1. PROPUESTA DE PROYECTO
DE INVESTIGACIÓN
FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES
CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS DE
MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE ENFERMEDAD
MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA
Santander 2009

3. PROPUESTA DE PROYECTO
DE INVESTIGACIÓN
FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES
CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS DE
MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE ENFERMEDAD
MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA
Santander 2009
1

4. www.investigandoenmeningitis.es
www.twitter.com/investigamening
Investigando en Meningitis
2

5. ÍNDICE
A. FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES
CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS
DE MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE
ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA:
UNA VISIÓN GENERAL. 5
B. FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES
CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS
DE MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE
ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA. 9
1. Resumen del proyecto 11
2. Estado de la técnica y problemática 11
3. Hipótesis y objetivos del proyecto 13
4. Metodología científica a seguir 16
5. Plan de trabajo 18
6. Experiencia del equipo y recursos técnicos 20
6.1. Investigadores principales:
6.2. Experiencia del equipo:
6.3. Recursos técnicos:
7. Relevancia y beneficios para el sistema 23
Presupuesto 24
ANEXO I. Bibliografía más relevante del estado del arte. 26
3

6. 4

7. FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS
CLONALES CIRCULANTES EN PORTADORES
ASINTOMÁTICOS DE MENINGOCOCO Y ALTA
INCIDENCIA DE ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA
EN CANTABRIA:
UNA VISIÓN GENERAL
5

8. 6

9. ¿QUÉ?
Se propone la realización de un programa de investigación con dos líneas de trabajo diferenciadas
que estudiará la incidencia de la meningitis en Cantabria desde el punto de vista epidemiológico
y del microbiológico (biología molecular).
¿POR QUÉ?
La Comunidad de Cantabria presenta una tasa de incidencia de la enfermedad por cada cien mil
habitantes claramente superior a la de una gran mayoría de las CCAA, prácticamente triplicando
la media en el Estado de forma continua durante los últimos 30 años
¿QUIÉN? y ¿DÓNDE?
El proyecto se realizará en dos Instituciones: el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla
(HUMV), Instituto de Formación e Investigación Marqués de valdecilla (IFIMAV) y el Centro
Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) de Madrid, con la participación
activa de 3 grupos:
· Grupo de Microbiología clínica y molecular del HUMV, Dr. Luis Martínez (Jefe de
Servicio).
· Grupo de epidemiología y patogenia de las enfermedades infecciosas de HUMV.
Dra. Carmen Fariñas (jefa de Área).
· Laboratorio de Referencia de Meningococos-ISCIII. Dr. Julio Vázquez (director del
laboratorio).
¿CÓMO?
1a. Determinación del tamaño muestral.
1b. Elección de la población de estudio.
1c. Contacto con la población de estudio.
1d. Recogida de Información.
2a. Aislamiento e identificación de N. meningitidis en portadores.
2b. Determinación de serogrupo, serotipo y serosubtipo.
2c. Electroforesis en campo pulsado.
2d. Multilocus Sequence Typing (MLST):
2e. Antibiograma y caracterización de genes de resistencia a los antimicrobianos:
7

10. ¿CUÁNDO?
La duración del proyecto sería de tres años, comenzado preferiblemente en 2009.
¿CUÁNTO?
Se calcula un presupuesto total aproximado cercano a los 410.000 €.
CONTACTO:
Luzma García Piqueres
Directora adjunta
Área de transferencia del conocimiento y desarrollo de proyectos europeos
IFIMAV
Fundación Marqués de Valdecilla
Escuela de Enfermería, 5º Planta
Avda. de Valdecilla s/n
39008 Santander
Tel: +34 942 315 109 (directo)
+34 942 331 077
Móvil: +34 676 953 386
Fax: +34 942 344 000
e-mail: ifimav.otri@fmdv.org
8

11. FACTORES ASOCIADOS CON LAS LÍNEAS CLONALES
CIRCULANTES EN PORTADORES ASINTOMÁTICOS
DE MENINGOCOCO Y ALTA INCIDENCIA DE
ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA EN CANTABRIA
9

12. 10

13. 1. RESUMEN DEL PROYECTO
El Objetivo global es conocer algunos factores tanto del huésped como del patógeno, que
pudieran asociarse a una elevada tasa de incidencia de enfermedad invasiva meningocócica en
la Comunidad de Cantabria. Para ello se propone realizar una amplia encuesta de portadores
asintomáticos en población de entre 4 y 19 años de edad, con objeto de poder definir mediante
técnicas moleculares (PFGE y MLST) los clones que están circulando en población general y
compararlos con los que se están aislando de casos clínicos. Esto nos permitirá conocer el
grado de transmisibilidad de los clones virulentos, así como de otros clones que circulen en
población general pero que se aíslen sólo ocasionalmente de casos clínicos. Una alta presencia
de clones identificados como virulentos entre la población general sintomática indicaría una alta
transmisibilidad de los mismos, unido bien a una alta virulencia o a un bajo nivel de inmunidad
natural. Una vez definidos los clones mayoritarios, se propone analizar el nivel de inmunidad
natural mediante una encuesta serológica para determinación de la Actividad Bactericida del
Suero frente a los mencionados clones mayoritarios, tanto entre portadores asintomáticos como
en aquellos aislados en casos de enfermedad invasiva.
Se propone la realización de un programa de investigación con dos líneas de trabajo diferenciadas
que estudiará la incidencia de la meningitis en Cantabria desde el punto de vista epidemiológico y
del microbiológico (biología molecular).
2. ESTADO DE LA TÉCNICA 1
Y PROBLEMÁTICA
La Enfermedad Meningocócica (EM) ha seguido un patrón cíclico en España, y desde los años
40 pueden observarse 5 picos de incidencia, que podrían definirse como picos epidémicos, con
periodos inter-epidémicos de duración variable con niveles de endemia que fluctúan entre 1 y 2
casos por cien mil habitantes. Esta información epidemiológica, basada fundamentalmente en
declaraciones de casos se complementa con información basada en datos de laboratorio desde
el año 1978, momento en que se funda el Laboratorio de Referencia de Meningococos (LRM),
entonces dependiente del Centro Nacional de Microbiología, Virología e Inmunología Sanitaria
(CNMVIS), ahora parte del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). De acuerdo con la información
existente, la Comunidad de Cantabria ha venido presentando tasas de incidencia de EM muy
superiores a las encontradas a nivel global en el Estado. Así, durante la onda epidémica de
fines de los años 70 a mediados de los 80, la tasa en Cantabria era de 38.37x105 mientras
que la tasa en España era de 12.8; en 1987 la tasa fue de 16.03 y 5.47 respectivamente;
1 En el Anexo I se facilitan las referencias bibliográficas más relevantes en este campo.
11

