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Conception et caractérisation d’un vaccin antitumoral à base de liposomes : Application à la vaccination contre le cancer du poumon Présenté par Gabrielle HEINIMANN Le 11 juillet 2011 Jury: Line BOUREL, Présidente Béatrice HEURTAULT, Directrice de thèse Benoît FRISCH, Membre extérieur Equipe de Biovectorologie UMR 7199

1) Le cancer du poumon ,[object Object],[object Object],[object Object],I- Introduction bibliographique ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],1

Forte toxicité des traitements Risque de rechute important Risque de métastases important Faible survie des patients Problème de santé publique qui nécessite de nouvelles perspectives de traitements Le cancer du poumon (2) I- Introduction 2

2) Nouvelle stratégie: la vaccination antitumorale ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],I- Introduction 3

3) Réponse immunitaire antitumorale I- Introduction 4 ,[object Object],[object Object],[object Object],Cytokines CD4 Lymphocytes T auxilliaires (helper) IFN-  TLR adjuvants -> maturation R Man : Récepteur du mannose R Man TLR : Toll-like Receptor MHC-I MHC-II Epitope Tc (peptide) Epitope Th (peptide) CD8 Cellule tumorale processing cellule présentatrice de l’antigène Lymphocytes T cytotoxiques Activation Prolifération Différenciation Cellule tumorale Destruction Cellulaire

4) La vaccination antitumorale - Mimer - Amplifier I- Introduction Vaccin liposomal ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],5

5) Constructions vaccinales ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],I- Introduction EL HAGE F., STROOBANT V., MAMI-CHOUAIB F. Preprocalcitonin signal peptide generates a cytotoxic T lymphocyte-defined tumor epitope processed by a proteasome-independent pathway, PNAS vol 105, No. 29 (juillet 2008) 10119-10124 6

[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],I- Introduction ,[object Object],7 5) Constructions vaccinales

5) Les liposomes ,[object Object],[object Object],[object Object],- Petites vésicules sphériques - 1 ou plusieurs bicouches phospholipidiques (PC, PG, Chol) I- Introduction 8

6) Association aux liposomes ,[object Object],I- Introduction DOGP 4 KMan 2 Agent de ciblage Pam 2 CAG Adjuvant 9

5) Association aux liposomes Addition de Mickaël à pH6,5 Peptide modifié : ,[object Object],I- Introduction 10 Ancre C VLLQAGSLHA VLLQAGSLHA Peptide CVL

Ancre DPG-Mal Pam 2 CAG DOGP 4 KMan 2 Peptide CVL Peptide HA PC/PG/Chol Mise au point Caractérisation des formulations 6) Construction vaccinale I- Introduction 11

PC, PG, Chol Man, Pam, DPG-Mal MLV 400-500nm Hydratation Evap. SUV <100nm Ultrasons Peptide ≠ eq/ancre Formulation vaccinale Dialyse - Préparation des liposomes: Hydratation de film lipidique - Couplage peptidique II- Matériel et méthodes Film lipidique 12 Tampon Chloroforme/méthanol (9/1)

[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],I- Matériel et méthodes Problématique: doser le peptide et caractériser les formulations 13

1) Dosage du peptide seul III- Résultats - Dosage au BCA : trop d’absorbance des liposomes blancs - Dosage au TNBS : volume de formulation nécessaire trop important - Dosage à la fluorescamine Droite dans une gamme de concentration qui nous intéresse Fluorescamine 14

2) Dosage du peptide sur les liposomes Droite dans la gamme de concentration qui nous intéresse Pas d’interférence par les LB Dosage à la fluorescamine du peptide CVL couplé aux liposomes est utilisable III- Résultats 15

2.a) Formulations avec le peptide CVL Tampon Hepes 10mM-NaCl 145mM III- Résultats 16 Nbre de formula-tions Diamètre moyen en nm PDI (indice de polydispersité) [CVL] moyenne en µmol/mL % Couplage CVL LB n=9 76 ± 24 0,261 / / Lp- CVL 1eq n=1 67 ± 23 0,234 0,115 49 Lp- CVL 2eq n=4 80 ± 21 0,214 0,229 93 Lp- man - CVL n=1 74 ±20 0,263 0,315 Quantitatif Lp- pam - CVL n=1 63 ± 12 0,296 0,28 Quantitatif Lp- pam - man - CVL n=1 84 ± 25 0,195 0,228 90

2.b) Formulations contenant le peptide HA Congélation : Pas d’incidence sur diamètre et distribution des liposomes 17 Nbre de formula-tions Diamètre moyen en nm PDI [HA] moyenne en µmol/mL % couplage HA % couplage peptides Tampon Lp- HA 0,5eq n=1 Aggloméra-tion / / / / Hepes-NaCl Lp- HA 0,5eq n=2 69 ± 19 0,267 0,08 66 / Hepes-Sorbitol Lp- CVL - HA n=3 70 ± 25 0,215 / / 94 Hepes-Sorbitol

Conclusion et perspectives Evaluation de l’efficacité des constructions vaccinales par mesure de production du TNFβ par des LT après incubation, avec des CD ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],Etudes in vitro en cours: 18

Remerciements ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]

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