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Biochemie

  1. 1. BiochemieInhaltsverzeichnis -3-
  2. 2. BiochemieProteïne................................................................................................................................................................ 7 Hierarchie der Zellkomponenten.................................................................................................................................. 7 Allgemeiner Aufbau der Proteïne................................................................................................................................. 7 Analyse der Raumstruktur von Proteïnen...................................................................................................................7 Die 20 Aminosäuren...................................................................................................................................................... 8 Struktur der Proteïne..................................................................................................................................................... 9 Analyse von Proteïngemischen................................................................................................................................. 11 Nachweis mit Ninhydrin.............................................................................................................................................. 15 Bestimmung der Aminosäuresequenz......................................................................................................................15 Zuordnung der Disulfidbrücken................................................................................................................................. 20Enzyme / Coënzyme.......................................................................................................................................... 21 Enzyme......................................................................................................................................................................... 21 Coënzyme und prosthetische Gruppen.................................................................................................................... 27 Hämoglobin / Myoglobin............................................................................................................................................. 32Chemische Modifizierung von Proteïnen........................................................................................................ 35 Zweck:.......................................................................................................................................................................... 35 Unspezifische Reagenzien......................................................................................................................................... 36 Gruppenspezifische Reagenzien............................................................................................................................... 36 Reagenzien zur Änderung der Ladung...................................................................................................................... 37 Hydrophobisierung von Enzymen.............................................................................................................................38 Reversible Reagenzien............................................................................................................................................... 38 Active-Site Labeling.................................................................................................................................................... 38 Suizid-Substrate.......................................................................................................................................................... 38 Photoaffinity-Label...................................................................................................................................................... 39 Bifunktionelle Reagenziën.......................................................................................................................................... 39 Semireversible Reagenzien........................................................................................................................................ 40 Trägergebundene Enzyme.......................................................................................................................................... 40Lipide.................................................................................................................................................................. 43 Allgemeine Übersicht.................................................................................................................................................. 43 Fette.............................................................................................................................................................................. 43 Glycolipide................................................................................................................................................................... 43 Phospholipide.............................................................................................................................................................. 44 Isoprenoidlipide........................................................................................................................................................... 44 Biomembranen............................................................................................................................................................ 45Monosaccharide................................................................................................................................................ 47 Nomenklatur................................................................................................................................................................. 47 Zyklische Zucker......................................................................................................................................................... 48 Nucleotide.................................................................................................................................................................... 48Stoffwechsel....................................................................................................................................................... 49 Unterscheidung der Lebewesen................................................................................................................................ 49Kohlenstoff-Stoffwechsel................................................................................................................................. 51 Glycogen...................................................................................................................................................................... 51 Glycolyse...................................................................................................................................................................... 52 Oxidative Decarboxylierung....................................................................................................................................... 