3. Biochemie
Proteïne................................................................................................................................................................ 7
Hierarchie der Zellkomponenten.................................................................................................................................. 7
Allgemeiner Aufbau der Proteïne................................................................................................................................. 7
Analyse der Raumstruktur von Proteïnen...................................................................................................................7
Die 20 Aminosäuren...................................................................................................................................................... 8
Struktur der Proteïne..................................................................................................................................................... 9
Analyse von Proteïngemischen................................................................................................................................. 11
Nachweis mit Ninhydrin.............................................................................................................................................. 15
Bestimmung der Aminosäuresequenz......................................................................................................................15
Zuordnung der Disulfidbrücken................................................................................................................................. 20
Enzyme / Coënzyme.......................................................................................................................................... 21
Enzyme......................................................................................................................................................................... 21
Coënzyme und prosthetische Gruppen.................................................................................................................... 27
Hämoglobin / Myoglobin............................................................................................................................................. 32
Chemische Modifizierung von Proteïnen........................................................................................................ 35
Zweck:.......................................................................................................................................................................... 35
Unspezifische Reagenzien......................................................................................................................................... 36
Gruppenspezifische Reagenzien............................................................................................................................... 36
Reagenzien zur Änderung der Ladung...................................................................................................................... 37
Hydrophobisierung von Enzymen.............................................................................................................................38
Reversible Reagenzien............................................................................................................................................... 38
Active-Site Labeling.................................................................................................................................................... 38
Suizid-Substrate.......................................................................................................................................................... 38
Photoaffinity-Label...................................................................................................................................................... 39
Bifunktionelle Reagenziën.......................................................................................................................................... 39
Semireversible Reagenzien........................................................................................................................................ 40
Trägergebundene Enzyme.......................................................................................................................................... 40
Lipide.................................................................................................................................................................. 43
Allgemeine Übersicht.................................................................................................................................................. 43
Fette.............................................................................................................................................................................. 43
Glycolipide................................................................................................................................................................... 43
Phospholipide.............................................................................................................................................................. 44
Isoprenoidlipide........................................................................................................................................................... 44
Biomembranen............................................................................................................................................................ 45
Monosaccharide................................................................................................................................................ 47
Nomenklatur................................................................................................................................................................. 47
Zyklische Zucker......................................................................................................................................................... 48
Nucleotide.................................................................................................................................................................... 48
Stoffwechsel....................................................................................................................................................... 49
Unterscheidung der Lebewesen................................................................................................................................ 49
Kohlenstoff-Stoffwechsel................................................................................................................................. 51
Glycogen...................................................................................................................................................................... 51
Glycolyse...................................................................................................................................................................... 52
Oxidative Decarboxylierung....................................................................................................................................... 56
Hormonelle Steuerung................................................................................................................................................ 57
Gluconeogenese.......................................................................................................................................................... 60
Der Citratzyklus........................................................................................................................................................... 61
Oxidative Phosphorylierung und Atmung................................................................................................................ 62
Der Pentosephosphatweg.......................................................................................................................................... 65
Der Fettsäurestoffwechsel................................................................................................................................ 69
Fettsäureabbau............................................................................................................................................................ 69
Ketonkörper entstehen bei vorherrschendem Fettabbau.......................................................................................71
Fettsäure-Synthese..................................................................................................................................................... 71
Aminosäureabbau und Harnstoffzyklus.......................................................................................................... 73
Transaminierung......................................................................................................................................................... 73
Oxidative Desaminierung........................................................................................................................................... 73
Der Harnstoffzyklus..................................................................................................................................................... 74
Biosynthese von Makromolekülen................................................................................................................... 75
Tetrahydrofolat als C1-Überträger............................................................................................................................. 75
Zyklus der aktivierten Methylgruppe......................................................................................................................... 75
Purin-Biosynthese....................................................................................................................................................... 76
-4-
4. Biochemie
Pyrimidinbiosynthese................................................................................................................................................. 78
Abbau der Purine......................................................................................................................................................... 78
NAD-Biosynthese........................................................................................................................................................ 79
Synthese von Sphingolipiden und Gangliosiden.....................................................................................................79
Biosynthese von Phospholipiden.............................................................................................................................. 80
Cholesterin-Synthese.................................................................................................................................................. 80
Photosynthese................................................................................................................................................... 83
Lichtreaktion................................................................................................................................................................ 83
Dunkelreaktion............................................................................................................................................................. 85
Anhang............................................................................................................................................................... 87
Abbildungsverzeichnis............................................................................................................................................... 87
Formelverzeichnis....................................................................................................................................................... 90
Gleichungsverzeichnis............................................................................................................................................... 94
Tabellenverzeichnis.................................................................................................................................................... 95
-5-
5. Biochemie
Proteïne
Hierarchie der Zellkomponenten
• Zelle
• Organellen z.B. Mitochondrien, Chloroplasten, Zellkern
• Supramolekulare Strukturen Multiënzymkomplexe, Ribosomen, kontraktile Systeme
• Makromoleküle Nucleïnsäuren, Proteïne, Polysaccharide, Lipide
• Bildungsblöcke Nucleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Glycerol und Fettsäuren
• metabolische Zwischenprodukte Pyruvat, Citrat, Malat
• Vorstufen aus de Umwelt CO2, N2, NH3, H2O
Allgemeiner Aufbau der Proteïne
Proteïne sind Heteropolymere der Aminosäuren (d.h. aus verschiedenen Molekülen zusammengesetzt).
Ein weiterer wichtiger Typ kovalenter Bindungen in Proteïnen sind die Disulfidbrücken zwischen Cysteïnhälften
(cross linkage). Die Bindungen können von Proteasen hydrolysiert werden.
Abbildung 1 : Allgemeiner Aufbau der Proteïne
Nomenklatur:
Außer beim Glycin ist das α-C-Atom asymmetrisch substituiert, es tritt daher optische Aktivität auf.
Man unterscheidet 2 sterische Reihen, die L- und die D-Reihe, sowie zweierlei Konfigurationszuweisungen, die S- und
die R-Konfiguration. Nur L-Aminosäuren, die fast alle (Ausnahme L-Cysteïn) S-Konfiguration besitzen, sind Bausteine
der Proteïne.
Formel 1 : Sterischer Unterschiede der Aminosäuren
Der optische Drehungssinn ist unabhängig von der Zugehörigkeit zu einer sterischen Reihe.
Analyse der Raumstruktur von Proteïnen
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie: (NMR = Kernmagnetische Resonanz)
Das Proteïn wird in ein magnetisches Feld gebracht und die unterschiedliche Resonanz der Atomkerne gemessen.
Vorteil: Es ergibt sich ein 3D-Bild, welches sich aus der Summe von Einzelmolekülen in Lösung ergibt.
Röntgenstrukturanalyse eines Kristalls der Verbindung
Bestrahlung des Moleküls mit Röntgenstrahlen, wobei die Strahlen bei unterschiedlicher Elektronendichteverteilung
unterschiedlich gebeugt werden. Durch die Mobilität ergeben sich allerdings Unschärfen im Kristall. Die Struktur des
Myoglobins (ähnlich dem Hämoglobin) wurde durch diese Methode aufgeklärt.
Vorteil: Auflösungsgrenze = 0,15 nm (bzw. 0,2 - 0,35 nm) (beim LM: » 400 nm)
Nachteil: eingeschränkte Dynamik
-7-
7. Biochemie
Struktur der Proteïne
Primärstruktur
Die Aminosäuresequenz in der Polypeptidkette.
Formel 6 : Aminosäuresequenz in der Polypeptidkette
Sekundärstruktur
Bei der α-Helixstruktur sind Wasserstoffbrücken intramolekular zwischen der NH- und der 4 AS1-Reste entfernten CO-
Gruppe ausgebildet.
Dadurch entsteht die schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren.
Abbildung 3 : Schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren (α-Helix-Struktur)
Ganghöhe (pitch): Länge, die die α-Helix bei voller Drehung zunimmt. Eine Aminosäure bringt eine Drehung von 100°,
daher nach 3,6 AS eine volle Umdrehung.
Bei der β-Faltblattstruktur kommt es zu einer zur Kettenrichtung senkrechten Ausbildung der H-Brücken (bei α-Helix:
parallel zur Helixachse) zwischen verschiedenen Polypeptidketten oder gefalteten Kettenteilen.
Seide
- reine Faltblattstruktur (fast nur Gly, Ser, Ala)
- an jeder 2. Position Gly
- Ketten parallel zur Faserachse
Kollagen
- häufigstes Proteïn in Wirbeltieren (Haut, Knochen, Knorpel)
- spezielle Helixstruktur
- mechanisch stark beanspruchbar
- denaturiertes Kollagen » Gelatine
Tertiärstruktur
3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur. Stabilisierung durch Disulfidbrücken:
Abbildung 4 : Tertiärstruktur (3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur)
1
Aminosäuren
-9-
8. Biochemie
Disulfidbrücken
Besonders wichtig bei kleinen Polypeptiden (s. Anfinsen-Experiment), da Struktur stabilisierend (Insulin,
Chymotrypsin, Trypsin, α-Keratin (Haar))
Wasserstoffbrücken
Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen schwach acidem Donor und schwach basischem Akzeptor im Inneren des
Proteïns:
a) zwischen Peptidbindungen (α-Helix, β-Faltblatt)
b) zwischen Seitenketten der einzelnen AS
und an der Oberfläche mit Wasser. Wechselwirkung mit Wasser ist energetisch günstiger.
Ionische Wechselwirkungen
Relativ geringe Bedeutung für die Struktur, da meist an Enzymoberfläche
→ hauptsächlich Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel
Hydrophobe Wechselwirkungen
AS mit unpolaren Seitenketten: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro
- Versuch den Kontakt mit H2O zu vermeiden
- intramolekulare Gruppierung / Ausschluss von H2O
- hydrophobe AS innen, hydrophile außen (dadurch gute H2O-Löslichkeit)
Anfinsen-Experiment
Untersuchung der Gründe für die Ausbildung einer Tertiärstruktur globulärer Proteïne.