14. finalmente, en el último informe de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica de España,
correspondiente a la temporada 2005-2006, las tasas fueron de 3.24 y 1.38.
Así pues, la Comunidad de Cantabria presenta una tasa de incidencia de la enfermedad
por cada cien mil habitantes claramente superior a la de una gran mayoría de las CCAA,
prácticamente triplicando la media en el Estado de forma continua durante los últimos 30
años. Debe indicarse que si bien esta situación es característica de una gran parte de la cornisa
cantábrica, incluyendo País Vasco y Galicia, las tasas de la CA de Cantabria son sistemáticamente
las más elevadas.
Las razones de esta mayor tasa histórica de incidencia de EM son poco o nada conocidas,
y podrían pasar por características propias de las cepas circulantes en el territorio o bien por
características propias del huésped en la Comunidad, aunque probablemente una conjunción de
ambas pueda estar relacionada con la elevada tasa de enfermedad.
El único reservorio conocido, y por lo tanto fuente de la infección de Neisseria meningitidis, agente
causal de la EM, es el hombre. El microorganismo coloniza, la mayor parte de las veces de forma
asintomática, la nasofaringe, y este proceso de infección local no desemboca en enfermedad
invasiva en la inmensa mayoría de los casos. De hecho, a pesar de su reputación de patógeno
altamente virulento, el meningococo es básicamente un comensal de la flora normal que se
encuentra en la nasofaringe humana. El análisis de las características que condicionan el que una
cepa de meningococo produzca o no enfermedad invasiva ha llevado a definir “líneas clonales”
hipervirulentas (aquellas que son generalmente aisladas de casos clínicos y que han producido
epidemias en diferentes países/regiones del mundo), junto con otras líneas que podrían definirse
prácticamente como comensales, que nunca o raras veces se aíslan en procesos invasivos.
Desde el punto de vista de la inmunidad natural, y más específicamente, desde el punto de vista
de la protección frente a meningococo, se acepta ampliamente que la actividad bactericida del
suero (ABS), mediada por el complemento, es el indicador básico. Por lo tanto, anticuerpos
específicos frente a algunos de los antígenos externos del microorganismo, con capacidad de
activar la cascada del complemento, constituyen la principal defensa del huésped, tanto en
términos de inmunidad inducida como natural.
Con los antecedentes expuestos, no están claras las razones que explican aumentos en la
incidencia de la enfermedad en una zona geográfica concreta. Por un lado, parece evidente
que la llegada de un tipo de cepa determinado, que exprese diversos antígenos nuevos para la
zona, encuentra un territorio inmunológicamente virgen, en el que tiene una mayor facilidad para
diseminarse y producir casos de enfermedad invasiva. Sin embargo esto sólo explicaría aumentos
temporales de incidencia, ya que por regla general, la población ubicada en esa zona acabará
desarrollando cierto grado de inmunidad natural frente a ese nuevos o nuevos antígenos, de
forma que la curva epidémica revierta y muestre valores semejantes a los observados antes de
la llegada de esa nueva variante. No obstante, para que esto suceda, la transmisión de este tipo
12

15. de cepas debe ser suficientemente dinámica y no verse perjudicada por una excesiva producción
de enfermedad, lo que sin duda constituye una evidente paradoja en el caso de la EM. Por lo
tanto, un factor de gran importancia, que podría jugar un papel importante en determinar el
grado de endemia en una zona concreta, o aumentos puntuales de la misma, es el nivel de
inmunidad natural entre la población. Altos niveles de inmunidad natural en principio deberían
llevar aparejada una baja tasa de incidencia de la enfermedad, con una baja circulación de la
cepa. Sin embargo, unos niveles bajos en la circulación de una cepa concreta podrían traducirse
igualmente en una escasa renovación de la inmunidad natural, lo que daría lugar a un círculo
vicioso de poca transmisión y alta virulencia. Este modelo es uno más de los que podrían
realmente estar produciéndose en la evolución natural de la EM, aunque otros factores como las
infecciones del tracto respiratorio superior, condiciones climáticas etc. pueden igualmente tener
un cierto grado de influencia en las fluctuaciones descritas.
La tasa de incidencia de la Meningitis en Cantabria es la más alta de todo el país. Urge entender
las causas y conocer la naturaleza de la enfermedad en nuestra región.
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DEL PROYECTO
La información cruzada entre las líneas clonales presentes en portadores asintomáticos en
nasofarínge y las líneas clonales que se aíslan en casos de enfermedad invasiva meningocócica
en Cantabria podría ofrecer algún grado de explicación de la elevada tasa de incidencia de esta
patología en esta región geográfica.
Adicionalmente, el grado de inmunidad natural de la población frente, por un lado a los clones
13