56 Hormonelle Steuerung................................................................................................................................................ 57 Gluconeogenese.......................................................................................................................................................... 60 Der Citratzyklus........................................................................................................................................................... 61 Oxidative Phosphorylierung und Atmung................................................................................................................ 62 Der Pentosephosphatweg.......................................................................................................................................... 65Der Fettsäurestoffwechsel................................................................................................................................ 69 Fettsäureabbau............................................................................................................................................................ 69 Ketonkörper entstehen bei vorherrschendem Fettabbau.......................................................................................71 Fettsäure-Synthese..................................................................................................................................................... 71Aminosäureabbau und Harnstoffzyklus.......................................................................................................... 73 Transaminierung......................................................................................................................................................... 73 Oxidative Desaminierung........................................................................................................................................... 73 Der Harnstoffzyklus..................................................................................................................................................... 74Biosynthese von Makromolekülen................................................................................................................... 75 Tetrahydrofolat als C1-Überträger............................................................................................................................. 75 Zyklus der aktivierten Methylgruppe......................................................................................................................... 75 Purin-Biosynthese....................................................................................................................................................... 76 -4-
  3. 3. Biochemie Pyrimidinbiosynthese................................................................................................................................................. 78 Abbau der Purine......................................................................................................................................................... 78 NAD-Biosynthese........................................................................................................................................................ 79 Synthese von Sphingolipiden und Gangliosiden.....................................................................................................79 Biosynthese von Phospholipiden.............................................................................................................................. 80 Cholesterin-Synthese.................................................................................................................................................. 80Photosynthese................................................................................................................................................... 83 Lichtreaktion................................................................................................................................................................ 83 Dunkelreaktion............................................................................................................................................................. 85Anhang............................................................................................................................................................... 87 Abbildungsverzeichnis............................................................................................................................................... 87 Formelverzeichnis....................................................................................................................................................... 90 Gleichungsverzeichnis............................................................................................................................................... 94 Tabellenverzeichnis.................................................................................................................................................... 95 -5-
  4. 4. BiochemieProteïneHierarchie der Zellkomponenten • Zelle • Organellen z.B. Mitochondrien, Chloroplasten, Zellkern • Supramolekulare Strukturen Multiënzymkomplexe, Ribosomen, kontraktile Systeme • Makromoleküle Nucleïnsäuren, Proteïne, Polysaccharide, Lipide • Bildungsblöcke Nucleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Glycerol und Fettsäuren • metabolische Zwischenprodukte Pyruvat, Citrat, Malat • Vorstufen aus de Umwelt CO2, N2, NH3, H2OAllgemeiner Aufbau der Proteïne Proteïne sind Heteropolymere der Aminosäuren (d.h. aus verschiedenen Molekülen zusammengesetzt). Ein weiterer wichtiger Typ kovalenter Bindungen in Proteïnen sind die Disulfidbrücken zwischen Cysteïnhälften(cross linkage). Die Bindungen können von Proteasen hydrolysiert werden. Abbildung 1 : Allgemeiner Aufbau der ProteïneNomenklatur: Außer beim Glycin ist das α-C-Atom asymmetrisch substituiert, es tritt daher optische Aktivität auf. Man unterscheidet 2 sterische Reihen, die L- und die D-Reihe, sowie zweierlei Konfigurationszuweisungen, die S- unddie R-Konfiguration. Nur L-Aminosäuren, die fast alle (Ausnahme L-Cysteïn) S-Konfiguration besitzen, sind Bausteineder Proteïne. Formel 1 : Sterischer Unterschiede der Aminosäuren Der optische Drehungssinn ist unabhängig von der Zugehörigkeit zu einer sterischen Reihe.Analyse der Raumstruktur von ProteïnenMehrdimensionale NMR-Spektroskopie: (NMR = Kernmagnetische Resonanz) Das Proteïn wird in ein magnetisches Feld gebracht und die unterschiedliche Resonanz der Atomkerne gemessen. Vorteil: Es ergibt sich ein 3D-Bild, welches sich aus der Summe von Einzelmolekülen in Lösung ergibt.Röntgenstrukturanalyse eines Kristalls der Verbindung Bestrahlung des Moleküls mit Röntgenstrahlen, wobei die Strahlen bei unterschiedlicher Elektronendichteverteilungunterschiedlich gebeugt werden. Durch die Mobilität ergeben sich allerdings Unschärfen im Kristall. Die Struktur desMyoglobins (ähnlich dem Hämoglobin) wurde durch diese Methode aufgeklärt. Vorteil: Auflösungsgrenze = 0,15 nm (bzw. 0,2 - 0,35 nm) (beim LM: » 400 nm) Nachteil: eingeschränkte Dynamik -7-
  5. 5. BiochemieDie 20 Aminosäuren Abbildung 2 : Konfiguration der Aminosäuren bei unterschiedlichen pH-WertenNeutrale hydrophobe Aminosäuren Formel 2 : Neutrale hydrophobe AminosäurenNeutrale hydrophile Aminosäuren Formel 3 : Neutrale hydrophile AminosäurenSaure Aminosäuren Formel 4 :Saure AminosäurenBasische Aminosäuren Formel 5 : Basische Aminosäuren -8-