Ausgangsmaterial: RNAse: 124 AS, 4 S-S-Brücken
Denaturierung in 8 M Harnstoff und Reduktionsmittel → Spaltung der Disulfidbrücken
1. Erst oxidiert und dann Harnstoff entfernt → falsche zufällige Renaturierung (keine Enzymaktivität)
2. Erst Entfernung des Harnstoffs (partielle Renaturierung) → richtige Faltung und richtige Disulfidbrücken
(Enzymaktivität)
Ergebnis: Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer Proteïne.
Abbildung 5 : Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer Proteïne
Domänen
Proteïne bestehen oft aus mehreren Faltungseinheiten, die als Domänen bezeichnet werden.
-10-
9. Biochemie
Abbildung 6 : Domänen bei Proteïnen
Quartärstruktur
Anlagerung mehrerer Polypeptidketten (Untereinheiten) aneinander
→ polymere Proteïne
Bindungen wie bei der Tertiärstruktur.
z. B. Virenhüllen, Hämoglobin, Multiënzymkomplexe
Abbildung 7 : Anlagerung mehrerer Polypeptidketten aneinander (Quartärstruktur)
Analyse von Proteïngemischen
Probleme:
- Vorkommen oft in sehr kleinen Mengen (1 % vom Trockengewicht, Peptidhormone wie z. B. Insulin in noch
kleineren Mengen)
- Stabilität: labil gegen pH (Bsp.: LDH dissoziiert bei pH < 6 → Denaturierung)
- Temperatur: kältelabil (z.B. F1-ATPase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase einiger Spezies),
wärmelabil: die meisten Enzyme
Um Substanzgemische aufzutrennen, kann man 5 Eigenschaften der Moleküle benutzen:
1. Molekülgröße
2. Elektrische Ladung
3. Absorptionsverhalten
4. Löslichkeit
5. Affinität
Chromatographie
Physikalisch-chemisches Verfahren zur analytischen und präparativen Trennung gelöster oder gasförmiger
Verbindungen.
Die chromatographische Trennung beruht darauf, dass eine mobile Phase über eine stationäre Phase wandert und dabei
die zu trennende Substanz mit unterschiedlicher Geschwindigkeit transportiert.
-11-
10. Biochemie
An der stationären Phase, dem Trägermaterial (z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Stärke, Zellulose, Silikonöl,
Ionenaustauschern) tritt eine unterschiedliche Verteilung der zu trennenden Substanzen mit der mobilen Phase (meist
organische Lösungsmittel) auf.
HPLC: (High Pressure Liquid Chromatography)
Säulenchromatographie unter hohem Druck. Dadurch kann ein feineres Trennmaterial verwendet werden, bei dem die
Durchlaufzeit ohne Druck zu hoch wäre.
Molekülgröße
Zentrifugation (differentielle bzw. fraktionierte Zentrifugation)
Voraussetzung: Molekulargewichtsunterschiede.
Der Faktor S entspricht dabei der Sedimentationskonstante, ist also ein Maß für das Gewicht (ist aber auch abhängig
von der Form der Moleküle).
Ultrazentrifugation (Dichtezentrifugation)
Sedimentierung der Proteïne durch extreme Zentrifugation (bis 300.000 g). Träger: Suchrosegradient
Dialyse
Durch Osmose werden mit Hilfe einer semipermeablen Membran kleine Moleküle aus der Lösung entfernt. Zurück
bleiben nur die großen Moleküle (z.B. Proteïne).
Ultrafiltration
Durch Druck oder Zentrifugationskraft werden kleine Moleküle und Wasser durch eine semipermeable Membran
gepresst.
Gelfiltration (Gelchromatographie)
Das Substanzgemisch läuft über eine Säule aus stark hydratisiertem, polymeren Material wie z. B. Sephadex
(Polysaccharid-Derivat), BioGel (Polyacrylamid-Derivat) oder Agarose (Polysaccharid).
Die Gelpartikel werden mit verschieden großen Poren hergestellt.
Die Substanzen mit unterschiedlicher Größe dringen mit unterschiedlichem Maße in die Gelpartikel ein. Große
Substanzen laufen daher schneller durch die Säule als kleine Substanzen.
Abbildung 8 : Gelfiltration (Gelchromatographie)
Elektrische Ladung
Ionenaustauschchromatographie (Ionenaustauscher)
Das in der Säule befindliche Trägermaterial ist in der Lage, einen Teil der an austauschaktiven Gruppen gebundenen
Ionen gegen andere Ionen reversibel zu tauschen.
Trägermaterial
● Sulfoniertes Polystyrol
● Polyacrylamid
● Zellulose
● andere Zucker (Dextrane ≡ „Sephadex“)
Kationenaustauscher
CM (Carboxymethyl / schwach sauer): R-CH2-COO-
Sulfonyl: RSO3H + NaCl → RSO3Na + HCl
-12-
11. Biochemie
Anionenaustauscher
DEAE (Diethylaminoethyl / schwach basisch):
R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+OH- + NaCl → R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+Cl- + NaOH
Das im Austauscher verbleibende Substanzion kann durch Elution (Lösen) mit geeigneten Ionen, je nach
Dissoziationskonstante, abgelöst werden (z. B. durch pH-Gradiënten / Ionenstärkegradiënten).
Elektrophorese
Bewegung elektrisch geladener Teilchen im elektrischen Feld. Die negativ geladenen Teilchen wandern dabei zur
Anode und die positiv geladenen zur Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt vom Verhältnis Masse/Ladung ab.
Hochspannungs-Trägermaterial
1. Papier
2. Kieselgelplatte
Niederspannungs-Trägermaterial
1. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
2. Zelluloseacetat-Folien
Isoelektrische Fokussierung
Durch den isoelektrischen Punkt (IEP) lassen sich Proteïngemische auftrennen (s.a. isoelektrische Fällung). In
Verbindung mit einer Elektrophorese wandern die Proteïne im elektrischen Feld. Dabei ist der pH-Gradiënt im Gel von
Bedeutung: Die Proteïne wandern bis zu der Stelle, wo der pH-Wert ihrem IEP entspricht. Da sie an diesem Punkt keine
Ladung mehr tragen, können sie nicht weiterwandern.
Absorptionsverhalten
Adsorptionschromatographie
Die Trennung erfolgt über eine Säule, auf die die Substanzmenge gegeben wird. Der obere Teil der Säule adsorbiert nun
die Substanzmenge. Durch Zugabe von Lösungsmittel wird die Substanz wieder gelöst und fließt in der Säule ein kleines
Stück weiter, bis sie erneut adsorbiert wird. Dieser Vorgang wiederholt sich kontinuierlich, wodurch es durch die
unterschiedlichen Adsorptionsverhalten der verschiedenen Stoffe zu einer klaren Trennung der Substanzmenge kommt.
Durch die Zugabe entsprechender Mengen an Lösungsmittel können die einzelnen Fraktionen des Eluats in einem
Fraktionssammler entnommen werden.
Löslichkeit
Aussalzen
z. B. Fällung (fraktioniert) mit Ammoniumsulfat (bis 3 M löslich in Wasser)
● zunächst Anstieg der Löslichkeit des Proteïns bei Zugabe von Salz → Einsalz-Effekt
● bei hoher Salzkonzentration → Aussalz-Effekt (Lösungsmittel reicht nicht mehr aus, Proteïne fallen
nacheinander aus und werden abzentrifugiert)
Fällung
Aceton-Fällung und Ethanol-Fällung; durch niedrige Diëlektrizitätskonstante wird die Solvatationskraft des Wassers
herabgesetzt, die Proteïne fallen aus.
Aber: Fällung normalerweise bei niedrigen Temperaturen → Limitierung bei kältelabilen Proteïnen
Isoelektrische Fällung
Am isoelektrischen Punkt (IEP) ist die Zahl der positiven Ladungen im Proteïn gleich der Zahl der negativen Ladungen.
Bei diesem pH-Wert ist die Löslichkeit des Proteïns minimal. Durch die Veränderung des pH-Wertes können Proteïne mit
unterschiedlicher Ladungsverteilung nacheinander abgetrennt werden.
Verteilungschromatographie
Wie bei der Adsorptionschromatographie wird auch hier in einer Säule gearbeitet. Als Adsorptionsmittel dienen
Kieselgur, Zellulosepulver, Stärke oder Glaspulver, die mit Wasser befeuchtet werden.
-13-
12. Biochemie
Das zu trennende Substanzgemisch wird gelöst und auf die Säule gegeben. Mit einem organischen Lösungsmittel wird
das Substanzgemisch langsam durch die Säule gespült. Eine Trennwirkung kommt dabei nicht durch die Adsorption der
Substanzen an dem Trägermaterial zustande, sondern durch das Eindringen der Stoffe in den Wasserfilm auf der
Oberfläche des Trägers. Dabei verteilen sich die Substanzen zu einem bestimmten Verhältnis in den beiden Phasen.
Substanzen, die in organischen Lösungsmitteln leichter löslich sind als in Wasser, wandern schneller durch die Säule als
leicht wasserlösliche Substanzen.
Gaschromatographie
Das Substanzgemisch wird verdampft und mit einem inerten Trägergas (Helium, Argon oder Stickstoff) durch ein
langes, dünnes Rohr geleitet. Die einzelnen Komponenten des Gasgemisches lösen sich mehr oder weniger gut in der
stationären Phase (Flüssigkeitsfilm auf der Innenseite des Rohrs) und können somit am Ende der Säule nach kürzerer oder
längerer Strömungszeit nachgewiesen werden.
Papierchromatographie
Sie ist eine Verteilungschromatographie, die Trennwirkung beruht auf unterschiedlicher Löslichkeit der Substanzmenge
in dem Lösungsmittel.
Das Lösungsmittel-Substanzgemisch steigt durch Kapillarkräfte auf. Während des Vorgangs kommt es zur Bildung
zweier Laufmittelphasen (eine hydrophile und eine hydrophobe Schicht). Durch die Wechselwirkung zwischen
hydrophilem Trägermaterial und hydrophilem Laufmittel wandert der hydrophobe Teil des Substanzgemisches schneller
und weiter hinauf.
Als stationäre Phase dient dabei mit Wasser getränktes Filterpapier. Die Auftrennung (Entwicklung) erfolgt in einer gut
verschlossenen Chromatographieapparatur.
