetos disminuye. El
límite de resolución de una lente puede calcularse
utilizando la ecuación de Abbe:
Donde λ es la longitud de onda de trabajo, y AN es la
apertura numérica, la que se calcula como:
AN = Ƞ. sen θ.
La apertura numérica depende de dos parámetros: el ángulo de incidencia de la luz en el lente
(2θ), y el índice de refracción del medio que separa el objeto de la lente objetiva (Ƞ) (figura 3).
Nótese que al aumentar el ángulo de incidencia de la luz, es decir en aquellos lentes de gran
apertura numérica, disminuye la distancia de trabajo, esto significa que la distancia entre el
espécimen y el extremo inferior de la lente objetiva es muy pequeña (figura 3).
Figura 3: Apertura angular de una lente objetiva.
Considerando las ecuaciones anteriores es evidente
que existen tres maneras de modificar el límite de
resolución de una lente: variando la longitud de onda
de trabajo, variando el índice de refracción, y el
ángulo del cono de luz que incide sobre la muestra.
Trabajando con longitudes de onda cercanas al
violeta (ver apéndice), se logra el mejor poder de
resolución, es decir valores de límite de resolución
pequeños. Por otro lado, para modificar el ángulo del
cono de luz que incide sobre la muestra puede
variarse la distancia del condensador al objeto o el
diseño del condensador. Para variar el índice de
refracción, lo que se hace es modificar el elemento
que está en contacto con el objeto y con la lente
objetiva. El índice de refracción (n) del aire es 1, el
del agua es 1.33 y el del aceite y vidrio es
aproximadamente 1.51 (figura 4). Por tal motivo
utilizando aceite entre el preparado y la lente objetiva,
se logra que los rayos de luz que atraviesan la muestra se desvíen poco y sean captados por la
lente.
Figura 4: Principio de trabajo
de lentes de objetivas de
inmersión en aceite. La
presencia de aceite en el
espacio comprendido entre el
cubreobjetos y la lente objetiva,
incrementa el número de rayos
provenientes del espécimen
que son captados por la lente
objetiva.
En algunas aplicaciones del microscopio no es necesario utilizar lentes objetivas de gran
apertura numérica ya que los detalles de la muestra pueden ser apreciados utilizando lentes
con aperturas numéricas más pequeñas. Esto además es importante ya que el trabajo con
lentes objetivas de gran apertura numérica trae aparejado el inconveniente de la disminución
de la profundidad de campo, la cual puede ser entendida como la distancia hacia arriba y abajo
del plano focal real del espécimen que se encuentra en foco. Otra desventaja es que la
distancia de trabajo (ver figura 3) es forzosamente menor en lentes de mayor apertura
numérica (pues θ es mayor).

7. 2) Microscopía de contraste de fase:
Los especímenes biológicos son generalmente transparentes, es decir que el contraste de la
muestra es tan bajo que, independientemente del aumento o del poder de resolución del
microscopio, el objeto es prácticamente invisible. Entonces, cuando es necesario mantener
inalterada la muestra, sin teñirla, se recurre a técnicas que permiten incrementar el contraste
natural. Este contraste se genera al transformar diferencias en el retardo del pasaje de la luz a
través de la muestra, en diferencias en intensidad de luz que puedan ser captadas por el ojo
humano o la cámara fotográfica. Los especímenes biológicos interaccionan con la luz de una
forma que no es uniforme, ya que retardan el pasaje de la misma de manera variable
dependiendo de la estructura celular que se interponga en su camino. Este retardo dependerá
del índice de refracción o grosor de la estructura celular generándose un retardo que
generalmente es de 1/4 λ.
El microscopio de contraste de fases está diseñado entonces, para generar contraste en los
especímenes biológicos transformando las diferencias de desfasaje de las ondas en diferencias
de amplitud (intensidad) que sean apreciables. El sistema posee un mecanismo constituido por
un disco opaco con un anillo transparente que se inserta en el condensador del microscopio.