  6. 6. BiochemieStruktur der ProteïnePrimärstruktur Die Aminosäuresequenz in der Polypeptidkette. Formel 6 : Aminosäuresequenz in der PolypeptidketteSekundärstruktur Bei der α-Helixstruktur sind Wasserstoffbrücken intramolekular zwischen der NH- und der 4 AS1-Reste entfernten CO-Gruppe ausgebildet. Dadurch entsteht die schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren. Abbildung 3 : Schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren (α-Helix-Struktur) Ganghöhe (pitch): Länge, die die α-Helix bei voller Drehung zunimmt. Eine Aminosäure bringt eine Drehung von 100°,daher nach 3,6 AS eine volle Umdrehung. Bei der β-Faltblattstruktur kommt es zu einer zur Kettenrichtung senkrechten Ausbildung der H-Brücken (bei α-Helix:parallel zur Helixachse) zwischen verschiedenen Polypeptidketten oder gefalteten Kettenteilen.Seide - reine Faltblattstruktur (fast nur Gly, Ser, Ala) - an jeder 2. Position Gly - Ketten parallel zur FaserachseKollagen - häufigstes Proteïn in Wirbeltieren (Haut, Knochen, Knorpel) - spezielle Helixstruktur - mechanisch stark beanspruchbar - denaturiertes Kollagen » GelatineTertiärstruktur 3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur. Stabilisierung durch Disulfidbrücken: Abbildung 4 : Tertiärstruktur (3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur)1 Aminosäuren -9-
  7. 7. BiochemieDisulfidbrücken Besonders wichtig bei kleinen Polypeptiden (s. Anfinsen-Experiment), da Struktur stabilisierend (Insulin,Chymotrypsin, Trypsin, α-Keratin (Haar))Wasserstoffbrücken Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen schwach acidem Donor und schwach basischem Akzeptor im Inneren desProteïns: a) zwischen Peptidbindungen (α-Helix, β-Faltblatt) b) zwischen Seitenketten der einzelnen AS und an der Oberfläche mit Wasser. Wechselwirkung mit Wasser ist energetisch günstiger.Ionische Wechselwirkungen Relativ geringe Bedeutung für die Struktur, da meist an Enzymoberfläche → hauptsächlich Wechselwirkungen mit dem LösungsmittelHydrophobe Wechselwirkungen AS mit unpolaren Seitenketten: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro - Versuch den Kontakt mit H2O zu vermeiden - intramolekulare Gruppierung / Ausschluss von H2O - hydrophobe AS innen, hydrophile außen (dadurch gute H2O-Löslichkeit)Anfinsen-Experiment Untersuchung der Gründe für die Ausbildung einer Tertiärstruktur globulärer Proteïne. Ausgangsmaterial: RNAse: 124 AS, 4 S-S-Brücken Denaturierung in 8 M Harnstoff und Reduktionsmittel → Spaltung der Disulfidbrücken 1. Erst oxidiert und dann Harnstoff entfernt → falsche zufällige Renaturierung (keine Enzymaktivität) 2. Erst Entfernung des Harnstoffs (partielle Renaturierung) → richtige Faltung und richtige Disulfidbrücken (Enzymaktivität) Ergebnis: Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer Proteïne. Abbildung 5 : Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer ProteïneDomänen Proteïne bestehen oft aus mehreren Faltungseinheiten, die als Domänen bezeichnet werden. -10-
  8. 8. Biochemie Abbildung 6 : Domänen bei ProteïnenQuartärstruktur Anlagerung mehrerer Polypeptidketten (Untereinheiten) aneinander → polymere Proteïne Bindungen wie bei der Tertiärstruktur. z. B. Virenhüllen, Hämoglobin, Multiënzymkomplexe Abbildung 7 : Anlagerung mehrerer Polypeptidketten aneinander (Quartärstruktur)Analyse von Proteïngemischen Probleme: - Vorkommen oft in sehr kleinen Mengen (1 % vom Trockengewicht, Peptidhormone wie z. B. Insulin in noch kleineren Mengen) - Stabilität: labil gegen pH (Bsp.: LDH dissoziiert bei pH < 6 → Denaturierung) - Temperatur: kältelabil (z.B. F1-ATPase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase einiger Spezies), wärmelabil: die meisten Enzyme Um Substanzgemische aufzutrennen, kann man 5 Eigenschaften der Moleküle benutzen: 1. Molekülgröße 2. Elektrische Ladung 3. Absorptionsverhalten 4. Löslichkeit 5. AffinitätChromatographie Physikalisch-chemisches Verfahren zur analytischen und präparativen Trennung gelöster oder gasförmigerVerbindungen. Die chromatographische Trennung beruht darauf, dass eine mobile Phase über eine stationäre Phase wandert und dabeidie zu trennende Substanz mit unterschiedlicher Geschwindigkeit transportiert. -11-
  9. 9. Biochemie An der stationären Phase, dem Trägermaterial (z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Stärke, Zellulose, Silikonöl,Ionenaustauschern) tritt eine unterschiedliche Verteilung der zu trennenden Substanzen mit der mobilen Phase (meistorganische Lösungsmittel) auf.HPLC: (High Pressure Liquid Chromatography) Säulenchromatographie unter hohem Druck. Dadurch kann ein feineres Trennmaterial verwendet werden, bei dem dieDurchlaufzeit ohne Druck zu hoch wäre.MolekülgrößeZentrifugation (differentielle bzw. fraktionierte Zentrifugation) Voraussetzung: Molekulargewichtsunterschiede. Der Faktor S entspricht dabei der Sedimentationskonstante, ist also ein Maß für das Gewicht (ist aber auch abhängigvon der Form der Moleküle).Ultrazentrifugation (Dichtezentrifugation) Sedimentierung der Proteïne durch extreme Zentrifugation (bis 300.000 g). Träger: SuchrosegradientDialyse Durch Osmose werden mit Hilfe einer semipermeablen Membran kleine Moleküle aus der Lösung entfernt. Zurückbleiben nur die großen Moleküle (z.B. Proteïne).Ultrafiltration Durch Druck oder Zentrifugationskraft werden kleine Moleküle und Wasser durch eine semipermeable Membrangepresst.Gelfiltration (Gelchromatographie) Das Substanzgemisch läuft über eine Säule aus stark hydratisiertem, polymeren Material wie z. B. Sephadex(Polysaccharid-Derivat), BioGel (Polyacrylamid-Derivat) oder Agarose (Polysaccharid). Die Gelpartikel werden mit verschieden großen Poren hergestellt. Die Substanzen mit unterschiedlicher Größe dringen mit unterschiedlichem Maße in die Gelpartikel ein. GroßeSubstanzen laufen daher schneller durch die Säule als kleine Substanzen. Abbildung 8 : Gelfiltration (Gelchromatographie)Elektrische LadungIonenaustauschchromatographie (Ionenaustauscher) Das in der Säule befindliche Trägermaterial ist in der Lage, einen Teil der an austauschaktiven Gruppen gebundenenIonen gegen andere Ionen reversibel zu tauschen.Trägermaterial ● Sulfoniertes Polystyrol ● Polyacrylamid ● Zellulose ● andere Zucker (Dextrane ≡ „Sephadex“)Kationenaustauscher CM (Carboxymethyl / schwach sauer): R-CH2-COO- Sulfonyl: RSO3H + NaCl → RSO3Na + HCl -12-