16. mayoritarios entre los portadores, y por otro lado frente a los más abundantes entre los aislados
en casos clínicos, permitirá elaborar parámetros de comparación y establecer razones que
expliquen las diferencias mencionadas en cuanto a las tasas de incidencia de la enfermedad.
Unos niveles bajos de inmunidad natural frente a las líneas clonales que producen casos
explicaría altas tasas de ataque y por el contrario, niveles altos de inmunidad natural frente a
dichas líneas clonales podrían indicar alta circulación de esas líneas entre la población general,
unido a alta virulencia de las cepas.
1. Líneas clonales circulantes vs. líneas clonales de casos clínicos: Como ya se ha mencionado,
es de gran importancia evaluar el grado de transmisibilidad de las cepas que producen casos
de enfermedad invasiva. Por lo tanto, se propone un estudio consistente en una muestra
estratificada por edades y zona de residencia (rural o urbana). En todas las muestras se
determinará la presencia de Neisseria meningitidis, y todas las cepas aisladas se caracterizarán
por medio de serogrupo, serotipo y serosubtipo con anticuerpos monoclonales. Dicha
información sería cruzada con la información de las cepas aisladas de casos clínicos, lo
que permitirá la formación de “grupos teóricos de afinidad antigénica” (GTAA). Es decir, por
ejemplo, se englobarían en el mismo grupo cepas B:4:P1.15 y también las que resultaran
ser NG:4:P1.15, B:NT:P1.15 etc (todas las que teóricamente pudieran tener una expresión
antigénica similar). Dichos GTAAs serían analizados más en profundidad mediante PFGE
y Multilocus Sequence Typing (MLST) que permite la asignación de los aislados a líneas o
complejos clonales definidos, lo que permitirá conocer el grado de correspondencia entre los
aislados en nasofaringe de portadores sanos y los encontrados en enfermos.
2. Inmunidad natural: El grado de inmunidad natural viene determinado por el nivel de Actividad
Bactericida del Suero (ABS) frente a aislados concretos, en la población sin antecedentes de
enfermedad meningocócica. Para analizar este parámetro se recogerán entre 1 y 2 ml de sangre
de todos los participantes en la encuesta de portadores, constituyendo una seroteca de la
que posteriormente seleccionaremos aquellos sueros a utilizar. Se extraerá el suero de dichas
muestras y se procederá a determinar la ABS frente a la cepa utilizada internacionalmente para
esta metodología, así como frente a la cepa o cepas más prevalentes de entre las aisladas
en casos de enfermedad y las más frecuentemente aisladas en portadores asintomáticos en
la Comunidad Autónoma.
3. Sensibilidad a antimicrobianos: Se determinarán los patrones de sensibilidad de las cepas
aisladas en la encuesta de portadores frente a los antimicrobianos de mayor interés clínico
y epidemiológico, determinando la base genética de las resistencias que puedan aparecer a
penicilina, fluoroquinolonas y rifampicina.
14

17. 4. Factores asociados al estado de portador asintomático: Se identificarán las características
sociodemográficas así como posibles factores asociados al estado de portador asintomático
de N. Meningitidis y se correlacionarán con las características de las cepas aisladas y al
inmunidad natural de la población.
Podemos decir que en un proyecto como el planteado, vamos a tener dos poblaciones objeto
de estudio:
1. Por un lado, la población de referencia la constituyen todos los niños y jóvenes
de Cantabria. La población elegible la constituyen aquellos comprendidos entre
4 y 19 años y que tengan tarjeta sanitaria del sistema sanitario público (Servicio
Cántabro de Salud –SCS-).
2. Por otro lado, la otra población de referencia está constituida por las cepas
de meningococo aisladas de portadores asintomáticos y casos clínicos de
enfermedad invasiva en Cantabria.
Objetivos de la aproximación microbiológica:
1. Aislar e identificar a nivel de especie cepas de N. meningitidis en portadores de la población
de Cantabria.
2. Determinar los patrones de sensibilidad de las cepas aisladas a los antimicrobianos de
mayor interés clínico y epidemiológico, y determinar la base genética de las resistencias
que puedan aparecer a penicilina, fluoroquinolonas y rifampicina.
3. Establecer la relación clonal de los distintos aislados mediante electroforesis en campo
pulsado.
Objetivos de la aproximación epidemiológica:
1. Estimar la prevalencia de portadores asintomáticos de N. meningitidis en la población
infanto-juvenil de Cantabria.
2. Identificar las características sociodemográficas de los portadores asintomáticos de N.
Meningitidis.
3. Determinar los factores asociados al estado de portador asintomático de N. Meningitidis,
tales como factores sociales, característica sociodemográficas o de antecedentes clínicos
y vacunales
4. Analizar la relación entre las características sociodemográficas y clínicas de población
de estudio, las diferentes cepas clonales aisladas y los niveles de inmunidad detectados.
15