Existe un anillo complementario en la lente objetiva, que tiene como función separar los rayos
que atravesaron la muestra, de los que no lo hicieron. Casi toda la luz que atraviesa el anillo
transparente en el condensador, pero no atraviesa la muestra, pasa luego por el anillo del
objetivo. La luz que atraviesa la muestra será retrasada y no atravesará el anillo de la lente
objetiva en ese plano.
El microscopio transforma el desfasaje de 1/4λ en uno de 1/2λ. Al existir dicho desfasaje entre
las ondas que atraviesan la muestra y las que no, éstas pueden interferir con las ondas que no
son retrasadas por la muestra, de manera destructiva (desfasaje de 1/2λ) generando oscuridad,
o constructiva (desfasaje de λ) generando zonas brillantes (Figura 6).
Este tipo de microscopía es la elegida para seguir el transcurso de ciertos procesos biológicos
ya que permite la observación de células vivas y no es necesario fijar y teñir la muestra para
generar contraste.
3) Microscopía de contraste interferencial de Nomarski (DIC):
El fundamento es similar al de contraste de fase, pero reduce al mínimo los artefactos ópticos
que ésta posee y aumenta la resolución. Separa por completo la luz directa de la difractada
utilizando prismas y transmisión de luz a través de vías complicadas. No se observan halos
brillantes donde hay cambios bruscos del índice de difracción de la luz, pero sí se genera un
falso volumen de la muestras (Figura 5).
III. PROCEDIMIENTO
1. Observación de célula vegetales:
Realizar cortes
Colocar una gota de agua en el portaobjetos y observar
2. Observación de células animales
Colocar una gota de sangre en el portaobjetos realizar un barrido con el cubreobjetos y
observar
3. Observación de hongos
Colocar una gota de agua en el portaobjetos, con el asa de siembra esparcir la
muestra, colocar el cubreobjetos y observar

8. IV. CUESTIONARIO
1. Registre los aumentos (X) y las aperturas numéricas (AN) de las lentes objetivas instaladas
en su microscopio.
Aumento (×) Apertura numérica
(AN)
2. En condiciones de observación con luz verde (λ = 550 nm) y usando la ecuación de
Abbe, indique el mejor límite de resolución (LR) obtenible con su microscopio. Explicite
los cálculos realizados.
3. Escriba los fundamentos de Microscopía de epifluorescencia.
4. Escriba los fundamentos de Microscopía láser confocal
5. Dibuje lo observado indicando el aumento correspondiente:
6. Escriba la ecuación de Abbe y explique brevemente su significado.
7. Explique brevemente el concepto de apertura numérica.
8. Explique la diferencia entre resolución y magnificación.
9. Identifique en el diagrama adjunto:

9. PRACTICA N°3
PERMEABILIDAD CELULAR.
I. OBJETIVOS
Analizar los fenómenos de ósmosis a través de la membrana plasmática de células
animales y vegetales.
Comprender los conceptos de permeabilidad de membrana, osmolaridad e isotonicidad
y su importancia.
II. FUNDAMENTO
Las membranas biológicas comparten una estructura general común. Están constituidas por
una bicapa muy delgada de moléculas lipídicas (fosfolípidos) y proteicas (aproximadamente
5 nm de espesor) que forman estructuras dinámicas y fluidas. En microscopía electrónica de
transmisión las membranas se observan como una estructura trilaminar debido a que la
región ocupada por las cabezas de los fosfolípidos se tiñe con el tetróxido de osmio
quedando electrón densa y la región hidrofóbica electrón lúcida. Una de las principales
funciones que desempeñan las membranas es mantener las diferencias esenciales entre el
medio intracelular y extracelular actuando como barreras selectivamente permeables.
Conceptos básicos:
1) Permeabilidad de membrana:
- membranas permeables: permiten el pasaje de todo tipo de moléculas.
- membranas semipermeables: permiten el pasaje de un sólo tipo de molécula.
- membranas selectivamente permeables: poseen diferentes grados de permeabilidad a
distintas moléculas.
2) Tonicidad de una solución:
- solución hipotónica: menor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra
solución.
- solución isotónica: igual concentración de solutos con respecto al interior celular u otra
solución.
- solución hipertónica: mayor concentración de solutos con respecto al interior celular u otra
solución.