  10. 10. BiochemieAnionenaustauscher DEAE (Diethylaminoethyl / schwach basisch): R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+OH- + NaCl → R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+Cl- + NaOH Das im Austauscher verbleibende Substanzion kann durch Elution (Lösen) mit geeigneten Ionen, je nachDissoziationskonstante, abgelöst werden (z. B. durch pH-Gradiënten / Ionenstärkegradiënten).Elektrophorese Bewegung elektrisch geladener Teilchen im elektrischen Feld. Die negativ geladenen Teilchen wandern dabei zurAnode und die positiv geladenen zur Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt vom Verhältnis Masse/Ladung ab.Hochspannungs-Trägermaterial 1. Papier 2. KieselgelplatteNiederspannungs-Trägermaterial 1. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) 2. Zelluloseacetat-FolienIsoelektrische Fokussierung Durch den isoelektrischen Punkt (IEP) lassen sich Proteïngemische auftrennen (s.a. isoelektrische Fällung). InVerbindung mit einer Elektrophorese wandern die Proteïne im elektrischen Feld. Dabei ist der pH-Gradiënt im Gel vonBedeutung: Die Proteïne wandern bis zu der Stelle, wo der pH-Wert ihrem IEP entspricht. Da sie an diesem Punkt keineLadung mehr tragen, können sie nicht weiterwandern.AbsorptionsverhaltenAdsorptionschromatographie Die Trennung erfolgt über eine Säule, auf die die Substanzmenge gegeben wird. Der obere Teil der Säule adsorbiert nundie Substanzmenge. Durch Zugabe von Lösungsmittel wird die Substanz wieder gelöst und fließt in der Säule ein kleinesStück weiter, bis sie erneut adsorbiert wird. Dieser Vorgang wiederholt sich kontinuierlich, wodurch es durch dieunterschiedlichen Adsorptionsverhalten der verschiedenen Stoffe zu einer klaren Trennung der Substanzmenge kommt.Durch die Zugabe entsprechender Mengen an Lösungsmittel können die einzelnen Fraktionen des Eluats in einemFraktionssammler entnommen werden.LöslichkeitAussalzen z. B. Fällung (fraktioniert) mit Ammoniumsulfat (bis 3 M löslich in Wasser) ● zunächst Anstieg der Löslichkeit des Proteïns bei Zugabe von Salz → Einsalz-Effekt ● bei hoher Salzkonzentration → Aussalz-Effekt (Lösungsmittel reicht nicht mehr aus, Proteïne fallen nacheinander aus und werden abzentrifugiert)Fällung Aceton-Fällung und Ethanol-Fällung; durch niedrige Diëlektrizitätskonstante wird die Solvatationskraft des Wassersherabgesetzt, die Proteïne fallen aus. Aber: Fällung normalerweise bei niedrigen Temperaturen → Limitierung bei kältelabilen ProteïnenIsoelektrische Fällung Am isoelektrischen Punkt (IEP) ist die Zahl der positiven Ladungen im Proteïn gleich der Zahl der negativen Ladungen.Bei diesem pH-Wert ist die Löslichkeit des Proteïns minimal. Durch die Veränderung des pH-Wertes können Proteïne mitunterschiedlicher Ladungsverteilung nacheinander abgetrennt werden.Verteilungschromatographie Wie bei der Adsorptionschromatographie wird auch hier in einer Säule gearbeitet. Als Adsorptionsmittel dienenKieselgur, Zellulosepulver, Stärke oder Glaspulver, die mit Wasser befeuchtet werden. -13-
  11. 11. Biochemie Das zu trennende Substanzgemisch wird gelöst und auf die Säule gegeben. Mit einem organischen Lösungsmittel wirddas Substanzgemisch langsam durch die Säule gespült. Eine Trennwirkung kommt dabei nicht durch die Adsorption derSubstanzen an dem Trägermaterial zustande, sondern durch das Eindringen der Stoffe in den Wasserfilm auf derOberfläche des Trägers. Dabei verteilen sich die Substanzen zu einem bestimmten Verhältnis in den beiden Phasen. Substanzen, die in organischen Lösungsmitteln leichter löslich sind als in Wasser, wandern schneller durch die Säule alsleicht wasserlösliche Substanzen.Gaschromatographie Das Substanzgemisch wird verdampft und mit einem inerten Trägergas (Helium, Argon oder Stickstoff) durch einlanges, dünnes Rohr geleitet. Die einzelnen Komponenten des Gasgemisches lösen sich mehr oder weniger gut in derstationären Phase (Flüssigkeitsfilm auf der Innenseite des Rohrs) und können somit am Ende der Säule nach kürzerer oderlängerer Strömungszeit nachgewiesen werden.Papierchromatographie Sie ist eine Verteilungschromatographie, die Trennwirkung beruht auf unterschiedlicher Löslichkeit der Substanzmengein dem Lösungsmittel. Das Lösungsmittel-Substanzgemisch steigt durch Kapillarkräfte auf. Während des Vorgangs kommt es zur Bildungzweier Laufmittelphasen (eine hydrophile und eine hydrophobe Schicht). Durch die Wechselwirkung zwischenhydrophilem Trägermaterial und hydrophilem Laufmittel wandert der hydrophobe Teil des Substanzgemisches schnellerund weiter hinauf. Als stationäre Phase dient dabei mit Wasser getränktes Filterpapier. Die Auftrennung (Entwicklung) erfolgt in einer gutverschlossenen Chromatographieapparatur.Dünnschichtchromatographie Als Trennschicht verwendet man oft Kieselgel, Kieselgur und Aluminiumoxid, das mit Wasser unter Zusatz von Gipsals dünnflüssige Suspension auf eine rechteckige Glas- oder Kunststoffplatte aufgetragen wird. Die Auftrennung(Entwicklung) erfolgt in einer gut verschlossenen Chromatographieapparatur. Das Trennverfahren läuft wie bei der Papierchromatographie ab, jedoch sind die Zeitersparnis und eine empfindlichereAuftrennung Vorteile der Dünnschichtchromatographie. Bei der 2D-Dünnschichtchromatographie wird nach Abschluss des ersten Laufes (a.) die Platte um 90° gedreht und einzweiter Lauf (b.) in einem anderen Fließmittel durchgeführt. Abbildung 9 : Eindimensionale DC (links) und 2D-DC (rechts)AffinitätAffinitätschromatographie: Die Proteïne können gezielt aus einem Proteïngemisch isoliert werden. Das Prinzip basiert auf der Fähigkeit derProteïne, bestimmte Moleküle (Liganden) spezifisch zu binden. Dabei dient als Säulenmaterial z.B. das PolysaccharidAgarose, an dessen Oberfläche die Liganden chemisch gebunden werden. Wird die Proteïnmischung nun auf die Säulegegeben, so bleibt nur das dem Liganden entsprechende Proteïn hängen, der Rest fließt nach Zugabe von Pufferlösungdurch die Säule hindurch. Das gewünschte Proteïn kann dann durch Zugabe einer hohen Konzentration des Liganden inlöslicher Form von dem Trägermaterial eluiert werden. Dadurch besteht mit dieser Methode die Möglichkeit, bestimmteProteïne extrem hoch zu reinigen. -14-
  12. 12. Biochemie Abbildung 10 : Prinzip der AffinitätschromatographieGruppenspezifische Affinitätschromatographie z.B. AMP-Säulen zur Reinigung von NAD-abhängigen ProteïnenHochspezifische Affinitätschromatographie z.B. Reinigung von Antikörpern, SubstratsäulenNachweis mit Ninhydrin Formel 7 : Aminosäurenachweis mit NinhydrinBestimmung der Aminosäuresequenz Erste vollständige AS-Sequenz 1953 am Rinder-Insulin durch Frederick Sanger. Warum ist das Wissen über die AS-Sequenz wichtig? ● Aufklärung der Kristallstruktur ● Verständnis molekularer Mechanismen ● Vergleich anderer Proteïne → Hinweise auf Funktion / evolutionäre ZusammenhängeVersuchsplan 1. Bruttozusammensetzung der AS (Aminosäureanalyse) 2. Bestimmung der Endgruppen (Hinweis auf verschiedene Polypeptidketten) 3. Trennung in Einzelketten 4. Spaltung der Polypeptidketten in kleine Fragmente 5. Sequenzierung der kleinen Fragmente 6. Wiederholung von 4. unter Bildung anderer Fragmente → Überlappungsfragmente -15-
  13. 13. Biochemie 7. Zuordnung der Disulfid-Gruppen innerhalb oder zwischen UntereinheitenAminosäureanalyse Zur Analyse wird eine Totalhydrolyse unter sauren und/oder basischen Bedingungen durchgeführt.Sauer Erhitzen der Polypeptide in Gegenwart eines Überschusses an 6 N HCl bei 100 – 120 °C für 10 – 100 Stunden in einemevakuierten, unter Vakuum zugeschmolzenen Röhrchen ist die normale Methode der Totalhydrolyse. Unter diesenBedingungen findet keine Razemisierung und keine O 2-Oxidation statt. Für die Freisetzung von Val, Leu, Ile sind langeZeiten erforderlich. Nachteil: - teilweise Zerstörung von Ser, Thr, Tyr - weitgehende Zerstörung von Trp - aus den Amid-Gruppen von Asn und Gln entstehen Carboxylgruppen und Ammoniumionen, die in die Messung von Glu und Asp mit eingehenBasisch Durch Kochen der Peptide in 2 – 4 M NaOH bei 100 °C für 4 – 8 h kann Trp getrennt bestimmt werden. Nachteil: - Zerstörung von Cys, Ser, Thr, Arg - andere AS werden teilweise desaminiert und racemisiert Vorteil: - liefert die Trp-WerteEndgruppenbestimmung Die Endgruppen geben Hinweise auf unterschiedliche Polypeptidketten. So besteht z.B. Insulin aus 2 AS-Ketten, dieüber 2 Disulfidbrücken verbunden sind. Es ergeben sich also 2 Aminosäuren vom C-Terminus und 2 vom N-Terminus.N-TerminusPrinzipien: Sanger / Dansylierung Abbildung 11 : Sanger / Dansylierung a) AS-Kette b) Markierung c) Hydrolyse → einzelne AS Edman-Abbau a) AS-Kette, Markierung, Hydrolyse → AS-Kette + 1 AS b) Erneuter Ablauf Abbildung 12 : Edman-Abbau -16-