18. 4. METODOLOGÍA CIENTÍFICA A SEGUIR
1A. Determinación del tamaño muestral:
Para detectar una prevalencia de portadores asintomáticos de N. Meningitidis del 10%, con una
potencia estadística del 95% y una precisión de 0,02 se necesitaría incluir en el estudio al
menos a 864 individuos. Asumiendo una tasa de respuesta del 50% (similar a la encontrada
en otros estudios similares) se necesitarían 432 participantes más: en total 1296 niños/jóvenes.
Sin embargo, con este tamaño muestral y una prevalencia del 10% sólo encontraríamos 86
portadores. Dada la baja prevalencia de algunas cepas de meningococo (< 1%), para poder
alcanzar también los objetivos de identificación de cepas y evaluación de la transmisibilidad
de las mismas será necesario un mayor número de muestras positivas. Por ello, se propone
al menos incluir a 5000 sujetos en el estudio, de tal forma que se obtengan aproximadamente
500 muestras positivas, que permitan obtener datos significativos particularmente para aquellas
cepas (B:2a y otras) cuya baja prevalencia en portadores obliga a tomar un alto número de
muestras para obtener un número significativo.
1B. Elección de la población de estudio:
Prácticamente el 95% de la población de Cantabria está adscrita al SCS: en el año 2004
527.024 personas tenían tarjeta sanitaria, mientras que los datos del INE de ese mismo año
indicaban una población total de 554.784 habitantes en esta CC.AA. Por ello, se propone
muestrear a la población de estudio a partir de los datos de identificación de la Tarjeta Sanitaria
que se solicitarán al SCS. Se realizará un muestreo por conglomerados utilizando como unidad
primaria la Zona Básica de Salud (ZBS). Dentro de cada Centro de Salud se estratificará por
grupos de edad de forma proporcional a la población adscrita a cada ZBS. El rango de edades
se ha seleccionado en base a encuestas similares en las que se ha descrito que por debajo de
los 4 años de edad el porcentaje de meningococos en nasofaringe es extremadamente bajo,
mientras que el mayor porcentaje se encuentra entre los 10 y los 19 años de edad.
1C. Contacto con la población de estudio:
Se contactará con los sujetos incluidos en la muestra en sus propios hogares, mediante llamada
telefónica explicando el proyecto y pidiendo la autorización de los padres o tutores legales en el
caso de los menores de edad. A los que acepten se los citará para la entrevista, cumplimentación
de documento de consentimiento informado, toma de muestras y extracción sanguínea en su
Centro de Salud.
1D. Recogida de Información:
La recogida de información y muestras se hará distribuida a lo largo de un año completo (la
idea es incluir las 4 estaciones del año de forma que si el estudio comienza en primavera,
termine en la primavera del año siguiente lo que no condiciona el momento de inicio). A cada
uno de los participantes se les realizará una entrevista individual para la cumplimentación de un
16

19. cuestionario en el que se recogerá información sobre variables de interés epidemiológico: datos
sociodemográficos, antecedentes personales, enfermedades previas, historial de vacunaciones
y factores sociales. La historia de vacunaciones previas se obtendrá de las historias clínicas de
Atención Primaria.
2A. Aislamiento e identificación de N. Meningitidis en portadores:
En los individuos anteriormente indicados, se tomarán muestras nasofaríngeas con torunda.
Estas se inocularán en medio selectivo (medio NCY modificado) (35ªC, 5% CO2, 48 h) para
inhibir el crecimiento de la flora saprofita y favorecer el crecimiento y el reconocimiento de N.
meningitidis. De cada placa se seleccionarán al menos tres colonias con morfología compatible
con la del género Neisseria, ralizándose un subcultivo en agar chocolate para la obtención de
un cultivo puro. En los casos de cocos gramnegativos, oxidasa positiva y catalasa positiva que
fermenten la maltosa en medio CTA, se realizará una identificación bioquímica de N. meningitidis
empleando la galería comercial API 20NH. Se conservará un aislamiento por individuo.
Los microorganismos identificados como N. Meningitidis se caracterizarán adicionalmente
mediante determinación de serogrupo, serotipo y serosubtipo, asignación a lineas clonales
mediante analisis del ADN mediante electroforesis en campo pulsado y “multilocus sequence
typing”, y determinación de niveles de susceptibilidad a antimicrobianos (penicilina G,
ciprofloxacino, rifampicina y ceftriaxona).
2B. Determinación de serogrupo, serotipo y serosubtipo:
El serogrupo de todas las cepas de meningococo aisladas de portadores asintomáticos será
determinado mediante aglutinación con anticuerpos policlonales obtenidos en conejos en el
Instituto de Salud Carlos III. Posteriormente se determinará el serotipo y el serosubtipo mediante
enzimoinmunoensayo con células completas y anticuerpos monoclonales del National Institute
for Biological Standards and Control (NIBSC).
2C. Electroforesis en campo pulsado:
Se analizará el ADN de los aislamientos tras su digestión con NheI, empleando geles de
agarosa al 1% y un equipo CHEF-DR-II (6 V/cm). Una vez teñido el gel tras la electroforesis, los
diferentes perfiles se definirán considerando <=3 bandas de diferencia y se analizarán mediante
el coeficiente de Dice (Optimización 1.5%, tolerancia 1%). Se organizará una base de datos de
perfiles electroforéticos o pulsotipos que permita la comparación entre los diferentes grupos de
cepas mediante el programa informático Bionumeric.
2D. Multilocus Sequence Typing (MLST):
Las cepas de N. meningitidis, tanto las aisladas de portadores como de casos clínicos, serán
asignadas a líneas clonales establecidas, mediante la aplicación de MLST. Para ello en cada
cepa se amplificará y secuenciará un fragmento de alrededor de 450 pares de bases de cada
uno de los 7 genes definidos para la aplicación de esta metodología, siguiendo los protocolos de
17