3) Ósmosis:
Movimiento de agua en respuesta al gradiente de concentración de solutos. La fuerza que
dirige este movimiento se conoce como presión osmótica. No todos los solutos ejercen el
mismo efecto osmótico (concentraciones iguales de sales y moléculas no ionizables no
ejercen la misma presión osmótica).
4) Osmolaridad:
Es una medida de concentración que indica la presión osmótica ejercida por una solución.
Depende del número de partículas disueltas en la solución independientemente de su
naturaleza. La concentración fisiológica del interior celular es 0,3 osmolar. Es de suma
importancia considerar esta condición para la preparación de toda solución que interactúe
con células vivas. 24
2) PRUEBA DE VIBLIDAD CELULAR
Es el conteo de las células vivas
Protocolo de obtención de células para
(sanas) o muertas en una muestra. iniciar un cultivo primario (no será utilizado
Generalmente los métodos de en clase)
determinación de la viabilidad se basan - Cortar los órganos en trozos de menos de 2mm
en el análisis de dos parámetros: con 2 escalpelos en una gota de tampón salino
actividad metabólica de la célula o (PBS, pH 7.2-7.4).
integridad de membrana plasmática. - Agregar 1-1.5ml de solución de tripsina (en
Los métodos más comunes para tampón salino pH 7.2-7.4, con EDTA).
evaluar la integridad de membrana y - Incubar 15min a 37ºC y agregue
así determinar el índice de células aproximadamente 4 ml de medio de cultivo
suplementado con suero.
viables en una suspensión celular son
- Pipetear repetidamente (sin hacer espuma) a
los test de exclusión de colorantes fin de obtener una suspensión celular
vitales (ej.: Azul Tripán). Las células homogénea.
vivas, cuyas membranas celulares - Tomar una muestra de 500μl y agregar 500μl
estén integras, excluyen a estos de solución de Azul Tripán diluida.
colorantes en forma activa. El método - Observar rápidamente al microscopio
del Azul Tripán pone en evidencia el montando una gota entre porta y cubreobjeto.
Tampón fosfato salino (PBS) NaCl (8.0g), KCl
(0.2g), Na2HPO4 (2.1g), KH2PO4 (0.2g), H2O
(1litro).
Sol. concentrada de azul tripán: 200mg de
Azul Tripán en 50ml de agua destilada. Diluir 4
veces en PBS.
Tripsina: enzima proteolítica no específica.
EDTA: agente quelante de cationes divalentes

10. funcionamiento de un mecanismo de transporte activo a través de la membrana plasmática.
Por este procedimiento se visualizan las células mediante un microscopio y se cuentan las
células muertas (azules) en el total de la muestra. Este método es utilizado por ejemplo
previo a iniciar un cultivo, para determinar cuantas células vivas existen, permitiendo
optimizar las condiciones de cultivo. Además puede emplearse para determinar la eficacia
de agentes terapéuticos en la búsqueda de drogas, o en tests toxicológicos.
III. PROCEDIMIENTO
1. Morfología normal de eritrocitos y hoja de Elodea sp.
Corte una hoja de Elodea sp. y monte entre porta y cubreobjetos
Tome una gota de sangre y monte entre porta y cubreobjetos
Observe al microscopio
2. Comportamiento de las células vegetales frente a soluciones con diferente
concentración de solutos
Realice montajes de hojas de Elodea en soluciones de cloruro de sodio en diferentes
concentraciones
Observe al microscopio
Luego de algunos minutos, vuelva a montar y observe al microscopio el Comportamiento
de células animales (eritrocitos) frente a soluciones de diferente concentración.
IV. CUESTIONARIO
1.- Exprese la presión osmótica en términos de la ley de van't Hoff. Justifique brevemente.
2.- ¿Qué es la osmolaridad? ¿Cómo puede determinarse experimentalmente?
3.- Describa de forma breve en qué consiste la regla de Overton
4.- Indique con una flecha hacia dónde se producirá el flujo de agua en los siguientes
ejemplos. Justifique brevemente.
5.- ¿En qué se basa el método de determinación de la viabilidad celular con el colorante
azul Tripán?