Dünnschichtchromatographie
Als Trennschicht verwendet man oft Kieselgel, Kieselgur und Aluminiumoxid, das mit Wasser unter Zusatz von Gips
als dünnflüssige Suspension auf eine rechteckige Glas- oder Kunststoffplatte aufgetragen wird. Die Auftrennung
(Entwicklung) erfolgt in einer gut verschlossenen Chromatographieapparatur.
Das Trennverfahren läuft wie bei der Papierchromatographie ab, jedoch sind die Zeitersparnis und eine empfindlichere
Auftrennung Vorteile der Dünnschichtchromatographie.
Bei der 2D-Dünnschichtchromatographie wird nach Abschluss des ersten Laufes (a.) die Platte um 90° gedreht und ein
zweiter Lauf (b.) in einem anderen Fließmittel durchgeführt.
Abbildung 9 : Eindimensionale DC (links) und 2D-DC (rechts)
Affinität
Affinitätschromatographie:
Die Proteïne können gezielt aus einem Proteïngemisch isoliert werden. Das Prinzip basiert auf der Fähigkeit der
Proteïne, bestimmte Moleküle (Liganden) spezifisch zu binden. Dabei dient als Säulenmaterial z.B. das Polysaccharid
Agarose, an dessen Oberfläche die Liganden chemisch gebunden werden. Wird die Proteïnmischung nun auf die Säule
gegeben, so bleibt nur das dem Liganden entsprechende Proteïn hängen, der Rest fließt nach Zugabe von Pufferlösung
durch die Säule hindurch. Das gewünschte Proteïn kann dann durch Zugabe einer hohen Konzentration des Liganden in
löslicher Form von dem Trägermaterial eluiert werden. Dadurch besteht mit dieser Methode die Möglichkeit, bestimmte
Proteïne extrem hoch zu reinigen.
-14-
13. Biochemie
Abbildung 10 : Prinzip der Affinitätschromatographie
Gruppenspezifische Affinitätschromatographie
z.B. AMP-Säulen zur Reinigung von NAD-abhängigen Proteïnen
Hochspezifische Affinitätschromatographie
z.B. Reinigung von Antikörpern, Substratsäulen
Nachweis mit Ninhydrin
Formel 7 : Aminosäurenachweis mit Ninhydrin
Bestimmung der Aminosäuresequenz
Erste vollständige AS-Sequenz 1953 am Rinder-Insulin durch Frederick Sanger.
Warum ist das Wissen über die AS-Sequenz wichtig?
● Aufklärung der Kristallstruktur
● Verständnis molekularer Mechanismen
● Vergleich anderer Proteïne → Hinweise auf Funktion / evolutionäre Zusammenhänge
Versuchsplan
1. Bruttozusammensetzung der AS (Aminosäureanalyse)
2. Bestimmung der Endgruppen (Hinweis auf verschiedene Polypeptidketten)
3. Trennung in Einzelketten
4. Spaltung der Polypeptidketten in kleine Fragmente
5. Sequenzierung der kleinen Fragmente
6. Wiederholung von 4. unter Bildung anderer Fragmente → Überlappungsfragmente
-15-
14. Biochemie
7. Zuordnung der Disulfid-Gruppen innerhalb oder zwischen Untereinheiten
Aminosäureanalyse
Zur Analyse wird eine Totalhydrolyse unter sauren und/oder basischen Bedingungen durchgeführt.
Sauer
Erhitzen der Polypeptide in Gegenwart eines Überschusses an 6 N HCl bei 100 – 120 °C für 10 – 100 Stunden in einem
evakuierten, unter Vakuum zugeschmolzenen Röhrchen ist die normale Methode der Totalhydrolyse. Unter diesen
Bedingungen findet keine Razemisierung und keine O 2-Oxidation statt. Für die Freisetzung von Val, Leu, Ile sind lange
Zeiten erforderlich.
Nachteil:
- teilweise Zerstörung von Ser, Thr, Tyr
- weitgehende Zerstörung von Trp
- aus den Amid-Gruppen von Asn und Gln entstehen Carboxylgruppen und Ammoniumionen, die in die Messung
von Glu und Asp mit eingehen
Basisch
Durch Kochen der Peptide in 2 – 4 M NaOH bei 100 °C für 4 – 8 h kann Trp getrennt bestimmt werden.
Nachteil:
- Zerstörung von Cys, Ser, Thr, Arg
- andere AS werden teilweise desaminiert und racemisiert
Vorteil:
- liefert die Trp-Werte
Endgruppenbestimmung
Die Endgruppen geben Hinweise auf unterschiedliche Polypeptidketten. So besteht z.B. Insulin aus 2 AS-Ketten, die
über 2 Disulfidbrücken verbunden sind. Es ergeben sich also 2 Aminosäuren vom C-Terminus und 2 vom N-Terminus.
N-Terminus
Prinzipien:
Sanger / Dansylierung
Abbildung 11 : Sanger / Dansylierung
a) AS-Kette
b) Markierung
c) Hydrolyse → einzelne AS
Edman-Abbau
a) AS-Kette, Markierung, Hydrolyse → AS-Kette + 1 AS
b) Erneuter Ablauf
Abbildung 12 : Edman-Abbau
-16-
15. Biochemie
Sanger-Reaktion (1945)
Formel 8 : Sanger-Reaktion
Reaktion der freien α-Aminogruppe der Proteïne mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) unter Bildung von gelben 2,4-
Dinitrophenyl-Derivaten.
Durch die Hydrolyse der so entstandenen Peptide mit 6 N HCl werden alle Peptidbindungen gespalten. Es bleibt also
als einzige farbige Verbindung das 2,4-Dinitrophenyl-Derivat mit der N-terminalen Aminosäure übrig, welches abgetrennt
und durch chromatographischen Vergleich (2D-Dünnschichtchromatographie) mit bekannten 2,4-Dinitrophenyl-Derivaten
der einzelnen AS identifiziert werden kann.
Problem: Nukleophile AS-Seitenketten können ebenfalls reagieren.
Dansylierung
Formel 9 : Dansylierung
Statt dem DNFB wird Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) als Markierungsreagenz
verwendet. Nach der Hydrolyse können die Dansyl-Derivate durch deren fluoreszierenden Charakter bestimmt werden.
Diese Methode ist 100 mal empfindlicher als die Methode von Sanger.
Edman-Abbau
Formel 10 : Edman-Abbau
Großer Vorteil des Edman-Abbaus: Der Rest der AS-Kette bleibt nach der Abtrennung der terminalen AS intakt und
kann daher weiter untersucht werden. Somit kann das Proteïn Schritt für Schritt abgebaut werden. Das entstandene
Phenylthiohydantoin (PTH) wird über die Gas-Chromatographie (oder HPLC) getrennt und bestimmt.
Dieser Vorteil wurde benutzt, um einen „Sequenator“ (Solid-Phase) zu bauen. Dieses Gerät führt die AS-Bestimmung
automatisch durch und bestimmt die entstehenden PTH-Derivate im Anschluss durch Chromatographie.
-17-
16. Biochemie
C-Terminus
Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion)
Formel 11 : Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion)
Alle Peptidbindungen werden durch Umwandlung der AS in Hydrazide gespalten. Es liegen daher nur noch
Aminosäure-Hydrazide vor. Einzige Ausnahme dazu ist die AS des C-terminalen Endes der ursprünglichen Proteïnkette.
Sie besitzt als einzige noch eine Carboxylgruppe und kann als freie Säure leicht chromatographisch identifiziert werden.
Reduktion
der AS durch Lithiumborhydrid zum entsprechenden α-Aminoalkohol. Nach der Hydrolyse kann dieser Alkohol
chromatographisch identifiziert werden.
Abspaltung der C-terminalen AS
durch Carboxypeptidase (eine Exopeptidase). Nachteil: das Enzym spaltet schnell die nächste AS ab.
Trennung in Einzelketten (falls erforderlich)
a) Entfaltung der AS-Kette durch Harnstoff → Aufhebung der Tertiär- und Quartärstruktur.
b) Spaltung der S-S-Bindungen durch
- Reduktion (z. B. NaBH4)
- Umsetzung mit Jodacetat: Bildung von stabilen Derivaten (Carboxymethylcysteïn)
R - SH + I - CH2 - COOH → R - S - CH2 - COOH + HI
Formel 12 : Trennung mit Iodessigsäure
Spaltung in Fragmente (Partialhydrolyse)
Zur späteren Identifizierung der Fragmente ist es wichtig, spezifische Spaltstellen zu erhalten.
a) Bromcyan-Spaltung
Spaltung der Peptidbindungen an denen ein Methionin beteiligt ist.
Formel 13 : Bromcyan-Spaltung
b) Enzymatische Spaltung durch Proteasen (Hydrolyse der Peptidbindungen)
Peptidasen (= Exopeptidasen) spalten AS vom Ende ab
1. Carboxypeptidase (C-Terminus)
2. Aminopeptidase (N-Terminus)
Proteïnasen (= Endopeptidasen) spalten an spezifischer Spaltstelle innerhalb der AS-Kette
spaltet am C-terminalen Ende von
Trypsin Lys, Arg
Chymotrypsin Phe, Trp, Tyr
Pepsin Phe, Trp, Tyr und verschiedene andere
Tabelle 1 : Proteïnasen und ihre „Spaltstellen”
-18-
17. Biochemie
Thermolysin spaltet am N-terminalen Ende von Leu, Ile, Val Viele Proteasen werden als inaktive Vorstufen
(Zymogene, Proënzyme) sezerniert und dann proteolytisch aktiviert.
Beispiele:
● Bildung von Chymotrypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Chymotrypsin im Dünndarm
durch Spaltung einer Arg-Ile-Bindung mittels Trypsin.
● Bildung von Trypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Trypsin im Darm durch
Enteropeptidase oder Trypsin selbst (autokatalytische Aktivierung).
Sequenzierung der Fragmente
a) chemisch:
● Edman-Abbau
b) physikalisch:
● FAB (fast atom bombardment)
- Variante der Massenspektroskopie, bis 25 AS
- bombardiert in Glycerol gelöste Peptide mit Ar- oder Xe-Atomen.