20. amplificación y secuenciación accesibles en http://pubmlst.org/neisseria/mlst-info/nmeningitidis/
nmeningitidis-info.shtml. En cada cepa se definirá un perfil alélico y ese perfil alélico permitirá
asignar cada aislado a líneas clonales definidas.
2E. Antibiograma y caracterización de genes de resistencia a los antimicrobianos:
Se determinarán las CMIs de penicilina G, ceftriaxona, ciprofloxacino y rifampicina mediante
microdilución en caldo, siguiendo las recomendaciones del CLSI. Como cepas de control se
emplearán Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 y Escherichia coli ATCC 25922.
Los resultados se interpretarán mediante los puntos de corte para categorización clínica de este
mismo comité. En todos los aislados se determinará la producción de ß-lactamasa empleando
discos de nitrocefina.
En aquellas cepas para las que se obtengan CMIs para penicilina >= 0.5 mg/L, se secuenciará
el gen penA tras amplificación del mismo mediante PCR empleando cebadores específicos. Se
asignará el número de alelo penA de acuerdo con la base de datos http://neisseria.org/perl/
agdbnet/agdbnet.pl?file=penA.xml, y en función de los diferentes alelos se construirá un árbol
filogenético de los aislados.
En las cepas para las que la CMI de ciprofloxacino sea >=0.06 mg/l se secuenciarán las
regiones que determinan resistencia a quinolonas de los genes gyrA y parC.
En las cepas resistentes a rifampicina se procederá a la caracterización de un fragmento del
gen rpoB de acuerdo con protocolos recomendados por el European Monitoring Group on
Meningococci (EMGM), asignando alelos en función de criterios establecidos por este grupo
europeo de trabajo.
5. PLAN DE TRABAJO
El proyecto se realizará en dos Instituciones: el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla
(HUMV), Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla (IFIMAV) y el Centro
Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) de Madrid, con la participación
activa de 3 grupos:
• Unidad de Enfermedades Infecciosas. Servicio de Medicina Interna del HUMV
• Servicio de Microbiología del HUMV
• Laboratorio de Referencia de Neisserias del ISCIII
Con arreglo al siguiente plan de trabajo:
18

21. Unidad de Enfermedades Infecciosas del HUMV:
Los miembros del EI de esta unidad procederán a la recogida de información y muestras,
distribuida esta última a lo largo de un año completo. Se procederá a realizar una entrevista
individual a cada uno de los 5000 participantes en el estudio de portadores. Igualmente, esta
persona procederá a realizar la toma de muestra nasofaríngea mediante toma con hisopo de
faringe posterior a través de la boca, inoculación inmediata en medio selectivo y transporte al
laboratorio en un tiempo inferior a las 5 horas, tal y como recomienda el EMGM. De igual forma, se
procederá a realizar la toma de muestra de sangre para la posterior determinación de la ABS. Las
muestras de sangre serán congeladas a -70ºC hasta su utilización. La preparación y planificación
del estudio de portadores se llevará a cabo durante los primeros 3 meses del proyecto, mientras
que la toma de muestras se llevará a cabo durante los siguientes 12 meses. Toda la información
obtenida de los individuos participantes en el estudio de portadores asintomáticos será codificada
e introducida en una base de datos. Posteriormente, la información será analizada mediante el
paquete estadístico SPSS Statistics versión 17. Inicialmente se realizará un análisis descriptivo de
los datos para conocer el tipo y distribución de las variables y seleccionar las pruebas estadísticas
más apropiadas. Se calcularán medias y desviaciones estándar en variables continuas y distribución
de frecuencias y porcentajes en variables categóricas. Las pruebas de significación estadística
a utilizar serán la prueba t de Student y el análisis de correlación y regresión para variables
continuas y la prueba de chi-cuadrado para variables cualitativas. Se calculará la prevalencia de
meningococo con su intervalo de confianza y se realizará un análisis de la prevalencia, calculando
la razón de prevalencia (RP) y su IC 95% para identificar posibles relaciones entre los valores de la
prevalencia y las distintas variables epidemiológicas recogidas. Se realizará análisis multivariable
mediante regresión logística para ajustar por posibles factores de confusión. El análisis tanto de
las variantes sociodemográficas como de las diferentes variantes microbiológicas a incluir (líneas
clonales en portadores vs enfermos, pulsotipos vs líneas genéticas definidas por MLST etc.) se
realizará a lo largo de los 3 años de duración del estudio, ya que los datos de laboratorio irán
obteniéndose de forma escalonada.
Servicio de Microbiología del HUMV:
Se procederá a determinar la presencia de N. meningitidis en las muestras y posteriormente
procederán a conservar dos muestras de cada una de los aislados, uno que permanecerá
en el Servicio y otro que será enviado al ISCIII. Las muestras se analizarán en el Servicio de
microbiología del HUMV mediante electroforesis en campo pulsado y también se procederá a
determinar los niveles de susceptibilidad a antimicrobianos, así como a determinar posibles
mecanismos genéticos de resistencia. Este trabajo comenzará a los 3 meses de iniciado el
proyecto, continuándose hasta los dos años y medio de iniciado el estudio.
Laboratorio de Referencia de Neisserias del ISCIII:
Se procederá a determinar el serogrupo, serotipo y serosubtipo en todas las muestras, así como procederá
a asignar dichos aislados a líneas clonales definidas mediante MLST, realizándose el análisis de las
líneas clonales resultantes así como la comparación con las obtenidas en casos clínicos de Cantabria
en los últimos 5 años. Se procederá a determinar las ABS en las muestras de suero seleccionadas a
19

