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INTRODUCCION
Electroforesis De Ácidos Nucleicos En Geles De Agarosa
“Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida”, la electroforesis es el movimiento de
partículas cargadas en un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden
tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa
debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos
nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. Además de la poliacrilamida, la
agarosa puede ser utilizada como soporte para la corrida electroforética. La agarosa es un
polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado
sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida. Esta
característica permite una fácil preparación de una matriz porosa para ser usada en
electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un
amortiguador adecuado, se calienta y se “chorrea” sobre un molde particular. Una ventaja
que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además
permite el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo,
su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de
agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La
concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar. Esto porque
la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor
concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los
ácidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que
ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos
nucleicos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de
ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la
migración no solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el
grado de superenrrollamiento que ésteposeea. Generalmente en una preparación de
plásmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la forma
superenrrollada, la forma semirelajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones
externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s).

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MARCO TEORICO
Electroforesis De Ácidos Nucleicos En Geles Agarosa
La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en
función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis
describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.
«Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar». Así
pues, la electroforesis en gel es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica a las
moléculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la
tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de
una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a
través de un medio gelatinoso. Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo,
los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen
grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas
eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las
partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por ejemplo, cuando se
aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados
negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997).
La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y rápida que
permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros
procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse en el gel tiñendo con una
concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se
utiliza como colorante. En las siguientes secciones se presentan los principios físicos, los
componentes (matriz de gel, tampón, tampón de carga y marcador) y los procedimientos
para preparar la electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989).
a electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las
proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa.
Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución
tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente. La corriente eléctrica
de un electrodo repélele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de
fricción del material de gel actúa como «tamiz molecular», separando las moléculas en
función de su tamaño. Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través
de los poros,
de pendiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores:
•fuerza del campo
•tamaño y forma de las moléculas

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•hidrofobicidad relativa de las muestras
•fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas.
Para tener una idea cabal del proceso de separación de las partículas cargadas en la
electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a esta
técnica. Cuando se aplica tensión a los electrodos se genera un gradiente de potencial (E),
que puede expresarse con la siguiente ecuación:
E = V/d donde V, medida en voltios, es la tensión aplicada y de la distancia en cm entre los
electrodos. Al aplicarse el gradiente de potencial (E) se genera una fuerza (F) en una
molécula cargada, que puede expresarse con la siguiente ecuación: F = Eq donde q
corresponde a la carga en culombios que lleva la molécula. Esta es la fuerza, medida en
Newton, que empuja la molécula cargada hacia el electrodo. Existe asimismo una resistencia
de fricción que ralentiza el desplazamiento de las moléculas cargadas. Esta fuerza de
fricción es función de los siguientes factores:
•tamaño hidrodinámico de la molécula
•forma de la molécula
•tamaño de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis
•viscosidad del tampón.
La velocidad v de una molécula cargada en un campo eléctrico depende del
gradiente de potencial, la carga y la fuerza de fricción de la molécula, y puede expresarse
con la siguiente ecuación: v = Eq / f donde f es el coeficiente de fricción. La movilidad
electroforética (M) de un ión puede entonces determinarse dividiendo la velocidad del ión por
el gradiente de potencial:
M = v / E Además, de la ecuación se infiere que la movilidad electroforética M expresarse
de modo equivalente como la carga de la molécula (q) dividida por el coeficiente de fricción
(f): M = q / f Cuando se aplica una diferencia de potencial, las moléculas que poseen
distintas cargas globales comenzarán a separarse debido a sus diferentes movilidades
electroforéticas. La movilidad electroforética es un parámetro significativo y característico de
las moléculas o partículas cargadas y depende del valor de pK del grupo cargado y del
tamaño de la molécula o partícula. Incluso las moléculas con cargas semejantes empezarán
a separarse si sus tamaños moleculares son distintos por cuanto estarán sometidas a
fuerzas de fricción diferentes. El ADN bicatenario lineal migra por las matrices de gel a
velocidades inversamente proporcionales al log10del número de pares de bases. Las
moléculas más grandes migran más despacio debido a la mayor resistencia de fricción y a la
menor eficacia del desplazamiento a través de los poros del gel. La corriente que atraviesa
la solución entre los electrodos es conducida principalmente por los iones del tampón, si bien
una pequeña proporción lo es por los iones de la muestra. La relación entre intensidad I,
tensión V y resistencia R se expresa según la ley de Ohm: R = V / I .Esta ecuación muestra
que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la separación electroforética
aumentando la tensión V aplicada, lo cual dará lugar al correspondiente incremento de la
intensidad de la corriente I. La distancia migrada será proporcional a la intensidad y al
tiempo. Con todo, el aumento de tensión (V)y el incremento correspondiente de intensidad