- Fragmentieren in verschieden große Teilstücke
- Vergleich zwischen Massen und Fragmenten → Sequenz
Vorteil:
- mehrere Peptide (Gemisch, Verunreinigungen) möglich
- Untersuchung posttranslational veränderter Proteïne (z.B. blockierter N-Terminus)
- sehr hohe Empfindlichkeit
Nachteil:
- hohe Gerätekosten
c) enzymatisch:
● Exopeptidasen
Überlappungsfragmente
Durch die Bildung weiterer, mit den bisherigen überlappender Fragmente kann auf die Sequenz des ganzen Proteïns
zurückgeschlossen werden. Um andere Fragmente zu erhalten, wird die Spezifität der entsprechenden Enzyme geändert.
Dadurch kommt es zu einer anderen Spaltung und zu anderen Überlappungsfragmenten.
Spaltung am Beispiel von Trypsin
a) normale Spaltstellen: Spaltung nach Lys und Arg
b) weniger Spaltstellen: Blockierung von Lys → nur noch Spaltung bei Arg
● Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid:
Formel 14 : Spaltung von Tripsin mit Bernsteinsäureanhydrid
● Reaktion mit Iodessigsäure:
Lys - ( CH2 ) 4 - NH2 + I - CH2 COOH → Lys - ( CH2 ) 4 - NH - CH2 − COOH + HI
Formel 15 : Spaltung von Tripsin mit Iodessigsäure
c) mehr Spaltstellen:
● Umwandlung von Cysteïn in Pseudolysin, dadurch Spaltung nach Cysteïn, Lys und Arg:
-19-
18. Biochemie
Formel 16 : Umwandlung von Cysteïn in Pseudolysin
Zuordnung der Disulfidbrücken
1. Carboxylierung der SH-Gruppen (mit Iodessigsäure)
2. Tryptische Verdauung ohne Reduktion der S-S-Brücken
3. Isolierung der vernetzten Peptide
4. Reduktion der S-S-Brücken (NaBH4 / pH 3)
5. Trennung der Oligopeptidketten in Gegenwart von Mercaptoethanol (Schutz der freien SH-Gruppen)
6. Sequenzierung der Einzelketten
→ Carboxymethylierte Cysteïne = frühere freie SH-Gruppen
→ freie SH-Gruppen = frühere S-S-Brücken
-20-
19. Biochemie
Enzyme / Coënzyme
Enzyme
Wirkungsweise von Enzymen
Enzyme sind meist Proteïne (seltener Ribonucleïnsäuren).
● Wirken als Katalysator
● Verändern nicht die Lage des Gleichgewichts
● Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G
● Ermöglichen milde Reaktionsbedingungen
● Fähigkeit zur Regulation
● Große Reaktionsspezifität
Abbildung 13 : Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G
Die Bindung der Substrate erfolgt am aktiven Zentrum durch
● ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen
● kovalente Zwischenstufen
Abbildung 14 : Bindung der Substrate am aktiven Zentrum
Isoënzyme
Enzyme gleicher Funktion, die sich aber in ihrer Struktur und infolgedessen in manchen Eigenschaften voneinander
unterscheiden.
Lactat-Dehydrogenase
Tetramer aus 4 identischen Untereinheiten pro „Typ“.
Der H-Typ dominiert im Herzmuskel, der M-Typ im Skelettmuskel und in der Leber. Diese Untereinheiten setzen sich
zu verschiedenen Tetrameren (multiplen Formen) zusammen:
H4, H3M, H2M2, HM3, M4
Der H4-Typ besitzt eine höhere Affinität zu Pyruvat als der M 4-Typ. Deshalb wird der H 4-Typ durch hohe
Pyruvatkonzentrationen gehemmt (Substrathemmung).
Diese homologen Enzyme sind durch Genduplikation entstanden:
LDH-H4 (Mensch) — LDH-H4 (Schwein): höhere Homologie als: LDH-H4 (Mensch) — LDH-M4 (Mensch)
-21-
20. Biochemie
Unterschiede bei Chymotrypsin und Trypsin
Substratbindungszentrum
Chymotrypsin benötigt eine aromatische oder eine sperrige unpolare Seitenkette auf der Aminoseite der abzuspaltenden
Peptidkette.
Die Nische (eine unpolare Tasche) ist dagegen bei Trypsin verändert (Aspartat statt Serin). Das Aspartat kann eine
starke elektrostatische Bindung mit einer positiv geladenen Lysin- oder Argininseitenkette des Substrats eingehen.
Abbildung 15 : Unterschiede bei Chymotrypsin und Trypsin
Katalytische Triade von Trypsin
Beispiel für kovalente Katalyse, Säure-Base-Katalyse, Deformation des Substrats.
Beim Trypsin (und Chymotrypsin) bilden Histidin 57, Aspartat 102 und Serin 195 eine katalytische Triade, wodurch die
Reaktionsfähigkeit von Serin gesteigert wird.
Wirkungsweise: Nach Zugabe eines Substrats wird ein Proton vom Serin 195 auf das Histidin 57 übertragen und der
Imidazolring durch Aspartat 102 stabilisiert.
Abbildung 16 : Katalytische Triade von Trypsin
Einheiten der Enzymaktivität
Definition der Enzymaktivität:
1 μmol Substratumsatz
1 Unit (U) =
min
Gleichung 1 : Absolute Enzymaktivität
U / ml: Volumenaktivität
U / mg Enzym: spezifische Aktivität
SI-Einheiten:
1 mol Substratumsatz
1 Katal (kat) =
s
Gleichung 2 : Absolute Enzymaktivität
kat / kg: spezifische Aktivität
1 U = 16,67 nkat
-22-
21. Biochemie
Regulation der Enzymaktivität
Aktivierung von Vorstufen
Viele proteolytische Enzyme liegen in einer inaktiven Form vor. Man bezeichnet sie als Zymogene oder Proënzyme.
Die Aktivierung erfolgt durch die Hydrolyse einer oder mehrerer Peptidbindungen.
In diese Gruppe fallen viele Verdauungs- und Blutgerinnungsenzyme.
Beispiel: Zymogen des Trypsins = Trypsinogen
N-terminales Hexapeptid wird abgespalten: Spaltstelle = Lys - Ile
→ Lys = natürliche Spaltstelle des Trypsins
→ Die Protease Enteropeptidase braucht nur wenig aktives Trypsin herzustellen, dann:
→ autokatalytische Aktivierung (Trypsin ist sein eigener Katalysator)
Allosterische Regulation (z. B. Feedback-Inhibition)
Allosterie ist die Erscheinung, dass Makromoleküle (insbesondere Proteïne) ihre Konformation und Aktivität ändern,
wenn ein bestimmtes Molekül (ein Effektor - kann auch gleichzeitig Substrat oder Produkt sein) an das Makromolekül
gebunden wird. Die Bindung erfolgt an einer separaten Effektorbindungsstelle außerhalb des aktiven Zentrums (AZ), was
eine Konformationsänderung im AZ bewirkt und somit einen hemmenden (Effektor ist ein Inhibitor) oder aktivierenden
(Effektor ist Aktivator) Einfluss ausübt. Die allosterische Hemmung unterscheidet sich dabei von der kompetitiven
Hemmung, bei der der Inhibitor im AZ selbst bindet, durch ihre Kinetik.
Bei der Feedback-Hemmung treten Endprodukte einer Reaktionskette als Inhibitoren früherer Reaktionsschritte auf, um
den Reaktionsweg abzuschalten.
Beispiel: Regelung der ACTase bei der Pyrimidinbiosynthese, Hämoglobin etc.
Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit):
Abbildung 17 : Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit)
Modelle zur Erklärung der Kooperativität bei oligomeren Proteïnen:
a) „Symmetriemodel“
Alles-oder-Nichts-Umwandlung, kann aber nicht negative Kooperativität erklären!
Voraussetzungen:
- Es gibt für jede Untereinheit 2 mögliche Konformationszustände (T bzw. R)
- Die Untereinheiten können immer nur in einer Form vorliegen, d.h. nur RR oder TT-Dimere, keine RT-
Dimere! (T = „inaktiv“, R = „aktiv“)
Abbildung 18 : Symmetriemodel
b) „Sequenzmodel“
Voraussetzungen:
- Es gibt für jede Untereinheit 2 mögliche Konformationszustände (T bzw. R)
- Diese Konformationsänderung kann die Substratbindungsaffinität der anderen Untereinheiten erhöhen oder
erniedrigen
Abbildung 19 : Sequenzmodel
-23-
22. Biochemie
Kovalente Modifikation
Die Aktivität wird durch eine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines speziellen Serinrestes festgelegt.
Beispiel: Phosphorylase-Kinase
Assoziation - Dissoziation
Es findet eine Regulation durch andere Proteïne statt. Manche Enzyme werden aktiv, wenn der Ca 2+-Spiegel in der Zelle
steigt. Das entsprechende Regulatorproteïn ist das Calmodulin; es bindet im Calcium-beladenen Zustand an die Proteïne
und aktiviert sie dadurch.
Regulation in Form von Abbau (Proteolyse) durch spezielle Proteasen.
Regulation durch „de novo“-Synthese.
Hemmkinetik
Kompetitive Hemmung
Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert ein Inhibitor mit dem Substrat um die Bindung an das aktive Zentrum.
Dies verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz, wodurch die Hemmung durch eine hohe Substratkonzentration
ausgeglichen werden kann.
Abbildung 20 : Kompetitive Hemmung
Unkompetitive Hemmung
Hier bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex, nicht aber an das freie Enzym. Der ternäre Komplex ESI ist
nicht produktiv.
Abbildung 21 : Unkompetitive Hemmung
Nicht-kompetitive Hemmung
Die Bindung des Inhibitors erfolgt allosterisch, d.h. an einem anderen Zentrum (nicht dem aktiven Zentrum) des
Enzyms. Der Inhibitor verändert das aktive Zentrum, daher ergibt sich eine kleinere oder keine Aktivität. Der ternäre
Komplex ESI ist nicht produktiv.
Abbildung 22 : Nicht-kompetitive Hemmung
-24-
23. Biochemie
Partiell nicht-kompetitive Hemmung
Wie die nicht-kompetitive Hemmung, aber auch aus ESI Produktbildung möglich. Die Substrat- und allosterische
Bindungsstelle überlappen teilweise.