22. tal efecto por el grupo de Enfermedades Infecciosas del HUMV. Este trabajo se iniciará a los 4 meses de
iniciado el estudio y continuará hasta transcurridos los dos años y medio del estudio.
La totalidad del EI procederá a realizar un análisis global de resultados mediante el análisis de
una base de datos que incluya tanto los datos demográficos como los microbiológicos. Cada uno
de los grupos analizará la parte correspondiente a su aportación al proyecto y adicionalmente se
realizará un análisis global incluyendo todas las variables estudiadas. Este trabajo se llevará a
cabo durante los 6 últimos meses del proyecto.
6. EXPERIENCIA DEL EQUIPO Y RECURSOS TÉCNICOS
6.1. Investigadores Principales:
· Grupo de Microbiología clínica y molecular del HUMV, Dr. Luis Martínez (Jefe de Servicio).
· Grupo de epidemiología y patogenia de las enfermedades infecciosas de HUMV. Dra.
Carmen Fariñas (jefa de Área).
· Laboratorio de Referencia de Meningococos-ISCIII. Dr. Julio Vázquez (director del
laboratorio).
6.2. Experiencia del Equipo:
El Laboratorio de Referencia de Meningococos-ISCIII tiene abiertas diferentes líneas de
investigación en Enfermedad Meningocócica y en el mismo se han producido 3 tesis doctorales
en los últimos 5 años: “Desarrollo y aplicación de un nuevo marcador molecular para Listeria
monocytogenes: Multilocus Séquense Typing. Análisis de la estructura poblacional de la especie”
2004, “Genética evolutiva y variabilidad de la proteína PorB de Neisseria meningitidis” 2007, y
“Nueva estrategia de tipado en Neisseria meningitidis: Polimorfismo y fragmentos de restricción
del gen porA”, 2008, todas ellas con la calificación de SOBRESALIENTE “CUM LAUDE”.
Desde el año 2001 a 2005 el grupo lideró el WP5 (Antibiotic resistance) del Proyecto “Impact of
meningococcal epidemiology and population biology on public health in Europe”, subvencionado
por una ayuda de la Unión Europea QLK2-CT-2001-01436, fruto del cual se realizaron las
siguientes publicaciones:
J Antimicrob Chemother 2002; 49: 545-547. J Infect Dis, 2003; 187: 1010-1014. Antimicrob
Agents Chemother, 2003; 47: 3430-3434. J Biol Chem 2003; 278: 31529-31535. Antimicrob
Agents Chemother, 2004; 48: 348-349. FEMS Microbiol Rew, 2007; 31(1):97-100. FEMS
Microbiol Rew, 2007; 31(1):64-70.
20

23. Desde el año 2004 a 2007 parte del EI recibió una ayuda del ISCIII para el proyecto sobre
“Tipabilidad de Neisseria Meningitidis basada en proteína de tipo 1 y su implicación en el desarrollo
de vacunas: caracterización molecular”, dando lugar a las siguientes publicaciones:
J Med Microbiol, 2004; 53: 515-518. Clin Vaccine Immunol. 2006; 13: 1087–1091. Emerg
Infect Dis. 2008; 14:688-689.
En el año 2006 el EI consiguió una subvención del FIS para el desarrollo del proyecto sobre
“Nuevos mecanismos de resistencia frente a antimicrobianos en Neisseria meningitidis”, proyecto
que ha permitido realizar la siguientes publicaciones:
Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51:2784-2792. J Antimicrob Chemother. 2008; 61:286-
290. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53:796-7
Finalmente, en relación al desarrollo y aplicación de vacunas en enfermedad meningocócica,
el EI ha recibido fondos de la industria farmacéutica en diferentes Convenios de Colaboración,
para seguimiento de epidemiología en situación post-vacunal, para análisis y caracterización de
aislados responsables de cambios en epidemiología y para estudios de variabilidad y expresión
de antígenos potencialmente incluidos en vacunas en desarrollo, así como para intervenciones
en salud publica mediante encuestas de portadores asintomáticos. En relación con este tema,
en los últimos años el grupo ha realizado las siguientes publicaciones más relevantes:
Emerg Infect Dis 2002; 8:1512-1514. J Med Microbiol, 2002; 51:1102-1106. J Med Microbiol
2003; 52:75-77. Infect, 2003; 31:51-4. J Med Microbiol. 2003; 52:75-7. Infection. 2003;
31:392-397. Euro Surveill. 2004; 9:11-15. Forensic Sci Int. 2005; 147:13-20. Enferm Infecc
Microbiol Clin. 2006; 24:608-612. J Exp Med 2008; 205:1423-1434. J Clin Microbiol 2009;
47:463-465.
La Unidad de Enfermedades Infecciosas del HUMV aunque no está realizando en estos momentos
ningún estudio relacionado directamente con la enfermedad meningocócica tiene amplia
experiencia en la realización de estudios epidemiológicos en el campo de las Enfermedades
Infecciosas tanto comunitarias como nosocomiales. Ejemplo de ello son las siguientes
publicaciones: Hosp Infect. 2008;70(1):48-52; Clin Exp Rheumatol. 2008;26(5):854-9. Scand
J Infect Dis. 2007;39(3):225-30; Ann Thorac Surg. 2006 ;81(4):1284-90; Infect Control Hosp
Epidemiol. 2006;27(1):85-8; Chest. 2005;128(4):2647-52.
El Servicio de Microbiología del HUMV es uno de los más activos en investigación en su campo
del sistema nacional de salud, perteneciendo, entre otros, a la Red Española de investigación en
patologías infecciosas, dónde ya colaboran de forma activa con el Laboratorio de Referencia de
Meningococos. Trabajan en las siguientes líneas de investigación:
21