  14. 14. BiochemieSanger-Reaktion (1945) Formel 8 : Sanger-Reaktion Reaktion der freien α-Aminogruppe der Proteïne mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) unter Bildung von gelben 2,4-Dinitrophenyl-Derivaten. Durch die Hydrolyse der so entstandenen Peptide mit 6 N HCl werden alle Peptidbindungen gespalten. Es bleibt alsoals einzige farbige Verbindung das 2,4-Dinitrophenyl-Derivat mit der N-terminalen Aminosäure übrig, welches abgetrenntund durch chromatographischen Vergleich (2D-Dünnschichtchromatographie) mit bekannten 2,4-Dinitrophenyl-Derivatender einzelnen AS identifiziert werden kann. Problem: Nukleophile AS-Seitenketten können ebenfalls reagieren.Dansylierung Formel 9 : Dansylierung Statt dem DNFB wird Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) als Markierungsreagenzverwendet. Nach der Hydrolyse können die Dansyl-Derivate durch deren fluoreszierenden Charakter bestimmt werden.Diese Methode ist 100 mal empfindlicher als die Methode von Sanger.Edman-Abbau Formel 10 : Edman-Abbau Großer Vorteil des Edman-Abbaus: Der Rest der AS-Kette bleibt nach der Abtrennung der terminalen AS intakt undkann daher weiter untersucht werden. Somit kann das Proteïn Schritt für Schritt abgebaut werden. Das entstandenePhenylthiohydantoin (PTH) wird über die Gas-Chromatographie (oder HPLC) getrennt und bestimmt. Dieser Vorteil wurde benutzt, um einen „Sequenator“ (Solid-Phase) zu bauen. Dieses Gerät führt die AS-Bestimmungautomatisch durch und bestimmt die entstehenden PTH-Derivate im Anschluss durch Chromatographie. -17-
  15. 15. BiochemieC-TerminusHydrazinolyse (Akabori-Reaktion) Formel 11 : Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion) Alle Peptidbindungen werden durch Umwandlung der AS in Hydrazide gespalten. Es liegen daher nur nochAminosäure-Hydrazide vor. Einzige Ausnahme dazu ist die AS des C-terminalen Endes der ursprünglichen Proteïnkette.Sie besitzt als einzige noch eine Carboxylgruppe und kann als freie Säure leicht chromatographisch identifiziert werden.Reduktion der AS durch Lithiumborhydrid zum entsprechenden α-Aminoalkohol. Nach der Hydrolyse kann dieser Alkoholchromatographisch identifiziert werden.Abspaltung der C-terminalen AS durch Carboxypeptidase (eine Exopeptidase). Nachteil: das Enzym spaltet schnell die nächste AS ab.Trennung in Einzelketten (falls erforderlich) a) Entfaltung der AS-Kette durch Harnstoff → Aufhebung der Tertiär- und Quartärstruktur. b) Spaltung der S-S-Bindungen durch - Reduktion (z. B. NaBH4) - Umsetzung mit Jodacetat: Bildung von stabilen Derivaten (Carboxymethylcysteïn) R - SH + I - CH2 - COOH → R - S - CH2 - COOH + HI Formel 12 : Trennung mit IodessigsäureSpaltung in Fragmente (Partialhydrolyse) Zur späteren Identifizierung der Fragmente ist es wichtig, spezifische Spaltstellen zu erhalten. a) Bromcyan-Spaltung Spaltung der Peptidbindungen an denen ein Methionin beteiligt ist. Formel 13 : Bromcyan-Spaltung b) Enzymatische Spaltung durch Proteasen (Hydrolyse der Peptidbindungen) Peptidasen (= Exopeptidasen) spalten AS vom Ende ab 1. Carboxypeptidase (C-Terminus) 2. Aminopeptidase (N-Terminus) Proteïnasen (= Endopeptidasen) spalten an spezifischer Spaltstelle innerhalb der AS-Kette spaltet am C-terminalen Ende von Trypsin Lys, Arg Chymotrypsin Phe, Trp, Tyr Pepsin Phe, Trp, Tyr und verschiedene andere Tabelle 1 : Proteïnasen und ihre „Spaltstellen” -18-
  16. 16. Biochemie Thermolysin spaltet am N-terminalen Ende von Leu, Ile, Val Viele Proteasen werden als inaktive Vorstufen(Zymogene, Proënzyme) sezerniert und dann proteolytisch aktiviert. Beispiele: ● Bildung von Chymotrypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Chymotrypsin im Dünndarm durch Spaltung einer Arg-Ile-Bindung mittels Trypsin. ● Bildung von Trypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Trypsin im Darm durch Enteropeptidase oder Trypsin selbst (autokatalytische Aktivierung).Sequenzierung der Fragmente a) chemisch: ● Edman-Abbau b) physikalisch: ● FAB (fast atom bombardment) - Variante der Massenspektroskopie, bis 25 AS - bombardiert in Glycerol gelöste Peptide mit Ar- oder Xe-Atomen. - Fragmentieren in verschieden große Teilstücke - Vergleich zwischen Massen und Fragmenten → Sequenz Vorteil: - mehrere Peptide (Gemisch, Verunreinigungen) möglich - Untersuchung posttranslational veränderter Proteïne (z.B. blockierter N-Terminus) - sehr hohe Empfindlichkeit Nachteil: - hohe Gerätekosten c) enzymatisch: ● ExopeptidasenÜberlappungsfragmente Durch die Bildung weiterer, mit den bisherigen überlappender Fragmente kann auf die Sequenz des ganzen Proteïnszurückgeschlossen werden. Um andere Fragmente zu erhalten, wird die Spezifität der entsprechenden Enzyme geändert. Dadurch kommt es zu einer anderen Spaltung und zu anderen Überlappungsfragmenten.Spaltung am Beispiel von Trypsin a) normale Spaltstellen: Spaltung nach Lys und Arg b) weniger Spaltstellen: Blockierung von Lys → nur noch Spaltung bei Arg ● Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid: Formel 14 : Spaltung von Tripsin mit Bernsteinsäureanhydrid ● Reaktion mit Iodessigsäure: Lys - ( CH2 ) 4 - NH2 + I - CH2 COOH → Lys - ( CH2 ) 4 - NH - CH2 − COOH + HI Formel 15 : Spaltung von Tripsin mit Iodessigsäure c) mehr Spaltstellen: ● Umwandlung von Cysteïn in Pseudolysin, dadurch Spaltung nach Cysteïn, Lys und Arg: -19-
  17. 17. Biochemie Formel 16 : Umwandlung von Cysteïn in PseudolysinZuordnung der Disulfidbrücken 1. Carboxylierung der SH-Gruppen (mit Iodessigsäure) 2. Tryptische Verdauung ohne Reduktion der S-S-Brücken 3. Isolierung der vernetzten Peptide 4. Reduktion der S-S-Brücken (NaBH4 / pH 3) 5. Trennung der Oligopeptidketten in Gegenwart von Mercaptoethanol (Schutz der freien SH-Gruppen) 6. Sequenzierung der Einzelketten → Carboxymethylierte Cysteïne = frühere freie SH-Gruppen → freie SH-Gruppen = frühere S-S-Brücken -20-
  18. 18. BiochemieEnzyme / CoënzymeEnzymeWirkungsweise von Enzymen Enzyme sind meist Proteïne (seltener Ribonucleïnsäuren). ● Wirken als Katalysator ● Verändern nicht die Lage des Gleichgewichts ● Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G ● Ermöglichen milde Reaktionsbedingungen ● Fähigkeit zur Regulation ● Große Reaktionsspezifität Abbildung 13 : Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G Die Bindung der Substrate erfolgt am aktiven Zentrum durch ● ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen ● kovalente Zwischenstufen Abbildung 14 : Bindung der Substrate am aktiven ZentrumIsoënzyme Enzyme gleicher Funktion, die sich aber in ihrer Struktur und infolgedessen in manchen Eigenschaften voneinanderunterscheiden.Lactat-Dehydrogenase Tetramer aus 4 identischen Untereinheiten pro „Typ“. Der H-Typ dominiert im Herzmuskel, der M-Typ im Skelettmuskel und in der Leber. Diese Untereinheiten setzen sichzu verschiedenen Tetrameren (multiplen Formen) zusammen: H4, H3M, H2M2, HM3, M4 Der H4-Typ besitzt eine höhere Affinität zu Pyruvat als der M 4-Typ. Deshalb wird der H 4-Typ durch hohePyruvatkonzentrationen gehemmt (Substrathemmung). Diese homologen Enzyme sind durch Genduplikation entstanden: LDH-H4 (Mensch) — LDH-H4 (Schwein): höhere Homologie als: LDH-H4 (Mensch) — LDH-M4 (Mensch) -21-