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(I) ocasionaría uno de los principales problemas que plantea la mayor parte de las formas de
electroforesis, a saber, la generación de calor. Este fenómeno queda ilustrado con la
siguiente ecuación, en la que la potencia (W, medida en vatios) generada durante la
electroforesis equivale al producto de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la
intensidad: W = I2R
Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforético se disipa en
forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales:
•aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el consiguiente
ensanchamiento de las muestras separadas
•formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las
muestras separadas.
•inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por ejemplo,
desnaturalización del ADN)
•disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia del medio.

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PROCEDIMIENTOS
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1. Tape los extremos de la bandeja con cinta aislante, colóquela en una superficie plana
y horizontal.
2. Prepare suficiente tampón TBE 0.5x (150 ml) para llenar el tanque electroforético.
Asegúrese que sea el mismo utilizado para preparar el gel.
3. Lleve la agarosa a ebullición; dejar enfriar a 60 °C; agregar el bromuro de etidio
(concentración final de 0.5 µg/ml), mezcle bien.

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4. Colocar el peine de 0.5 – 1.0 mm arriba del fondo de la bandeja y vierta la agarosa.
Dejar solidificar a temperatura ambiente. El gel debe tener de 3 a 5 mm de grosor.
5. Una vez solidificado retire la cinta aislante, sumergir el gel en el tanque electroforético
y retirar el peine.

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6. Agregue suficiente tampón TBE 0.5x para cubrir el gel aproximadamente 1mm.
7. Prepare la muestra de ADN a analizar agregándoles el buffer de cargada.
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8. Utilizando una micropipeta, aplique despacio en cada uno de los diferentes pocillos
del gel sumergido 10 µl de las muestras preparadas. En los extremos colocar los
marcadores de peso molecular y de concentración.
9. Tape el tanque electroforético y colocar los electrodos de manera que el ADN migre
hacia el ánodo (terminal roja). Aplique un voltaje de 1 – 5 v/cm. Para los minigeles se
aplican 100V por 30 minutos. El azul de bromofenol en la solución de cargada marca
el frente de la electroforesis.

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10. Desconecte la fuente de tención. Saque el gel de la bandeja y obsérvelo con el
transiluminador de UV. Use gafas protectoras. Fotografié el gel.

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DATOS
Investigue otros protocolos de electroforesis
Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. Análisis de proteínas
de hojas de Arabidopsisthaliana.
PROTOCOLO A REALIZAR
Preparación del gel de poliacrilamida
En la presente práctica se van a preparar mini-geles de 0,75 mm de espesor. Las cantidades
indicadas para la preparación de las soluciones en el anexo corresponden a la preparación
de dos geles. Cada uno de ellos consta de un gel concentrador de aproximadamente 2 cm
de longitud que contiene los pocillos para cargar las muestras, y un gel separador de
aproximadamente 6 cm. En la figura 4, se ilustra el montaje del sistema de electroforesis, la
preparación de los geles y el procedimiento a seguir.
1. Se prepara el sistema de electroforesis mini-gel.
2. Preparación del gel separador al 13%.
3. Se mezcla en un matraz (capacidad aproximada de 100 mL) los componentes con
cuidado, utilizando una pipeta Pasteur, se añade la mezcla en el interior del molde
hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma
que quede suficiente espacio para el gel concentrador (se debe calcular 1 cm más de
la longitud de los pocillos del peine)A continuación, usando una pipeta limpia, se
cubre la superficie del gel con isobutanol, isopropanol o agua destilada. Esto previene
el contacto del oxígeno con el gel que inhibe la reacción de polimerización. La
polimerización del gel debe de ocurrir en unos 30 minutos.
4. Preparación del gel concentrador al 3%.Se elimina el alcohol que cubre el gel
separador, y se lava la parte superior del gel 2-3 veces con agua destilada para
eliminar cualquier residuo de acrilamida no polimerizada. Se seca el líquido restante
en la parte de superior del gel con papel de filtro con cuidado de no dañar el gel.
Preparación de las muestras
En el tiempo de espera durante la polimerización se preparan las muestras que se van a
cargar en el gel. Con ayuda de una micropipeta P-20 se toman 20 µl de extracto proteico de
Arabidopsis preparado en tampón de carga (ver anexo) en un tubo eppendorf.
No se olvide preparar un tubo eppendorf con las proteínas estándar de peso molecular
conocido. Se fijan las tapas de los tubos y se calientan en un termobloque a 100ºC durante 5
minutos. Se centrifugan 15 segundos a máxima velocidad para concentrar el volumen en el
fondo del tubo.