Abbildung 23 : Partiell nichtkompetitive Hemmung
Das Michaelis-Menten Modell
Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentration
Abbildung 24 : Das Michaelis-Menten Modell
Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung
k1 k3
E + S ↔ ES ↔ E + P
k2 k4
k = Geschwindigkeitskonstante
Gleichung 3 : Michaelis-Menten-Gleichung
Für die Anfangsgeschwindigkeit spielt k4 keine Rolle und wird vernachlässigt. Weitere Annahme:
[ S] >> [E] ⇔ S total ≈ S frei
Dann gilt:
ES - Bildungsrate = k 1 [E] [ S]
ES − Zerfallsrate = k 2 [ES] + k 3 [ES]
k 1 [E] [ S] = k 2 [ES] + k 3 [ES]
Daraus folgert:
k 2 + k 3 [ E ][ S ]
KM = =
k1 [ ES ]
Gleichung 4 : Definition der Michaelis-Konstanten
-25-
24. Biochemie
[E] = [E ]
T − [ES]
freies Enzym Gesamtenzym Enzym−Substrat −Komplex
→ [ES] =
[ S] ∗ [E T ]
[ S] + K M
ν 0 = k 3 [ES]
ν max = k 3 [E T ]
→ ν 0 = k 3 [E T ] ∗
[ S]
[ S] + K M
ν 0 = ν max ∗
[ S]
[ S] + K M
Gleichung 5 : Ableitung von v0
Bei v0 = ½ vmax
→
1 ν
ν max = max
[ S] → K = [ S ]
2 [ S] + K M M
Gleichung 6 : Folgerung für v0 = ½ vmax
Bestimmung der Konstanten KM und vmax
Lineweaver / Burk
Kehrwert der Michaelis-Menten-Gleichung: → lineare Darstellung möglich
Abbildung 25 : Diagramm nach Lineweaver / Burk
Hanes
[ S]
ν0
[ S]
Eadie / Hofstee
ν0
ν0
[ S]
Kinetik bei allosterischen Enzymen
Allosterische Enzyme halten sich nicht an das Michaelis-Menten-Modell und zeigen oft eine sigmoide (S-förmige)
Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.
-26-
25. Biochemie
Abbildung 26 : Kinetik bei allosterischen Enzymen
Zwei- (oder Mehr-)Substrat-Reaktionen
Single Displacement
a) random order
+B
E + A ↔ EA ←→ EAB
E+C+D
+A
E + B ↔ EB ←→ EAB
b) compulsory order
+
E + A ↔EA ← B →EAB →E + C + D
E + B ← →EB
Double Displacement
Pingpong-Mechanismus (siehe Fettsäure-Synthese)
Coënzyme und prosthetische Gruppen
Coënzyme sind Nicht-Eiweißverbindungen.
Fast alle hier aufgeführten Substanzen enthalten ADP als Baustein! Die klassische Definition des Katalysators trifft auf
Coënzyme nicht zu, da sie aktiv verändert werden und erst in einem 2. (ebenfalls enzymatischen) Schritt wieder ihre
ursprüngliche Form erhalten.
Die prosthetische Gruppe ist eine Nicht-Eiweißverbindung, die fest (kovalent oder ionisch) an das Enzym gebunden
ist. Sie kann eventuell nur ein einfaches Ion sein, was jedoch benötigt wird, um die volle Kapazität des Enzyms
herzustellen.
Wasserstoffübertragende Coënzyme
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP)
Oxidierte Formen (NAD+ bzw. NADP+)
Formel 17 : Oxidierte Form von NAD und NADP
Wasserstoffaufnahme → reduzierte Formen (NADH bzw. NADPH)
Formel 18 : Reduzierte Form von NAD und NADP
-27-
26. Biochemie
Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD)
Formel 19 : FAD-Gleichgewicht
FAD kann auch durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden.
Flavinmononucleotid (FMN)
- Wasserstoffaufnahme wie bei FAD (FMN → FMNH2)
- prosthetische Gruppe bei der Elektronentransportkette
Formel 20 : Flavinmononucleotid
Auch FMN kann (wie FAD) durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert
werden.
Ubichinon (Coënzym Q)
- 2 Ein-Elektronen-Übergänge mit radikalischer Zwischenstufe
- Redoxsystem in der Atmungskette
- n = 6 – 10
Formel 21 : Ubichinon-Redoxsystem
Plastochinon
- Redoxsystem in der Atmungskette
- Wasserstoffaufnahme wie bei Ubichinon
- n=9
Formel 22 : Plastochinon
-28-
27. Biochemie
Liponsäure
- Wasserstoff-Übertragung bei der oxidativen Decarboxylierung in Form von Liponamid (enzymgebunden):
Formel 23 : Liponsäure-System
Gruppenübertragende Coënzyme
Adenosintriphosphat (ATP)
- Energieträger biochemischer Reaktionen
- Liegt normalerweise in Metallkomplexen (Mg2+) vor
- Freisetzung von Energie durch Hydrolyse der Anhydrid-Bindungen
Formel 24 : Adenosintriphosphat (ATP) und Mg-Komplex
Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse
kJ / mol kcal / mol
Phosphoenolpyruvat (PEP) -61,9 -14,8
Carbamoylphosphat -51,5 -12,3
1,3-Bisphosphoglycerat -49,4 -11,8
Acetylphosphat -43,1 -10,3
Creatinphosphat -43,1 -10,3
Pyrophosphat -33,5 -8,0
ATP → ADP, Pi -30,5 -7,3
Glucose-1-Phosphat -20,9 -5,0
Glucose-6-Phosphat -13,8 -3,3
Glucose-3-Phosphat -9,2 -2,2
Tabelle 2 : Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse
Durch seine Mittelstellung ist ATP als Phosphatgruppenüberträger geeignet. PEP kann wiederum eine
Phosphorylgruppe unter Bildung von ATP auf ADP übertragen.
Pyridoxalphosphat (PLP)
- Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6)
- Die Aldehydgruppe dieses Coënzyms bildet eine Schiff'sche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des
Enzyms.
- Bei Phosphorylase fungiert PLP wahrscheinlich als Säure-Base-Katalysator (Protonenakzeptor und -donator).
Hauptfunktion ist die Aktivierung der verschiedenen Bindungen am C α von Aminosäuren (z. B. bei
Transaminierung).
-29-
28. Biochemie
Formel 25 : Pyridoxalphosphat (PLP)
Coënzyme für C1-Transfer
Tetrahydrofolat (THF)
(siehe „Biosynthese von Makromolekülen“)
Formel 26 : Tetrahydrofolat (THF)
S-Adenosylmethionin
(siehe „Biosynthese von Makromolekülen“)
Formel 27 : S-Adenosylmethionin
Biotin
- Beteiligung am Carboxyltransfer
- Isolierung als Vitamin H aus Leberextrakten
- Inaktivierung durch Bindung an Avidin (Proteïn des Eiklars)
- peptidartige Bindung an Lysinrest → prosthetische Gruppe
Formel 28 : Biotin und Carboxy-Biotin-Enzym
-30-
29. Biochemie
Coënzyme für C2-Transfer
Coënzym A
Formel 29 : Coënzym A
Übertragung von Resten der Carbonsäuren
bei Acetyl-CoA: R = CH3
Formel 30 : Bildung von Acetyl-CoA
Thiamin-Pyrophosphat (TPP)
Decarboxylierung von Pyruvat
Enthält Vitamin B1 (Thiamin)
Formel 31 : Thiamin-Pyrophosphat (TPP)
Coënzyme der Isomerasen und Lyasen
Cobalamin
- Radikalische Umlagerungen von Funktionellen Gruppen (-COO-, -NH3+)
- Methylgruppenübertragung
Formel 32 : Cobalamin
-31-
30. Biochemie
Hämoglobin / Myoglobin
Kooperativität
Die Veränderung (Erhöhung/Erniedrigung) der Bindungsaffinitäten der Untereinheiten eines oligomeren Proteïns zu
kleinen Molekülen (wie hier zum Sauerstoffmolekül) durch die Bindung dieser Moleküle an benachbarte Untereinheiten
bezeichnet man als (positive / negative) Kooperativität.
Hämoglobin (Hb)
Das Hämoglobin kommt in den Erythrocyten vor und übernimmt den Sauerstofftransport im Blut. Es besteht aus dem
Proteïn Globin und der prosthetischen Gruppe Häm. Das Häm ist der Eisenkomplex eines Porphyrins (des
Protoporphyrins IX).
Das Fe(II) im Molekül wird durch die hydrophobe Umgebung gegen Oxidation geschützt.
Formel 33 : Hämoglobin (Hb)
Aufnahme von Sauerstoff durch das Häm
Im Häm kann das Eisen unter Ausbildung einer sechsten (koordinativen) Bindung Sauerstoff reversibel binden. Das
Eisen verändert dabei nicht seine Ladungszahl, sondern Salzbrücken zwischen den Untereinheiten α1 und β1 brechen auf.
Dadurch können die nachfolgenden Sauerstoff-Moleküle leichter gebunden werden (positive Kooperativität). Es entsteht
Oxyhämoglobin. Jedes Hämoglobin kann daher 4 Sauerstoff-Moleküle aufnehmen.
Im Desoxyhämoglobin liegt das Eisenatom etwa 0,04 nm außerhalb der Hämebene. Bei der Oxygenierung bewegt sich
das Eisenatom in die Hämebene hinein (d.h. das proximale His verschiebt sich), um mit dem Sauerstoff eine feste Bindung
einzugehen.
Abbildung 27 : Oxygenierung von Hämoglobin
Durch diese Verschiebung wird eine H-Brücke zwischen Asp-94 und His-146 aufgebrochen, und Protonen werden frei
(s. Bohr-Effekt).
Wirkung von Bisphosphoglycerat
2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) hat eine wichtige Rolle bei der Regulation der Sauerstoffaufnahme. Das
Desoxyhämoglobin kann ein Molekül BPG binden; die negativ geladenen Phosphatgruppen treten mit positiv geladenen
Gruppen von Histidin und Lysin in Wechselwirkung, wodurch die Raumstruktur so stark verändert wird, dass die
Sauerstoffaffinität stark sinkt.