  19. 19. BiochemieUnterschiede bei Chymotrypsin und TrypsinSubstratbindungszentrum Chymotrypsin benötigt eine aromatische oder eine sperrige unpolare Seitenkette auf der Aminoseite der abzuspaltendenPeptidkette. Die Nische (eine unpolare Tasche) ist dagegen bei Trypsin verändert (Aspartat statt Serin). Das Aspartat kann einestarke elektrostatische Bindung mit einer positiv geladenen Lysin- oder Argininseitenkette des Substrats eingehen. Abbildung 15 : Unterschiede bei Chymotrypsin und TrypsinKatalytische Triade von Trypsin Beispiel für kovalente Katalyse, Säure-Base-Katalyse, Deformation des Substrats. Beim Trypsin (und Chymotrypsin) bilden Histidin 57, Aspartat 102 und Serin 195 eine katalytische Triade, wodurch dieReaktionsfähigkeit von Serin gesteigert wird. Wirkungsweise: Nach Zugabe eines Substrats wird ein Proton vom Serin 195 auf das Histidin 57 übertragen und derImidazolring durch Aspartat 102 stabilisiert. Abbildung 16 : Katalytische Triade von TrypsinEinheiten der EnzymaktivitätDefinition der Enzymaktivität: 1 μmol Substratumsatz 1 Unit (U) = min Gleichung 1 : Absolute Enzymaktivität U / ml: Volumenaktivität U / mg Enzym: spezifische AktivitätSI-Einheiten: 1 mol Substratumsatz 1 Katal (kat) = s Gleichung 2 : Absolute Enzymaktivität kat / kg: spezifische Aktivität 1 U = 16,67 nkat -22-
  20. 20. BiochemieRegulation der EnzymaktivitätAktivierung von Vorstufen Viele proteolytische Enzyme liegen in einer inaktiven Form vor. Man bezeichnet sie als Zymogene oder Proënzyme.Die Aktivierung erfolgt durch die Hydrolyse einer oder mehrerer Peptidbindungen. In diese Gruppe fallen viele Verdauungs- und Blutgerinnungsenzyme. Beispiel: Zymogen des Trypsins = Trypsinogen N-terminales Hexapeptid wird abgespalten: Spaltstelle = Lys - Ile → Lys = natürliche Spaltstelle des Trypsins → Die Protease Enteropeptidase braucht nur wenig aktives Trypsin herzustellen, dann: → autokatalytische Aktivierung (Trypsin ist sein eigener Katalysator)Allosterische Regulation (z. B. Feedback-Inhibition) Allosterie ist die Erscheinung, dass Makromoleküle (insbesondere Proteïne) ihre Konformation und Aktivität ändern,wenn ein bestimmtes Molekül (ein Effektor - kann auch gleichzeitig Substrat oder Produkt sein) an das Makromolekülgebunden wird. Die Bindung erfolgt an einer separaten Effektorbindungsstelle außerhalb des aktiven Zentrums (AZ), waseine Konformationsänderung im AZ bewirkt und somit einen hemmenden (Effektor ist ein Inhibitor) oder aktivierenden(Effektor ist Aktivator) Einfluss ausübt. Die allosterische Hemmung unterscheidet sich dabei von der kompetitivenHemmung, bei der der Inhibitor im AZ selbst bindet, durch ihre Kinetik. Bei der Feedback-Hemmung treten Endprodukte einer Reaktionskette als Inhibitoren früherer Reaktionsschritte auf, umden Reaktionsweg abzuschalten. Beispiel: Regelung der ACTase bei der Pyrimidinbiosynthese, Hämoglobin etc.Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit): Abbildung 17 : Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit)Modelle zur Erklärung der Kooperativität bei oligomeren Proteïnen: a) „Symmetriemodel“ Alles-oder-Nichts-Umwandlung, kann aber nicht negative Kooperativität erklären! Voraussetzungen: - Es gibt für jede Untereinheit 2 mögliche Konformationszustände (T bzw. R) - Die Untereinheiten können immer nur in einer Form vorliegen, d.h. nur RR oder TT-Dimere, keine RT- Dimere! (T = „inaktiv“, R = „aktiv“) Abbildung 18 : Symmetriemodel b) „Sequenzmodel“ Voraussetzungen: - Es gibt für jede Untereinheit 2 mögliche Konformationszustände (T bzw. R) - Diese Konformationsänderung kann die Substratbindungsaffinität der anderen Untereinheiten erhöhen oder erniedrigen Abbildung 19 : Sequenzmodel -23-
  21. 21. BiochemieKovalente Modifikation Die Aktivität wird durch eine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines speziellen Serinrestes festgelegt.Beispiel: Phosphorylase-KinaseAssoziation - Dissoziation Es findet eine Regulation durch andere Proteïne statt. Manche Enzyme werden aktiv, wenn der Ca 2+-Spiegel in der Zellesteigt. Das entsprechende Regulatorproteïn ist das Calmodulin; es bindet im Calcium-beladenen Zustand an die Proteïneund aktiviert sie dadurch. Regulation in Form von Abbau (Proteolyse) durch spezielle Proteasen. Regulation durch „de novo“-Synthese.HemmkinetikKompetitive Hemmung Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert ein Inhibitor mit dem Substrat um die Bindung an das aktive Zentrum. Dies verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz, wodurch die Hemmung durch eine hohe Substratkonzentrationausgeglichen werden kann. Abbildung 20 : Kompetitive HemmungUnkompetitive Hemmung Hier bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex, nicht aber an das freie Enzym. Der ternäre Komplex ESI istnicht produktiv. Abbildung 21 : Unkompetitive HemmungNicht-kompetitive Hemmung Die Bindung des Inhibitors erfolgt allosterisch, d.h. an einem anderen Zentrum (nicht dem aktiven Zentrum) desEnzyms. Der Inhibitor verändert das aktive Zentrum, daher ergibt sich eine kleinere oder keine Aktivität. Der ternäreKomplex ESI ist nicht produktiv. Abbildung 22 : Nicht-kompetitive Hemmung -24-
  22. 22. BiochemiePartiell nicht-kompetitive Hemmung Wie die nicht-kompetitive Hemmung, aber auch aus ESI Produktbildung möglich. Die Substrat- und allosterischeBindungsstelle überlappen teilweise. Abbildung 23 : Partiell nichtkompetitive HemmungDas Michaelis-Menten Modell Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentration Abbildung 24 : Das Michaelis-Menten ModellHerleitung der Michaelis-Menten-Gleichung k1 k3 E + S ↔ ES ↔ E + P k2 k4 k = Geschwindigkeitskonstante Gleichung 3 : Michaelis-Menten-Gleichung Für die Anfangsgeschwindigkeit spielt k4 keine Rolle und wird vernachlässigt. Weitere Annahme: [ S] >> [E] ⇔ S total ≈ S frei Dann gilt: ES - Bildungsrate = k 1 [E] [ S] ES − Zerfallsrate = k 2 [ES] + k 3 [ES] k 1 [E] [ S] = k 2 [ES] + k 3 [ES] Daraus folgert: k 2 + k 3 [ E ][ S ] KM = = k1 [ ES ] Gleichung 4 : Definition der Michaelis-Konstanten -25-
  23. 23. Biochemie [E] = [E ] T − [ES] freies Enzym Gesamtenzym Enzym−Substrat −Komplex → [ES] = [ S] ∗ [E T ] [ S] + K M ν 0 = k 3 [ES] ν max = k 3 [E T ] → ν 0 = k 3 [E T ] ∗ [ S] [ S] + K M ν 0 = ν max ∗ [ S] [ S] + K M Gleichung 5 : Ableitung von v0 Bei v0 = ½ vmax → 1 ν ν max = max [ S] → K = [ S ] 2 [ S] + K M M Gleichung 6 : Folgerung für v0 = ½ vmaxBestimmung der Konstanten KM und vmaxLineweaver / Burk Kehrwert der Michaelis-Menten-Gleichung: → lineare Darstellung möglich Abbildung 25 : Diagramm nach Lineweaver / BurkHanes [ S] ν0 [ S]Eadie / Hofstee ν0 ν0 [ S]Kinetik bei allosterischen Enzymen Allosterische Enzyme halten sich nicht an das Michaelis-Menten-Modell und zeigen oft eine sigmoide (S-förmige)Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration. -26-
  24. 24. Biochemie Abbildung 26 : Kinetik bei allosterischen EnzymenZwei- (oder Mehr-)Substrat-ReaktionenSingle Displacement a) random order +BE + A ↔ EA ←→ EAB E+C+D +AE + B ↔ EB ←→ EAB b) compulsory order + E + A ↔EA ← B →EAB →E + C + D  E + B ← →EB Double Displacement Pingpong-Mechanismus (siehe Fettsäure-Synthese)Coënzyme und prosthetische Gruppen Coënzyme sind Nicht-Eiweißverbindungen. Fast alle hier aufgeführten Substanzen enthalten ADP als Baustein! Die klassische Definition des Katalysators trifft aufCoënzyme nicht zu, da sie aktiv verändert werden und erst in einem 2. (ebenfalls enzymatischen) Schritt wieder ihreursprüngliche Form erhalten. Die prosthetische Gruppe ist eine Nicht-Eiweißverbindung, die fest (kovalent oder ionisch) an das Enzym gebundenist. Sie kann eventuell nur ein einfaches Ion sein, was jedoch benötigt wird, um die volle Kapazität des Enzymsherzustellen.Wasserstoffübertragende CoënzymeNicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP) Oxidierte Formen (NAD+ bzw. NADP+) Formel 17 : Oxidierte Form von NAD und NADP Wasserstoffaufnahme → reduzierte Formen (NADH bzw. NADPH) Formel 18 : Reduzierte Form von NAD und NADP -27-
