1. Enzýmová metóda na jednoduché a
rýchle stanovenie glyfozátu v životnom
prostredí
Stredná odborná škola chemická, Vlčie hrdlo 50, 821 07 Bratislava
Členovia tímu: Denisa Lukáčová, Gyöngyi Posztósová
Vedúci tímu: Ing. Judita Dömötörová

2. Od poznania problému k jeho riešeniu
1
•Vieme o
probléme, ktorý
treba riešiť!
Pesticídy a
geneticky
modifikované
organizmy, to je
vážna téma.
2
•Študujeme
odbornú
literatúru. Ešteže
máme biochémiu
 Ako sa dá
stanoviť glyfozát?
Nie, s HPLC to
robiť nebudeme,
potrebujeme
jednoduchú
metódu!
3
•Plánujeme
postup.
Zisťujeme aké
prístroje,
pomôcky a
chemikálie
potrebujeme.
Objednávame
chemikálie.
4
•Realizujeme
stanovenie
glyfozátu vo
vzorke pôdy,
kukurice.
5
Pripravujeme
skúmavku s
imobilizovaným
enzýmom pre
terénne použitie.
2

3. Glyfozát
 Chemicky N-fosfonometyl glycín
 Herbicíd s veľmi nízkou toxicitou pre cicavce a
hmyz
 Používa sa na ničenie burín na
nepoľnohospodárskych plochách
 V poľnohospodárstve sa využíva na ošetrovanie
kultúr GMO plodín – kukurice a sóje
3

4. Objekt sledovania – glyfozát
 Mechanizmus účinku:
Zasahuje do syntézy aromatických
aminokyselín − fenylananínu, tyrozínu a
tryptofánu tak, že inhibuje enzým
5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntázu
(EPSPS), ktorý katalyzuje reakciu
4

5. Geneticky modifikované rastliny a
súvis s projektom
 Jeho aplikácia súvisí
s pestovaním geneticky
modifikovaných plodín –
hlavne kukurice a sóje
 Takto modifikované
rastliny majú v genetickej
výbave vnesený gén
z Escherichia coli, ktorý
zaručuje odolnosť voči
účinkom glyfozátu
5

6. Hrdinovia budúcnosti pomáhajú poľnohospodárom a
kontrolórom živ. prostredia
 PROBLÉM: Farmári potrebujú
odhadnúť množstvo zvyškov
glyfozátu v pôde, alebo
v ošetrených plodinách
 Nevhodná technika môže mať za
následok poškodenie nasledujúcich
plodín zvyškovým glyfozátom
 RIEŠENIE: Pripraviť pre farmárov a
poľnohospodárov jednoduchý test
na glyfozát – na terénne použitie
6

7. Stanovenie glyfozátu
 Používajú sa zložité prístrojové techniky
 Využitie biochémie a biotechnológie
ponúka riešenie – cez cielené
enzymatické reakcie
 NÁŠ CIEĽ: vývoj jednoduchého
enzymatického testu na stanovenie
glyfozátu v pôde a plodinách
 ČO OČAKÁVAME: zrýchlenie hodnotenia
zložiek životného prostredia, zníženie
zvyškov glyfozátu v pôde a plodinách 7

8. Postup práce – hlavné časti
1. Izolácia
enzýmu EPSP
syntázy z
rastlinného
materiálu
2. Imobilizácia
enzýmu
(nanesenie na
steny
polystyrénovej
skúmavky)
3. Extrakcia
glyfozátu zo
vzorky
(fosfátovým
pufrom)
4. Realizácia
enzymatického
testu glyfozátu
8

9. Postup práce
Vypestovanie rastlinného materiálu. Extrakcia
kyseliny šikimovej z rastlinného materiálu
Spektrofotometrické stanovenie kyseliny
šikimovej v supernatante
9
Rastlinný materiál + tekutý dusík + HCl,
centrifugácia, oddelenie supernatantu
Určenie koncentrácie, v akej je kys.
šikimová prítomná v rastlinách.
Modifikovaná metóda Gaitonde
a Gordona – vzorka, HIO4, NaOH a
glycín. Meria sa absorbancia pri 380
nm.