Bei der Sauerstoffbeladung wird das BPG wieder abgegeben. Befindet sich im Blut nur eine geringe Menge an BPG, so
enthält ein Teil des Desoxyhämoglobins kein BPG und bindet den Sauerstoff entsprechend fester. Daher kann der
Sauerstoff dann nicht in den zu versorgenden Geweben abgegeben werden und das Hämoglobin erfüllt seine
Transportfunktion nicht.
Abhängigkeit der Sättigung vom O2-Partialdruck
Bei der Beladung des Hämoglobins wird der hohe Sauerstoffpartialdruck der Lunge ausgenutzt, um Sauerstoff zu
binden und in die Bereiche mit geringerem Sauerstoffpartialdruck zu transportieren.
-32-
31. Biochemie
Abbildung 28 : Abhängigkeit der Sättigung vom O2-Partialdruck
Bohr-Effekt
Der Bohr-Effekt ist die nach dem dänischen Physiologen benannte Sauerstoffaustreibung aus dem Oxyhämoglobin
durch Kohlendioxid, d.h. das Vorliegen einer höheren Konzentration an CO 2 und H+-Ionen in einem stoffwechselaktivem
Gewebe erleichtert die Freisetzung von O2.
Abbildung 29 : Bohr-Effekt
Die Aufnahme von O2 in der Lunge, durch die Protonen freigesetzt werden, hat dabei die Austreibung von CO 2 zur
Folge. Auf molekularer Ebene kommt es beim Übergang von Oxy- zu Desoxyhämoglobin zu einer Verschiebung des Asp-
94 in die Nähe des His-146. Durch die Erhöhung der lokalen negativen Ladung wird der pK-Wert von His-146 erhöht, d.h.
die Wasserstoffaffinität nimmt zu: Es kommt leichter zur Aufnahme von H+.
Fötales Hämoglobin
Der Fötus besitzt einen eigenen Hämoglobin-Typ, das Hämoglobin F (α2γ2) welches sich von dem der Erwachsenen
unterscheidet.
Hämoglobin F bindet BPG schwächer und besitzt daher eine höhere Sauerstoffaffinität als Hämoglobin A. Daher kann
O2 vom mütterlichen Hämoglobin A auf das Hämoglobin F des Fötus übertragen werden.
Myoglobin (Mb)
Das Myoglobin bindet ebenfalls den Sauerstoff durch das Häm. Es transportiert und speichert ihn jedoch in der
Muskelzelle und zeigt als Monomer keine Kooperativität.
-33-
32. Biochemie
Chemische Modifizierung von Proteïnen
Zweck:
● Bestimmung katalytisch relevanter AS
● Veränderung der Proteineigenschaften (durch Veränderung der Oberfläche)
a) Ladungsveränderung
b) hydrophobe Oberfläche
● Quervernetzung mit bifunktionellen Gruppen
a) Abstandsmessungen im AZ (zwischen katalytisch relevanten AS)
b) Verknüpfung von Untereinheiten
α: zur Stabilisierung des Proteïns
β: Bestimmung der Geometrie des Aufbaus aus der Verteilung der Quervernetzungsprodukte
c) Lokalisierung relativ zu anderen Proteïnen(in der Membran, in Multienzymkomplexen, im Aufbau des
Ribosoms)
Welche AS-Seitenreste können reagieren?
In allen Fällen werden elektrophile Reagenzien benötigt, (bei -COOH nur, wenn –COO-, sonst eventuell Nukleophile)
Abbildung 30 : Reaktionsfähige AS-Seitenreste
Probleme:
- Kann überhaupt eine Seitenkette selektiv modifiziert werden? (z.B. bei LDH eine von 5 SH-Gruppen oder oft
eine von mehr als 20 Lys-NH2-Gruppen)
- Sterische Zugänglichkeit:: Besondere Reaktivität durch spezifischen pK-Wert durch Nachbargruppen →
kinetische Kontrolle (z.B. Lys-NH2 normal pK = 11; im AZ Teile mit pK = 8)
Wahl des Reagenz:
- Spezifität
- reversible Reaktion?
- milde Reaktionsbedingungen
Bestimmung des Einbaus:
- Farbige Reagenzien
- Radioaktive Markierung (3H, 14C, 35S...)
Bestimmung katalytisch relevanter AS:
Korrelation der Aktivität mit dem Einbau:
→ Probleme: Trotz 1:1-Relation kann es zu allosterischen Effekten kommen.
→ Bsp.: Bei der Modifizierung der „essentiellen SH-Gruppe“ bei der LDH wird eine Seitenkette verschoben, an
die ein „essentielles His“ geknüpft ist → Verlust der Aktivität!
Identifizierung der Art der modifizierten AS:
z. B. durch die pH-Abhängigkeit (der pK-Wert von 6,5 deutet eventuell auf His)
-35-
33. Biochemie
Unspezifische Reagenzien
Iodessigsäure:
Formel 34 : Umsetzung mit Iodessigsäure
Iodacetamid
Formel 35 : Umsetzung mit Iodacetamid
Acet(yl)imidazol:
(bei His, Cys Produkte instabil)
Formel 36 : Umsetzung mit Acet(yl)imidazol
Gruppenspezifische Reagenzien
Lys-NH2
Imidoester: (entsteht aus: R-CN + MeOH / HCl)
Formel 37 : Umsetzung mit Lys-NH2
Tyr-OH
Tetranitromethan:
Formel 38 : Umsetzung mit Tyr-OH
Alternativ: Umsetzung mit Diazoniumsalzen → Azofarbstoffe
Cys-SH
Maleïnimide, z. B. N-Ethylmaleïnimid:
Formel 39 : Umsetzung mit Cys-SH
Umsetzung auch mit Lys bei pH = 6,5 - 7, Geschwindigkeit aber 1000mal langsamer.
-36-
34. Biochemie
Serin-OH
Diisopropylfluorophosphat:
Parathion (E 605) wirkt analog:
Formel 40 : Umsetzung mit Serin-OH
Tryptophan
Sulfenylchlorid (Koshland-Reagenz): Reaktion auch mit Cys-SH, das „reversibel“ geschützt werden muss.
Formel 41 : Umsetzung mit Tryptophan
Arginin
Butandion (Diacetyl):
Formel 42 : Umsetzung mit Arginin
Aspartat, Glutamat:
Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD)
Formel 43 : Umsetzung mit Aspartat, Glutamat
Reagenzien zur Änderung der Ladung
Abbildung 31 : Reagenzien zur Änderung der Ladung
-37-
35. Biochemie
Hydrophobisierung von Enzymen
Abbildung 32 : Hydrophobisierung von Enzymen
Reversible Reagenzien
Histidin
Abbildung 33 : Reversible Reagenzien (Histidin)
Cysteïn
a)
b)
c) Ellman’s Reagenz
Formel 44 : Ellman's Reagenz
Active-Site Labeling
Formel 45 : Active-Site Labeling
Suizid-Substrate
Werden am aktiven Zentrum reaktiv.
-38-
36. Biochemie
Formel 46 : Suizid-Substrate
Photoaffinity-Label
Formel 47 : Photoaffinity-Label
Bifunktionelle Reagenziën
Kriterien für die Anwendung
a) Abstandsmessungen (im AZ) starr
- spezifisch für bestimmte Aminosäuren
- für Reste eventuell unterschiedlich spezifisch
b) Lokalisierung von „Nachbarn“; kovalente Verbindungen von Untereinheiten
- flexibel
- unspezifisch
Reagenz von Zahn
Formel 48 : Reagenz von Zahn, o,p- aktiviert für nucleophile Substitution des Fluor
Hugo Fasold
Probleme:
-39-
37. Biochemie
- viele Produkte
- Reaktion nur an Rest A oder nur an Rest B
- Quervernetzung zwischen A und B
- weitere Reste können entsprechend reagieren
- bei asymmetrische Reagenzien kann u.U. die eine oder die andere Seite mit Rest A reagieren
Beispiel:
Stufenweise Reaktion:
Belichtung nach Entfernung des nicht umgesetzten Überschusses durch z.B. Dialyse oder Gelchromatographie.
Aktivierung einfach durch pH > 8,5 nach Reaktion mit –SH und Dialyse
Semireversible Reagenzien
Formel 49 : Semireversible Reagenzien
Trägergebundene Enzyme
Vorteile
● Erhöhte Stabilität (z.B. Proteasen, Schutz vor Selbstverdauung)
● Wiedergewinnung
Probleme
● Zugänglichkeit des AZ
● Kinetik: Diffusionsprobleme:
Spezifische Aktivität kleiner als im löslichen Enzym, auch wenn Zugang zum AZ frei, denn nach Teilverdau
des Trägers steigt die spezifische Aktivität bis zum Normalwert
● Reaktion an der richtigen UE
-40-
38. Biochemie
Arten der Verknüpfung
● kovalent
● Adsorption
● Einschlussverbindungen
● Aggregation
Kovalente Bindung an welche AS?
- Keine seltenen, da diese oft katalytisch relevant
- Schutz des AZ durch Komplexe (LDH: NAD+ / Oxalat)
- z.B. direkt an BrCN-aktivierte Agarose:
- (dargestellte Reaktion verläuft über Spacer + R-COOH, es geht auch mit Lys-NH 2)
- Bifunktionelle Reagenzien:
Müssen erst mit Enzym reagieren und nur das "aktive", modifizierte an Träger binden!
- Adsorption an:
poröses Glas / Ti02 / Collagen
- Einschlussverbindungen:
z.B. Copolymerisation (Acrylamid mit Bisacrylamid)
- Chemische Aggregation:
z.B. durch bifunktionelle Reagenzien
-41-
39. Biochemie
Lipide
Allgemeine Übersicht
Abbildung 34 : Lipide, allgemeiner Überblick
Fette
Fette bestehen in der Regel aus Glycerin und 3 Fettsäuren, z.B. die unten abgebildeten.
Für die Bezeichnung der Fettsäuren verwendet man eine Kurzschreibweise, bei der die Zahl der C-Atome und die Zahl
der Doppelbindungen angegeben werden.
Formel 50 : Verschiedene Fettsäuren
Glycolipide
Sie enthalten kein Phosphat, sondern stattdessen einen Mono- oder Oligosaccharidrest, der meist mit Sphingosin (oder
Glycerin) verknüpft ist und den hydrophilen Anteil bildet.