  25. 25. BiochemieFlavin-Adenin-Dinucleotid (FAD) Formel 19 : FAD-Gleichgewicht FAD kann auch durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden.Flavinmononucleotid (FMN) - Wasserstoffaufnahme wie bei FAD (FMN → FMNH2) - prosthetische Gruppe bei der Elektronentransportkette Formel 20 : Flavinmononucleotid Auch FMN kann (wie FAD) durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziertwerden.Ubichinon (Coënzym Q) - 2 Ein-Elektronen-Übergänge mit radikalischer Zwischenstufe - Redoxsystem in der Atmungskette - n = 6 – 10 Formel 21 : Ubichinon-RedoxsystemPlastochinon - Redoxsystem in der Atmungskette - Wasserstoffaufnahme wie bei Ubichinon - n=9 Formel 22 : Plastochinon -28-
  26. 26. BiochemieLiponsäure - Wasserstoff-Übertragung bei der oxidativen Decarboxylierung in Form von Liponamid (enzymgebunden): Formel 23 : Liponsäure-SystemGruppenübertragende CoënzymeAdenosintriphosphat (ATP) - Energieträger biochemischer Reaktionen - Liegt normalerweise in Metallkomplexen (Mg2+) vor - Freisetzung von Energie durch Hydrolyse der Anhydrid-Bindungen Formel 24 : Adenosintriphosphat (ATP) und Mg-KomplexVergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse kJ / mol kcal / mol Phosphoenolpyruvat (PEP) -61,9 -14,8 Carbamoylphosphat -51,5 -12,3 1,3-Bisphosphoglycerat -49,4 -11,8 Acetylphosphat -43,1 -10,3 Creatinphosphat -43,1 -10,3 Pyrophosphat -33,5 -8,0 ATP → ADP, Pi -30,5 -7,3 Glucose-1-Phosphat -20,9 -5,0 Glucose-6-Phosphat -13,8 -3,3 Glucose-3-Phosphat -9,2 -2,2 Tabelle 2 : Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse Durch seine Mittelstellung ist ATP als Phosphatgruppenüberträger geeignet. PEP kann wiederum einePhosphorylgruppe unter Bildung von ATP auf ADP übertragen.Pyridoxalphosphat (PLP) - Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6) - Die Aldehydgruppe dieses Coënzyms bildet eine Schiffsche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des Enzyms. - Bei Phosphorylase fungiert PLP wahrscheinlich als Säure-Base-Katalysator (Protonenakzeptor und -donator). Hauptfunktion ist die Aktivierung der verschiedenen Bindungen am C α von Aminosäuren (z. B. bei Transaminierung). -29-
  27. 27. Biochemie Formel 25 : Pyridoxalphosphat (PLP)Coënzyme für C1-TransferTetrahydrofolat (THF) (siehe „Biosynthese von Makromolekülen“) Formel 26 : Tetrahydrofolat (THF)S-Adenosylmethionin (siehe „Biosynthese von Makromolekülen“) Formel 27 : S-AdenosylmethioninBiotin - Beteiligung am Carboxyltransfer - Isolierung als Vitamin H aus Leberextrakten - Inaktivierung durch Bindung an Avidin (Proteïn des Eiklars) - peptidartige Bindung an Lysinrest → prosthetische Gruppe Formel 28 : Biotin und Carboxy-Biotin-Enzym -30-
  28. 28. BiochemieCoënzyme für C2-TransferCoënzym A Formel 29 : Coënzym A Übertragung von Resten der Carbonsäuren bei Acetyl-CoA: R = CH3 Formel 30 : Bildung von Acetyl-CoAThiamin-Pyrophosphat (TPP) Decarboxylierung von Pyruvat Enthält Vitamin B1 (Thiamin) Formel 31 : Thiamin-Pyrophosphat (TPP)Coënzyme der Isomerasen und LyasenCobalamin - Radikalische Umlagerungen von Funktionellen Gruppen (-COO-, -NH3+) - Methylgruppenübertragung Formel 32 : Cobalamin -31-
  29. 29. BiochemieHämoglobin / MyoglobinKooperativität Die Veränderung (Erhöhung/Erniedrigung) der Bindungsaffinitäten der Untereinheiten eines oligomeren Proteïns zukleinen Molekülen (wie hier zum Sauerstoffmolekül) durch die Bindung dieser Moleküle an benachbarte Untereinheitenbezeichnet man als (positive / negative) Kooperativität.Hämoglobin (Hb) Das Hämoglobin kommt in den Erythrocyten vor und übernimmt den Sauerstofftransport im Blut. Es besteht aus demProteïn Globin und der prosthetischen Gruppe Häm. Das Häm ist der Eisenkomplex eines Porphyrins (desProtoporphyrins IX). Das Fe(II) im Molekül wird durch die hydrophobe Umgebung gegen Oxidation geschützt. Formel 33 : Hämoglobin (Hb)Aufnahme von Sauerstoff durch das Häm Im Häm kann das Eisen unter Ausbildung einer sechsten (koordinativen) Bindung Sauerstoff reversibel binden. DasEisen verändert dabei nicht seine Ladungszahl, sondern Salzbrücken zwischen den Untereinheiten α1 und β1 brechen auf.Dadurch können die nachfolgenden Sauerstoff-Moleküle leichter gebunden werden (positive Kooperativität). Es entstehtOxyhämoglobin. Jedes Hämoglobin kann daher 4 Sauerstoff-Moleküle aufnehmen. Im Desoxyhämoglobin liegt das Eisenatom etwa 0,04 nm außerhalb der Hämebene. Bei der Oxygenierung bewegt sichdas Eisenatom in die Hämebene hinein (d.h. das proximale His verschiebt sich), um mit dem Sauerstoff eine feste Bindungeinzugehen. Abbildung 27 : Oxygenierung von Hämoglobin Durch diese Verschiebung wird eine H-Brücke zwischen Asp-94 und His-146 aufgebrochen, und Protonen werden frei(s. Bohr-Effekt).Wirkung von Bisphosphoglycerat 2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) hat eine wichtige Rolle bei der Regulation der Sauerstoffaufnahme. DasDesoxyhämoglobin kann ein Molekül BPG binden; die negativ geladenen Phosphatgruppen treten mit positiv geladenenGruppen von Histidin und Lysin in Wechselwirkung, wodurch die Raumstruktur so stark verändert wird, dass dieSauerstoffaffinität stark sinkt. Bei der Sauerstoffbeladung wird das BPG wieder abgegeben. Befindet sich im Blut nur eine geringe Menge an BPG, soenthält ein Teil des Desoxyhämoglobins kein BPG und bindet den Sauerstoff entsprechend fester. Daher kann derSauerstoff dann nicht in den zu versorgenden Geweben abgegeben werden und das Hämoglobin erfüllt seineTransportfunktion nicht.Abhängigkeit der Sättigung vom O2-Partialdruck Bei der Beladung des Hämoglobins wird der hohe Sauerstoffpartialdruck der Lunge ausgenutzt, um Sauerstoff zubinden und in die Bereiche mit geringerem Sauerstoffpartialdruck zu transportieren. -32-
  30. 30. Biochemie Abbildung 28 : Abhängigkeit der Sättigung vom O2-PartialdruckBohr-Effekt Der Bohr-Effekt ist die nach dem dänischen Physiologen benannte Sauerstoffaustreibung aus dem Oxyhämoglobindurch Kohlendioxid, d.h. das Vorliegen einer höheren Konzentration an CO 2 und H+-Ionen in einem stoffwechselaktivemGewebe erleichtert die Freisetzung von O2. Abbildung 29 : Bohr-Effekt Die Aufnahme von O2 in der Lunge, durch die Protonen freigesetzt werden, hat dabei die Austreibung von CO 2 zurFolge. Auf molekularer Ebene kommt es beim Übergang von Oxy- zu Desoxyhämoglobin zu einer Verschiebung des Asp-94 in die Nähe des His-146. Durch die Erhöhung der lokalen negativen Ladung wird der pK-Wert von His-146 erhöht, d.h.die Wasserstoffaffinität nimmt zu: Es kommt leichter zur Aufnahme von H+.Fötales Hämoglobin Der Fötus besitzt einen eigenen Hämoglobin-Typ, das Hämoglobin F (α2γ2) welches sich von dem der Erwachsenenunterscheidet. Hämoglobin F bindet BPG schwächer und besitzt daher eine höhere Sauerstoffaffinität als Hämoglobin A. Daher kannO2 vom mütterlichen Hämoglobin A auf das Hämoglobin F des Fötus übertragen werden.Myoglobin (Mb) Das Myoglobin bindet ebenfalls den Sauerstoff durch das Häm. Es transportiert und speichert ihn jedoch in derMuskelzelle und zeigt als Monomer keine Kooperativität. -33-