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Electroforesis
1. Se insertan las placas con los geles polimerizados en la unidad de electroforesis Se
prepara el tampón de electroforesis a partir de la solución concentrada (ver anexo) y
se añade en los reservorios interior y exterior. Se retiran, si las hubiera, las burbujas
de aire y restos de acrilamida del interior de los pocillos, introduciendo tampón de
electroforesis en los mismos.3
2. Se aplican las muestras con ayuda de una micropipeta P-20 (hasta 20 µl) en los
pocillos, en un orden predeterminado y previamente. No se olvide añadir, en un carril,
la solución de proteínas estándar, de peso molecular conocido.
3. Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis y a la fuente de alimentación
y se aplica corriente eléctrica. La corriente eléctrica recomendada para geles de 0,75
mm de grosor es un voltaje constante de 100-200V.
4. La duración aproximada del proceso es de 40-45 minutos. Una vez acabada la
electroforesis, cuando el frente de azul de bromofenol alcanza la parte inferior del gel,
se desconecta la fuente de alimentación, retirándose los electrodos y sacando los
geles de la cubeta de electroforesis. Estos se depositan en la mesa de trabajo.
5. Se sacan los geles de acrilamida del interior del molde, separando cuidadosamente
con ayuda de una espátula ambos cristales Se elimina el gel concentrador y se hace
una muesca al gel en una de las esquinas para orientar la posición de las muestras
(por ejemplo en la esquina inferior contraria al patrón de proteínas).
6. Tinción del gel con azul de coomassie
Las bandas de proteínas, una vez terminada la electroforesis, se visualizan tiñendo
los geles con una solución de azul de coomasie. La tinción se realiza con agitación
suave durante, al menos, 30 min.7.
7. Se trasfiere el gel de la placa de vidrio a un recipiente que contiene la solución de
tinción de coomassie. Se deja el gel en agitación suave con suficiente volumen de
esta solución a temperatura ambiente durante 1 hora.
8. Se elimina la solución de tinción con una pipeta y se conserva para futuras tinciones.
9. Se añade solución decolorante y se incuba en agitación para eliminar el exceso de
coloración hasta que sólo queden teñidas de azul las proteínas, cambiando la
solución decolorante tantas veces como sea necesario. El gel puede estar en esta
solución toda la noche pero se pueden empezar a observar las proteínas en 20
minutos.
10. Se elimina la solución de desteñido y se añade agua destilada (o acético al 10%). Los
geles pueden conservarse de esta forma durante largos periodos de tiempo de forma
casi indefinida a 4ºC.

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¿Qué otras aplicaciones puede tener la electroforesis?
Las enormes aplicaciones de electroforesis son más evidentes en la industria de la salud o
médica, incluyendo los antibióticos y el análisis de la vacuna. El análisis de las proteínas y
ADN son también importantes aplicaciones de la electroforesis. Aparte de permitir a los
investigadores localizar y ver las diferencias en el código genético de las especies en la
tierra, el análisis de ADN electroforético también proporciona una herramienta fiable en
investigaciones forenses.
Explique la función del gel de agarosa en la electroforesis
La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y
las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y
masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución
tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente
.La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un
peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la
agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. La
agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de
agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separar las
moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kD. Los geles de agarosa
permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas
que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al
tamaño de los poros y no puede controlarse. Los geles de agarosa se obtienen por
suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la
mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en una solución transparente. A
continuación, se vierte esta solución en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura
ambiente hasta que se forma un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz
cuya densidad viene determinada por su concentración.
¿Para qué se utiliza la solución tampón TBE?
El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la
electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona
un poder más que suficiente y en la actualidad prácticamente toda las electroforesis en gel
de agarosa se practican utilizando esta concentración.

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BIBLIOGRAFIA
 http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3
n5.pdf
 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de
Rabanales.
Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. Análisis de proteínas de
hojas de Arabidopsisthaliana.
http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/16%20ELECTROFORESIS%20GELE
S%20PAA.pdf.
 http://www.ehowenespanol.com/lista-aplicaciones-electroforesis-sobre_117270/