Glyceringlykolipide:
1.2-Diacylglycerin und ein Mono- oder Oligosaccharid in 3-Stellung des Glycerins glycosidisch gebunden.
Sphingosinglykolipide:
Als Sphingolipide enthalten sie als zentralen Baustein statt des 3-wertigen Alkohols Glycerin einen Aminodialkohol,
das Sphingosin, welches ein C18-Molekül mit einer trans-Doppelbindung ist.
Durch Amidbildung mit einer Fettsäure kommt es zu Ceramiden, deren Glycoside die neutralen Glycosphingolipide
sind.
Formel 51 : Sphingosinglykolipide
-43-
40. Biochemie
Einfachste Vertreter: Cerebroside. Bei den Cerebrosiden des Gehirns meist Galactose, bei Leber und Milz meist
Glucose.
Formel 52 : Ein Cerebrosid
Phospholipide
Glycerinphospholipide
Phosphodiëster; die Phosphorsäure ist einerseits mit einem Sphingosin- oder Glycerinderivat (meist Diacylglycerin),
andererseits mit Cholin, Ethanolamin, Serin, Inosit oder Glycerin verestert.
Formel 53 : Phosphatidylcholin (Lecithin)
Sphingosinphospholipide
Sphingomyeline: In den Myelinscheiden vorkommende Sphingosinphospholipide, bei denen die endständige
Hydroxygruppe des Ceramids (s.o.) mit Phosphorylcholin verestert ist.
Formel 54 : Ein Sphingomyelin
Isoprenoidlipide
Die Steroide und Terpene gehören zu dieser Stoffklasse und werden wegen ihrem ähnlichen Lösungsverhalten zu den
Lipiden gerechnet.
Steroide
Cholesterin
Das Cholesterin leitet sich vom Cyclopentanoperhydrophenanthren ab, welches auch als Steran bezeichnet wird. Durch
die OH-Komponente liegt Cholesterin als Alkohol vor (engl.: Cholesterol). Cholesterin verleiht der Membran Starrheit und
schließt auftretende Löcher.
Formel 55 : Sterangrundgerüst, Cholesterin
-44-
41. Biochemie
Terpene
Zu dieser Stoffklasse gehören die Carotine und die Xanthophylle, die hier aber nicht weiter besprochen werden.
Biomembranen
Membranfunktion
● Geben den Zellen Individualität durch Abtrennung der Umwelt
● Bei Eukaryonten: Strukturierung von Zellorganellen durch interne Membranen
Eukaryonten: Einzellige oder mehrzellige Organismen, die einen vom Cytoplasma durch eine Membran
abgegrenzten Zellkern besitzen.
Prokaryonten: Kein Zellkern.
● Kompartimentierung bestimmter Prozesse
● Extrem spezifische Permeabilitätsbarrieren
● Bewirken geordnete räumliche Anordnung bestimmter Enzyme zueinander (Reaktionsketten möglich)
● Enthalten Pumpen (molekulare), Rezeptoren (Hormone) zur Steuerung interner Prozesse
Bau der Membranen
● Keine kovalenten oder festen Strukturen, sondern eine „Flüssigkeitsschicht“, die durch Wechselwirkungen mit
dem Lösungsmittel entsteht.
● Bestehen aus: Lipiden (v.a. Phospholipide, Glycolipide und Cholesterin) und Proteïnen
Abbildung 35 : Membranen
Die Flächen können Vesikel (kugelförmige Doppelschichten) bilden.
Die Doppelschicht liegt nicht starr vor, sondern befindet sich ständig im Fluss, wobei die Proteïne ihre Positionen
verändern können. Laterale Diffusion einfach, hochmobile Schicht. Transversale Diffusion (flip-flop) energetisch
ungünstig.
-45-
42. Biochemie
Monosaccharide
Nomenklatur
Abbildung 36 : Nomenklatur der Monosaccharide
Aldose mit n C-Atomen: 2n-2 stereoisomere Formen
Pentosen: n = 5 → 23 = 8 Isomere (4 L-Formen und 4 D-Formen)
Hexosen: n = 6 → 24 = 16 Isomere
Fischer-Projektion
- D-Zucker haben an ihrem carbonylfernsten Asymmetriezentrum die gleiche absolute Konfiguration wie D-
Glycerinaldehyd
- L-Zucker sind Spiegelbilder der D-Zucker
Glycerinaldehyd
Formel 56 : Konfigurationen des Glycerinaldehyds
Epimere:
Zucker, die sich in der Konfiguration nur an einem C-Atom unterscheiden (z.B. Glucose / Mannose).
Acetale und Ketale
Acetale entstehen bei der Reaktion von Aldehydgruppen mit Alkoholen:
Formel 57 : Reaktionsweg: Aldehyd zum Vollacetal
Ketale entstehen bei der Reaktion von Ketogruppen mit Alkoholen.
Formel 58 : Reaktionsweg: Ketogruppe zum Vollketal
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43. Biochemie
Saccharose
Formel 59 : Saccharose
Zyklische Zucker
5-Ring-Zucker
Formel 60 : 5-Ring-Zucker
6-Ring-Zucker
Formel 61 : 6-Ring-Zucker
Nucleotide
Nucleoside: Zucker und eine Base
Nucleotide: Zucker, Base und ein oder mehr Phosphatreste
Purinbasen
Formel 62 : Purinbasen
Pyrimidinbasen
Formel 63 : Pyrimidinbasen
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44. Biochemie
Stoffwechsel
Die grundlegenden Stoffwechselwege sind in den meisten Organismen identisch!
Aufklärung durch
● Fütterungsversuche mit durch Isotopen markierten Substanzen
● Verwendung von Stoffwechselinhibitoren (Hemmstoffen)
● Verwendung von auxotrophen Mutanten (benötigen bestimmten Nährstoff für ihr Wachstum)
Mutanten durch
● mutagene Substanzen
● Strahlung, z.B. Röntgenstrahlung
● molekularbiologische Methoden
Ein Beispiel für die Wirkung von Mutanten ist die Arginin-Biosynthese im Harnstoff-Zyklus mit folgenden
Enzymdefekten:
Abbildung 37 : Mutanten bei der Arginin-Biosynthese
Mutante 1 wächst auf: Ornithin oder Citrullin oder Arginin; Mutante 2 wächst auf: Citrullin oder Arginin; Mutante 3 wächst auf: Arginin
Cross-feeding: Mutante 2 reichert Ornithin an und wächst mit Filtrat von Mutante 3 (da in diesem Citrullin angereichert
ist), aber nicht umgekehrt
Metabolismus
Stoffwechsel: Bedeutung i.a. Anabolismus und Katabolismus
Anabolismus
Aufbau von Körpersubstanzen
Katabolismus
Abbau von Körpersubstanzen und Nahrungsbestandteilen
Speicherung der Energie
As ATP / hochreduzierte Verbindungen (z.B. Glucose) reduzierte Elektronenüberträger (NADH, FADH2, NADPH)
Verwendung der Energie
Für Biosynthesen (Anabolismus) / Muskelarbeit (ATP) / Transportprozesse
Unterscheidung der Lebewesen
1. Nach der Kohlenstoffquelle: autotroph: „sich selbst ernährend“; C-Quelle ist CO2
heterotroph: C-Quelle sind andere Zellen bzw. deren Bestandteile
2. Nach der Energiequelle: phototroph: Licht
chemotroph: Redoxprozesse
3. Nach den Elektronendonatoren: lithotroph: anorganische Verbindungen: (H2S, NH3, S, Co, Fe2+, H2O)
organotroph: organische Verbindungen
Organismen C-Quelle E-Quelle e—-Donatoren Beispiel
photolithotroph CO2 Licht anorg. Verb. Bakteriën
photoorganotroph org. Verb./CO2 Licht org. Verb. Purpurbakteriën
chemolithotroph CO2 Redoxprozesse anorg. Verb. Archaëbakteriën
chemoorganotroph org. Verb. Redoxprozesse org. Verb. alle höheren Tiere
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46. Biochemie
Kohlenstoff-Stoffwechsel
Glycogen
Glycogen ist eine leicht mobilisierbare Speicherform der Glucose. Es ist ein großes, verzweigtes Polymer aus
Glucoseeinheiten in α-1,4-glykosidischer Bindung.
Formel 64 : α-1,4- und α-1,6-glycosidische Bindung
Die Synthese und der Abbau von Glycogen sind aus mehreren Gründen von Bedeutung:
● Regulation des Blutzuckerspiegels
● Glucosereservoir für anstrengende Muskelaktivität
● Synthese und Abbau laufen auf unterschiedlichen Reaktionswegen, dies verdeutlicht ein wichtiges Prinzip der
Biochemie
● Generelle Bedeutung der Regulationsmechanismen auf hormoneller Ebene
● Reversible Phosphorylierung der Enzyme
Abbau des Glycogens durch Glycogen-Phosphorylase
Phosphorolyse bedeutet die Spaltung einer Bindung durch Einbau von Orthophosphat (im Gegensatz zur Hydrolyse,
einer Spaltung durch Wasser).
Formel 65 : Abbau des Glycogens durch Glycogen-Phosphorylase
Für den Ablauf der Spaltung ist als Coënzym das Pvridoxal-5-phosphat (PLP), ein Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6)
erforderlich. Die Aldehydgruppe dieses Coënzyms bildet eine Schiff'sche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des
Enzyms.
PLP spaltet mit seiner Phosphatgruppe zunächst die glycosidische Bindung und wird durch anorganisches Phosphat
wieder freigesetzt (doppelte Inversion am C1).
Abbau des Glycogens durch Phosphorylase
Phosphorylase kann die Kette nur solange abbauen, bis sie einen endständigen Glucoserest erreicht, der nur 4 Einheiten
bis zu einer Verzweigung entfernt ist.
Abbildung 38 : Abbau des Glycogens durch Phosphorylase
Übertragung durch eine Transferase
Die Transferase überträgt einen Block von 3 Glucoseeinheiten von einem äußeren Zweig auf einen anderen.