24. • Resistencias a beta-lactámicos, fluoroquinolonas, aminoglicósidos, glicopéptidos.
Multirresistencia a los antimicrobianos. Bases bioquímicas y genéticas. Impacto
clínicos de la resistencia a los antimicrobianos.
• Diseminación de la resistencia a antibióticos en bacterias Gram-negativas.
• Diseminación de la resistencia a antibióticos en bacterias Gram-positivas.
• Evaluación de métodos para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos.
• Aplicaciones de la microbiología molecular en el diagnóstico y epidemiología de
las enfermedades infecciosas.
Como ejemplo de algunas de las publicaciones más relevantes del grupo se facilitan algunas
referencias: Lancet 1998, 351:797-799; Antimicrob Agents Chemother 1999, 43: 1657-1661;
Antimicrob Agents Chemother 2000, 44: 2534-2536; Antimicrob Agents Chemother 2001, 45:
2390-2392; Antimicrob Agents Chemother 2002, 46: 3926-3932; J Antimicrob Chemother
2003, 51:1037-1039; J Clin Microbiol 2004, 42:1089-1094; J Clin Microbiol 2004,
42:3734-3738; FEMS Microbiol Rev, 28:79-100, 2004; Antimicrob Agents Chemother 2005,
49: 2122-2125; J Antimicrob. Chemother 2005. 56:251-252; Antimicrob Agents Chemother
2005 49:3311-3316; CLin Infect Dis 2005, 41: 227-232; Clin Microbiol Infect 2006. 12:
440-445; J Clin Microbiol 2006, 44 :2672; Antimicrob Agents Chemother. 2007, 51:2236-9;
J Antimicrob Chemother. 2007, 60:855-63; J. Bacteriol. 2007, 189:8546-55; Infect Immun.
2007 Feb;75(2):774-80; Antimicrob Agents Chemother. 2008, 52:1503-5; Antimicrob Agents
Chemother. 2008, 52: 2297-2299; Pediatr Infect Dis J. 2008, 27: 602-604; BMC Microbiol.
2008, 8:148; Antimicrob Agents Chemother. 2009, 53:267-270; Antimicrob Agents Chemother.
2009, 53:1177-1184; J Clin Microbiol 2009, 47: 827-829.
6.3. Recursos Técnicos.
El Proyecto cuenta con toda la infraestructura de uso común del Hospital Marqués de Valdecilla
de Santander, así como del Instituto de Salud Carlos III de Madrid, incluyendo Unidades de
preparación de Medios y Material, Unidades de Secuenciación, etc. También se cuenta con
los medios de cada uno de los grupos participantes que incluyen congeladores, aparatos de
electroforesis en campo pulsado, lectores de enzimoinmunoensayo, termocicladores para PCR
y secuenciación etc.
Tanto los recursos técnicos como los expertos necesarios para la buena realización del proyecto
están involucrados y garantizados en el mismo.
Además, existe un compromiso institucional desde el IFIMAV para el apoyo y la buena
consecución del proyecto.
22

25. 7. RELEVANCIA Y BENEFICIOS PARA EL SISTEMA
1. Por un lado, el poder entender alguna de las razones que expliquen altas tasas de incidencia
de enfermedad invasiva meningocócica puede facilitar los procesos de intervenciones de
Salud Publica en el control y prevencion. Conocer cuales son las cepas circulantes, su
posible grado de virulencia en función de su presencia o no en casos clínicos, y el nivel de
inmunidad natural en la población, son instrumentos fundamentales para toma de decisiones
con las vacunas frente a serogrupo B que están en desarrollo.
2. El proyecto planteado, previsiblemente podría generar al menos 4 manuscritos para publicar
en revistas con impacto entre 4 y 5. Los temas que podrían generar este tipo de publicaciones
serían: el análisis de factores asociados al estado de portador asintomático, la descripcion de
clones circulantes y su relación con los clones de casos clínicos, la descripción de los niveles
de inmunidad natural frente a diferentes líneas clonales y su posible asociación con las tasas
de incidencia de la enfermedad, y la descripción de los niveles de susceptibilidad frente a
antimicrobianos en la población de meningococos procedente de portadores asintomáticos,
como reservorio potencial de resistencia para los clones virulentos. Asimismo, el proyecto
previsiblemente generará al menos 4 o 5 comunicaciones en Reuniones Científicas de ambito
Internacional, tales como la Reunión de la Sociedad Europea de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica, la Conferencia Internacional de Neisserias Patógenas y la Reunión del
Grupo Europeo para Monitorización de Meningococos.
3. Aunque no analizado a priori, sería posible que los resultados del proyecto pudieran dar
lugar a resultados, no sólo protocolizables sino también protegibles mediante derechos de
propiedad industrial/intelectual.
Entender el porqué de la alta incidencia de la meningitis en nuestra región es la única vía para
bajar dichos niveles y, con ello, mejorar la salud de nuestros ciudadanos y reducir costes en
gasto sanitario.
Los resultados obtenidos, además, constituirán una buena base de trabajo para avanzar en la
frontera del conocimiento de esta enfermedad y podrán tener una importante repercusión en
su campo mediante la publicación y difusión activa de sus resultados.
23