10. Postup práce – enzymatický test
glyfozátu v skúmavke
EPSP syntáza
imobilizovaný na
stenách skúmavky
Pridáme
kyselinu šikimovú a
fosfoenolpyruvát
Výsledok
•Pozitívny výsledok:
Ak glyfozát nie je prítomný,
kyselina šikimová sa
spotrebuje pri reakcii s
fosfoenolpyruvátom
•Negatívny výsledok:
Ak je glyfozát prítomný,
inhibuje enzým EPSP
syntázu, ktorý katalyzuje
reakciu kyseliny šikimovej s
fosfoenolpyruvátom.
Kyselina šikimová poskytuje
s chromogénom farebný
produkt (modrý).
Intenzita zafarbenia sa
vyhodnotí pomocou
farebnej stupnice.
10

11. Postup práce
11
1. Chemikálie a
pomôcky
2. Izolovaný enzým
Premývací tlmivý roztok
(fosfátový tlmivý roztok a tenzid TWEEN
Viazanie enzýmu na steny polystyrénových
skúmaviek
Fosfoenolpyruvát reaguje so šikimátom za vzniku
enzýmu EPSPS: Fosfoenolpyruvát + 3-fosfošikimát →
Fosfát + 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát
Dôkaz prítomnosti glyfozátu

12. 4. Kys. šikimová s
enzýmami
6. STOP roztok
5. TMB (chromogén)3. Extrakt glyfozátu
Extrakt z pôdy
(vzorka pôdy obohatená
glyfozátom, testovanie
vhodnosti techniky)

13. Glyfozát Kyselina šikimová Fosfoenolpyruvát Tetrametylbenzidín
Enzýmy NADH
Chrenová
peroxidáza Kyselina jodistá
Kyselina
chlorovodíková
Hydroxid sodný
Polystyrénová skúmavka
Spektrofotometer Analytické váhy
13
Chemikálie a pomôcky
Automatická pipeta

14. Na čo sme sa pri realizácii projektu
sústredili
Trvalo udržateľný rozvoj
Realizácia a uskutočniteľnosť
Vedecký základ
Hmatateľný produkt
Vplyv projektu na okolie
•Riešenie problému na lokálnej úrovni, v poľnohospodárskych
oblastiach (Žitný ostrov), ale aj nepoľnohospodárskych, keďže
glyfozát sa používa na ošetrovanie plôch na chodníkoch, krajniciach,
železniciach.
•Metóda na stanovenie glyfozátu bola úspešne otestovaná na vzorkách
kukurice.
•Projekt začal štúdiom odbornej literatúry.
•Článok od autora sme žiadali emailom (nemali sme vzdialený prístup
k článku).
•Stanovenie je založené na enzymatickej reakcii.
•Skúmavka s imobilizovaným enzýmom, ktorý je pripravený na terénne
použitie
•Realizácia analytickej metódy prispeje k šetrnej aplikácii pesticídu,
zníženiu zvyškov glyfozátu v pôde a v ošetrených plodinách a teda aj
k menšiemu obsahu v potravinovom reťazci.
14

15. V čom bol pre nás projekt užitočný
Zručnosti
pri
vyhľadávaní
informácií
Práca v tíme
Vedomosti
Hľadať
riešenia
uplatniteľné
v praxi
15

16. Skúmanie problému – literatúra
 I. Zelaya, J. A. H. Anderson, M. D. K. Owen, R. D. Landes: Evaluation of
spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in
plants: Models in Glyphosate-resistant and sisceptible crops, in: Journal of
agricultural and food chemistry, 2011
 B. K. Singh, D. L. Shaner: Rapid determination of glyphosate injury to plants
and identification of glyphosate-resistant plants, in: Weed technology, 1998
 G. Forlani, P. Kafarski, B. Lejczak, P. Wieczorek: Mode of action herbicidal
derivates of aminomethylenebisphosphonic acid, in: Journal of plant growth
regulation, 1997
16

17. Poďakovanie
 Ďakujeme spolužiačkam zo štvrtého ročníka, Veronike Labudovej a Kataríne
Adamkovičovej, ktoré s nami spolupracovali, ale vzhľadom na to, že už majú
19 rokov sa súťaže nemohli oficiálne zúčastniť.
17

18. Ďakujeme za pozornosť!
18