Abbildung 39 : Übertragung durch eine Transferase
Abbau durch ein debranching enzyme (= Aufhebung der Verzweigung)
Das dritte Abbauenzym, die α-1,6-Glucosidase (unter dem Namen debranching enzyme bekannt), hydrolysiert die
Bindung des einzelstehenden Glucosemoleküls, es entsteht ein Molekül Glucose.
Abbildung 40 : Abbau durch ein debranching enzyme
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47. Biochemie
Somit liegt das Glycogen wieder in einer linearen Form vor und kann weiter von der Phosphorylase abgebaut werden.
Synthese von Glycogen
Die Synthese hat als erste Vorstufe die UDP-Glucose.
Glucose - 1- Phosphat + UTP → UDP - Glucose + PPi
Glycogen( n) + UDP - Glucose → Glycogen( n + 1) + UDP
Gleichung 7 : Synthese von Glycogen
UDP-Glucose
Formel 66 : UDP-Glucose
Die Verzweigungen (α-1,6-Bindungen) werden durch ein branching enzyme gebildet.
Glycolyse
Ablauf der Glycolyse
Formel 67 : Ablauf der Glycolyse
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48. Biochemie
Die Glycolyse ist eine Folge von Reaktionen in denen im Cytosol (Cytoplasma) Glucose in Pyruvat umgewandelt wird
und gleichzeitig ATP entsteht. In aeroben Organismen geht sie dem Citratzyklus und der Atmungskette voraus. Unter
anaëroben Bedingungen tritt das Pyruvat in die Mitochondriën über und wird hier vollständig zu CO 2 und H2O oxidiert. Bei
ungenügendem Sauerstoffangebot, etwa in einem Muskel, wird das Pyruvat in Lactat überführt. Bei einigen anaeroben wird
das Pyruvat in Ethanol umgewandelt. Die Bildung von Lactat oder Ethanol aus Glucose sind Beispiele für Gärungen.
Netto-Stoffbilanz der Glycolyse
Glucose + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ → 2Pyruvat + 2ATP + 2NADH/H+ + 2H2 O
Gleichung 8 : Netto-Stoffbilanz der Glycolyse
Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose
Die Umwandlung besteht aus 3 Reaktionen: einer Phosphorylierung, einer Isomerisierung und einer
2. Phosphorylierung. Der Sinn dieser Reaktionen ist die Überführung der Glucose in eine reaktionsfähige Form, welche
sich in 2 C3-Einheiten spalten lässt.
Formel 68 : Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose (Gesamtreaktion)
Formel 69 : Phosphorylierung der Glucose durch Hexokinase
Formel 70 : Isomerisierung von Glucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat durch Glucosephosphat-Isomerase (Umwandlung einer Aldose in eine Ketose)
Formel 71 : Phosphorylierung zu Fructose-l,6-bisphosphat durch Phosphofructokinase
Bildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat
Formel 72 : Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch Aldolase
Formel 73 : Mechanismus der Aldolase
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49. Biochemie
Aldolase führt die umgekehrte Reaktion einer Aldolkondensation (z.B. Aldehyd + Keton) durch. Die Reaktion läuft nur
mit GAP weiter, dass DHAP wird durch Triosephosphatisomerase in GAP überführt.
1. energiegewinnender Schritt
Phosphorylierung und Oxidation des GAP (keine ATP-Bildung!)
Formel 74 : Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-phosphat in 1,3-Bisphosphoglycerat durch Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
Formel 75 : Mechanismus der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
2. energiegewinnender Schritt
Dies ist die erste ATP-bildende Reaktion, katalysiert durch Phosphoglycerat-Kinase.
Formel 76 . Erste ATP-bildende Reaktion
Formel 77 : Bildung von Pyruvat und eines zweiten Moleküls ATP
Regulation der Glycolyse
Abbildung 41 : Regulation der Glycolyse
Glycolyse und Gluconeogenese sind so koordiniert, dass beide Vorgänge nicht gemeinsam anlaufen. Bei dieser
Kontrolle spielt ein Signalmolekül, das Fructose-2,6-bisphosphat eine wichtige Rolle.
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50. Biochemie
Regulation der Glycolyse / Gluconeogenese durch F-2,6-BP
F-2,6-BP aktiviert die 6-Phosphofructo-1-Kinase der Leber, indem sie deren Affinität zu Fructose-6-Phosphat steigert
und die Hemmwirkung von ATP herabsetzt. Dies hat die Synthese von F-1.6-BP durch die Phosphorylierung von Fructose-
6-phosphat zur Folge. Gleichzeitig wird Fructose-1,6-bisphosphatase durch F-2,6-BP gehemmt.
Regulation der Konzentration von F-2,6-BP
F-2,6-BP wird durch Phosphorylierung (durch 6-Phosphofructo-2-Kinase) synthetisiert und kann von der Fructose-2,6-
bisphosphatase zu Fructose-6-phosphat hydrolysiert werden. Beide Enzyme befinden sich auf einer einzigen Peptidkette,
die man auch als Tandem-Enzym bezeichnet.
Regulation des Tandem-Enzyms
Die Aktivitäten von 6-Phosphofructo-2-Kinase und Fructose-2,6-bisphosphatase werden durch die Phosphorylierung
eines Serinrestes kontrolliert.
Bei Glucosemangel löst ein Konzentrationsanstieg des Hormons Glucagon eine Reaktionskaskade aus, die zur
Phosphorylierung dieses bifunktionellen Enzyms führt (Fructose-6-phosphat → Gluconeogenese). Ist dagegen Glucose im
Überschuss vorhanden, verliert das Enzym seine Phosphorylgruppe, wodurch der F-2,6-BP-Spiegel ansteigt (→
Glycolyse).
unphosphoryliert: aktiviert Kinase, hemmt Bisphosphatase → Aufbau von F-2,6-BP
phosphoryliert aktiviert Bisphosphatase, hemmt Kinase → Abbau von F-2,6-BP
Abbildung 42 : Regulation des Tandem-Enzyms
Weiterverarbeitung des Pyruvats
Aërobiër
Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex
● Acetyl-CoA
● Citronensäure-Zyklus → oxidative Phosphorylierung
● CO2 + H2O
Abbildung 43 : Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex
Höhere Organismen und Bakterien bei O2-Mangel (anaërob)
Homolaktische Fermentation → Lactat (Muskel)
Glucose + 2ADP + 2Pi → 2Lactat + 2ATP + 2H2 O
Formel 78 : Anaërobe Lactatbildung
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51. Biochemie
Hefe und Mikroorganismen (anaërob)
Alkoholische Gärung zum Ethanol
Glucose + 2ADP + 2Pi + 2FT → 2Ethanol + 2CO 2 + 2H2 O
1 Decarboxylierung durch Pyruvat-Decarboxylase
2 Reduktion durch Alkohol-Dehydrogenase mit NADH
Formel 79 : Alkoholische Gärung
Oxidative Decarboxylierung
Die Funktion dieses Reaktionsweges ist die Bildung von Acetyl-CoA aus Pyruvat in den Mitochondriën, welches
anschließend im Citratzyklus vollständig zu CO2 oxidiert wird.
Die Reaktion wird durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex katalysiert. Es handelt sich dabei um einen sehr
großen Multienzymkomplex aus 3 eng zusammenwirkenden Enzymen (Vorteil des Multienzymkomplexes: Höhere
Geschwindigkeit, kaum Nebenreaktionen).
Komponente Abk. Ketten Coënzyme Reaktion
Oxidative Decarboxylierung von
Pyruvat-Dehydrogenase E1 24 TPP
Pyruvat
Transfer der Acetylgruppe auf
Dihydrolipoyl-Transacetylase E2 24 Liponamid
CoA
Regenerierung der oxidierten
Dihydrolipoyl-Dehydrogenase E3 12 FAD + NAD+
Form des Liponamids
Tabelle 4 : Komponenten des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes
Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP
Pyruvat + TPP → Hydroxyethyl - TPP + CO 2
Gleichung 9 : Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP (Gesamtreaktion)
Formel 80 : Ionisierung des TPP
Durch die Ionisierung des TPP kommt es zur Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert.
Formel 81 : Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert
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52. Biochemie
Oxidation der Hydroxyethylgruppe und Übertragung auf Liponamid
Formel 82 : Oxidation der Hydroxyethylgruppe und Übertragung auf Liponamid
Übertragung der Acetylgruppe auf Coënzym A
Formel 83 : Übertragung der Acetylgruppe auf Coënzym A
Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids
Formel 84 : Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids
Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes
Produkthemmung
Die Produkte der Pyruvatoxidation, Acetyl-CoA und NADH, hemmen den Enzymkomplex. Acetyl-CoA hemmt die
Transacetylase-Komponente, NADH die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase.
Feedback-Regulation durch Nucleotide (Rückkopplungshemmung):
Die Aktivität des Enzymkomplexes wird durch die Energieladung kontrolliert. AMP aktiviert den Komplex, GTP
hemmt ihn, d.h. der Komplex wird gehemmt, wenn unmittelbar verfügbare Energie vorhanden ist.
Regulation durch reversible Phosphorylierung:
Der Komplex wird enzymatisch inaktiv, wenn ein spezifischer Serinrest durch eine Kinase phosphoryliert wird. Dabei
hemmt AMP und Pyruvat die Kinase. Die Phosphorylierung kann durch eine Phosphatase rückgängig gemacht werden. Es
liegt also ein reversibler Regulationsmechanismus vor.
Hormonelle Steuerung
Der Glycogenstoffwechsel wird von bestimmten Hormonen stark beeinflusst.
Insulin
Ein Polypeptidhormon, welches die Fähigkeit der Leber steigert, Glycogen zu synthetisieren. Insulin wird in den B-
Zellen der Langerhansschen Inseln im Pankreas gebildet und ins Blut abgegeben. Ein hoher Insulinspiegel im Blut
signalisiert Sättigung, ein geringer einen Hungerzustand.
Adrenalin (Epinephrin)
Entgegengesetzte Wirkung von Insulin, bewirkt also den Abbau von Glycogen in der Muskulatur. Freisetzung aus dem
Nebennierenmark.
Glucagon
Stimulierung des Glycogenabbaus in der Leber. Wird von den α-Zellen des Pankreas abgegeben, wenn der Blutzucker
niedrig ist. Durch den Abbau des Glycogens wird der Blutzuckerspiegel wieder angehoben.
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