26. PRESUPUESTO
Un proyecto como el planteado requiere de la aportación de un alto número de personas, por
el tamaño de la población a muestrear y por la cantidad de técnicas diferentes a aplicar. Por lo
tanto, el Equipo Investigador ha valorado la necesidad de contratación de dos personas para
la Unidad de Enfermedades Infecciosas del HUMV para la toma de muestras, entrevista con los
participantes en el estudio de portadores asintomáticos y análisis de las múltiples variables
incluidas (un licenciado en medicina y una enfermera/o), una persona para el Servicio de
Microbiología del HUMV (1 licenciada/o) y una persona para el laboratorio de Referencia de
Neisserias del ISCIII (1 licenciada/o).
La adquisición de torundas para la toma de muestras y tubos para extracción de sangre
constituyen la herramienta básica para poder obtener el material propio del estudio.
Por otra parte, la unica forma de definir con precisión las líneas clonales circulantes es el MLST,
técnica que requiere de la secuenciación de fragmentos de 7 genes lo que supone un muy elevado
número de reacciones de amplificación y secuencia, y lo mismo puede decirse en el caso del
análisis de los mecanismos genéticos de las posibles resistencias que vayamos a ancontrar.
Por otra parte, el Equipo Investigador ha considerado imprescindible el analizar los aislados
mediante campo pulsado con objeto de poder definir con mayor precisión posibles variantes
dentro de las lineas clonales. La solicitud de fondos para llevar a cabo esta metodología se
ajusta al plan de trabajo contemplado.
Finalmente, la solicitud de viajes y dietas se ajusta a la existencia de 3 grupos de trabajo
participando en el Equipo de Investigación, y responde al potencial expresado en cuanto al
impacto bibliométrico del Proyecto solicitado.
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27. PARTIDA COSTE (EUR)
3 Licenciados 1ª año 75.600
2ª año 77.112
3ª año 78.654
1 enfermera/o 1ª año 22.390
2ª año 22.838
3ª año 23.295
SUBTOTAL 299.889
2. Gastos de ejecución
a) Adquisición de bienes y contratación de servicios 1ª año 24.200
(Inventariable, fungible y otros gastos) 2ª año 29.500
Torundas para toma de muestras 3ª año 26.000
Tubos para extracciones de sangre
Medios de cultivo y reactivos para identificación
Material para antibiogramas
Reactivos y material de plástico para PCR y PFGE
Reactivos y material de plástico para Secuenciación
Reactivos para determinación de ABS
SUBTOTAL 79.700
SUBVENCION CONCEDIDA POR EL FIS 70.000
(Fondo investigación Sanitaria del ISCIII, PLAN NACIONAL I+D) *
b) Viajes y dietas 1ª año 0
Asistencia a 3 Reuniones Científicas de Carácter Internacional para 2ª año 3.500
presentación de Resultados 3ª año 3.500
SUBTOTAL 7.000
SUBVENCION CONCEDIDA POR EL FIS 1.500
(Fondo investigación Sanitaria del ISCIII, PLAN NACIONAL I+D) *
SUBTOTAL GASTOS EJECUCIÓN CONSIDERADA LA SUBVENCIÓN DEL FIS 315.089
GASTOS DE GESTIÓN 31.509
TOTAL PROYECTO PENDIENTE FINANCIACIÓN 346.598
* El proyecto ha sido presentado a la convocatoria del Fondo de Investigación Sanitaria (FIS) 2009 del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) del
Plan Nacional de I+D evaluada por la Agencia Nacional de Evaluación y Prospectiva (ANEP) resultando elegido y concedida la subvención
señalada en la tabla de presupuesto del proyecto.
25

28. ANEXO I
BIBLIOGRAFÍA MÁS RELEVANTE DEL ESTADO DEL
ARTE
26
26

29. 1. Ala’Aldeen DA, Neal KR, Ait-Tahar K, Nguyen-Van-Tam JS, English A, Falla TJ, Hawkey
PM & Slack RC (2000). Dynamics of meningococcal long-term carriage among university
students and their implications for mass vaccination. J Clin Microbiol; 38: 2311–2316.
2. Broome CV (1986). The carrier state: Neisseria meningitidis. J Antimicrob Chemother;
18(Suppl. A): 25–34.
3. Cartwright K (1995). Meningococcal carriage and disease. Meningococcal Disease
(Cartwright K, ed), pp. 115–146. John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK.
4. Cartwright K (2001). Epidemiology, surveillance, and population biology: carriage studies.
Meningococcal Disease – Methods and Protocols (Pollard AJ & Maiden MCJ, eds), pp.
293–311. Humana Press Inc, Totowa, NJ.
5. Caugant DA, Kristiansen B-E, Fr_holm LO, B_vre K & Selander RK (1988). Clonal diversity
of Neisseria meningitidis from a population of asymptomatic carriers. Infect Immun; 56:
2060–2068.
6. Caugant DA, H_iby EA, Rosenqvist E, Fr_holm LO & Selander RK (1992). Transmission
of Neisseria meningitidis among asymptomatic military recruits and antibody analysis.
Epidemiol Infect; 109: 241–253.
7. Caugant DA, Tzanakaki G, Kriz P (2007). Lessons from meningococcal carriage studies.
FEMS Microbiol Rev; 31: 52–63.
8. Claus H, Maiden MC, Wilson DJ, McCarthy ND, Jolley KA, Urwin R, Hessler F, Frosch M &
Vogel U (2005). Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults. J
Infect Dis; 191: 1263–1271.
9. Jolley KA, Wilson DJ, Kriz P, McVean G & Maiden MC (2005). The influence of mutation,
recombination, population history, and selection on patterns of genetic diversity in Neisseria
meningitidis. Mol Biol Evol; 22: 562–569.
10. Jordens JZ, Williams JN, Jones GR, Christodoulides M & Heckels JE (2004). Development
of immunity to serogroup B meningococci during carriage of Neisseria meningitidis in a
cohort of university students. Infect Immun; 72: 6503–6510.
11. Maiden MCJ (2004). Dynamics of bacterial carriage and disease: lessons from the
meningococcus. Hot Topics in Infection and Immunity in Children (Pollard AJ,McCracken GH
Jr & Finn A, eds), pp. 23–29. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York.
12. Yazdankhah S, Kriz P, Tzanakaki G, Kremastinou Kalmusova J, Musilek M, Alvestad T, Jolley
K, Caugant DA & Maiden MC (2004). Distribution of serogroups and genotypes among
disease-associated and carried isolates of Neisseria meningitidis from the Czech Republic,
Greece and Norway. J Clin Microbiol; 42: 5146–5153.
27

30. 28