  31. 31. BiochemieChemische Modifizierung von ProteïnenZweck: ● Bestimmung katalytisch relevanter AS ● Veränderung der Proteineigenschaften (durch Veränderung der Oberfläche) a) Ladungsveränderung b) hydrophobe Oberfläche ● Quervernetzung mit bifunktionellen Gruppen a) Abstandsmessungen im AZ (zwischen katalytisch relevanten AS) b) Verknüpfung von Untereinheiten α: zur Stabilisierung des Proteïns β: Bestimmung der Geometrie des Aufbaus aus der Verteilung der Quervernetzungsprodukte c) Lokalisierung relativ zu anderen Proteïnen(in der Membran, in Multienzymkomplexen, im Aufbau des Ribosoms)Welche AS-Seitenreste können reagieren? In allen Fällen werden elektrophile Reagenzien benötigt, (bei -COOH nur, wenn –COO-, sonst eventuell Nukleophile) Abbildung 30 : Reaktionsfähige AS-SeitenresteProbleme: - Kann überhaupt eine Seitenkette selektiv modifiziert werden? (z.B. bei LDH eine von 5 SH-Gruppen oder oft eine von mehr als 20 Lys-NH2-Gruppen) - Sterische Zugänglichkeit:: Besondere Reaktivität durch spezifischen pK-Wert durch Nachbargruppen → kinetische Kontrolle (z.B. Lys-NH2 normal pK = 11; im AZ Teile mit pK = 8)Wahl des Reagenz: - Spezifität - reversible Reaktion? - milde ReaktionsbedingungenBestimmung des Einbaus: - Farbige Reagenzien - Radioaktive Markierung (3H, 14C, 35S...)Bestimmung katalytisch relevanter AS: Korrelation der Aktivität mit dem Einbau: → Probleme: Trotz 1:1-Relation kann es zu allosterischen Effekten kommen. → Bsp.: Bei der Modifizierung der „essentiellen SH-Gruppe“ bei der LDH wird eine Seitenkette verschoben, an die ein „essentielles His“ geknüpft ist → Verlust der Aktivität!Identifizierung der Art der modifizierten AS: z. B. durch die pH-Abhängigkeit (der pK-Wert von 6,5 deutet eventuell auf His) -35-
  32. 32. BiochemieUnspezifische ReagenzienIodessigsäure: Formel 34 : Umsetzung mit IodessigsäureIodacetamid Formel 35 : Umsetzung mit IodacetamidAcet(yl)imidazol: (bei His, Cys Produkte instabil) Formel 36 : Umsetzung mit Acet(yl)imidazolGruppenspezifische ReagenzienLys-NH2 Imidoester: (entsteht aus: R-CN + MeOH / HCl) Formel 37 : Umsetzung mit Lys-NH2Tyr-OH Tetranitromethan: Formel 38 : Umsetzung mit Tyr-OH Alternativ: Umsetzung mit Diazoniumsalzen → AzofarbstoffeCys-SH Maleïnimide, z. B. N-Ethylmaleïnimid: Formel 39 : Umsetzung mit Cys-SH Umsetzung auch mit Lys bei pH = 6,5 - 7, Geschwindigkeit aber 1000mal langsamer. -36-
  33. 33. BiochemieSerin-OH Diisopropylfluorophosphat: Parathion (E 605) wirkt analog: Formel 40 : Umsetzung mit Serin-OHTryptophan Sulfenylchlorid (Koshland-Reagenz): Reaktion auch mit Cys-SH, das „reversibel“ geschützt werden muss. Formel 41 : Umsetzung mit TryptophanArginin Butandion (Diacetyl): Formel 42 : Umsetzung mit ArgininAspartat, Glutamat: Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) Formel 43 : Umsetzung mit Aspartat, GlutamatReagenzien zur Änderung der Ladung Abbildung 31 : Reagenzien zur Änderung der Ladung -37-
  34. 34. BiochemieHydrophobisierung von Enzymen Abbildung 32 : Hydrophobisierung von EnzymenReversible ReagenzienHistidin Abbildung 33 : Reversible Reagenzien (Histidin)Cysteïn a) b) c) Ellman’s Reagenz Formel 44 : Ellmans ReagenzActive-Site Labeling Formel 45 : Active-Site LabelingSuizid-Substrate Werden am aktiven Zentrum reaktiv. -38-
  35. 35. Biochemie Formel 46 : Suizid-SubstratePhotoaffinity-Label Formel 47 : Photoaffinity-LabelBifunktionelle ReagenziënKriterien für die Anwendung a) Abstandsmessungen (im AZ) starr - spezifisch für bestimmte Aminosäuren - für Reste eventuell unterschiedlich spezifisch b) Lokalisierung von „Nachbarn“; kovalente Verbindungen von Untereinheiten - flexibel - unspezifischReagenz von Zahn Formel 48 : Reagenz von Zahn, o,p- aktiviert für nucleophile Substitution des FluorHugo Fasold Probleme: -39-
  36. 36. Biochemie - viele Produkte - Reaktion nur an Rest A oder nur an Rest B - Quervernetzung zwischen A und B - weitere Reste können entsprechend reagieren - bei asymmetrische Reagenzien kann u.U. die eine oder die andere Seite mit Rest A reagieren Beispiel: Stufenweise Reaktion: Belichtung nach Entfernung des nicht umgesetzten Überschusses durch z.B. Dialyse oder Gelchromatographie. Aktivierung einfach durch pH > 8,5 nach Reaktion mit –SH und DialyseSemireversible Reagenzien Formel 49 : Semireversible ReagenzienTrägergebundene EnzymeVorteile ● Erhöhte Stabilität (z.B. Proteasen, Schutz vor Selbstverdauung) ● WiedergewinnungProbleme ● Zugänglichkeit des AZ ● Kinetik: Diffusionsprobleme: Spezifische Aktivität kleiner als im löslichen Enzym, auch wenn Zugang zum AZ frei, denn nach Teilverdau des Trägers steigt die spezifische Aktivität bis zum Normalwert ● Reaktion an der richtigen UE -40-
  37. 37. BiochemieArten der Verknüpfung ● kovalent ● Adsorption ● Einschlussverbindungen ● Aggregation Kovalente Bindung an welche AS? - Keine seltenen, da diese oft katalytisch relevant - Schutz des AZ durch Komplexe (LDH: NAD+ / Oxalat) - z.B. direkt an BrCN-aktivierte Agarose: - (dargestellte Reaktion verläuft über Spacer + R-COOH, es geht auch mit Lys-NH 2) - Bifunktionelle Reagenzien: Müssen erst mit Enzym reagieren und nur das "aktive", modifizierte an Träger binden! - Adsorption an: poröses Glas / Ti02 / Collagen - Einschlussverbindungen: z.B. Copolymerisation (Acrylamid mit Bisacrylamid) - Chemische Aggregation: z.B. durch bifunktionelle Reagenzien -41-
  38. 38. BiochemieLipideAllgemeine Übersicht Abbildung 34 : Lipide, allgemeiner ÜberblickFette Fette bestehen in der Regel aus Glycerin und 3 Fettsäuren, z.B. die unten abgebildeten. Für die Bezeichnung der Fettsäuren verwendet man eine Kurzschreibweise, bei der die Zahl der C-Atome und die Zahlder Doppelbindungen angegeben werden. Formel 50 : Verschiedene FettsäurenGlycolipide Sie enthalten kein Phosphat, sondern stattdessen einen Mono- oder Oligosaccharidrest, der meist mit Sphingosin (oderGlycerin) verknüpft ist und den hydrophilen Anteil bildet.Glyceringlykolipide: 1.2-Diacylglycerin und ein Mono- oder Oligosaccharid in 3-Stellung des Glycerins glycosidisch gebunden.Sphingosinglykolipide: Als Sphingolipide enthalten sie als zentralen Baustein statt des 3-wertigen Alkohols Glycerin einen Aminodialkohol,das Sphingosin, welches ein C18-Molekül mit einer trans-Doppelbindung ist. Durch Amidbildung mit einer Fettsäure kommt es zu Ceramiden, deren Glycoside die neutralen Glycosphingolipidesind. Formel 51 : Sphingosinglykolipide -43-
  39. 39. Biochemie Einfachste Vertreter: Cerebroside. Bei den Cerebrosiden des Gehirns meist Galactose, bei Leber und Milz meistGlucose. Formel 52 : Ein CerebrosidPhospholipideGlycerinphospholipide Phosphodiëster; die Phosphorsäure ist einerseits mit einem Sphingosin- oder Glycerinderivat (meist Diacylglycerin),andererseits mit Cholin, Ethanolamin, Serin, Inosit oder Glycerin verestert. Formel 53 : Phosphatidylcholin (Lecithin)Sphingosinphospholipide Sphingomyeline: In den Myelinscheiden vorkommende Sphingosinphospholipide, bei denen die endständigeHydroxygruppe des Ceramids (s.o.) mit Phosphorylcholin verestert ist. Formel 54 : Ein SphingomyelinIsoprenoidlipide Die Steroide und Terpene gehören zu dieser Stoffklasse und werden wegen ihrem ähnlichen Lösungsverhalten zu denLipiden gerechnet.SteroideCholesterin Das Cholesterin leitet sich vom Cyclopentanoperhydrophenanthren ab, welches auch als Steran bezeichnet wird. Durchdie OH-Komponente liegt Cholesterin als Alkohol vor (engl.: Cholesterol). Cholesterin verleiht der Membran Starrheit undschließt auftretende Löcher. Formel 55 : Sterangrundgerüst, Cholesterin -44-
  40. 40. BiochemieTerpene Zu dieser Stoffklasse gehören die Carotine und die Xanthophylle, die hier aber nicht weiter besprochen werden.BiomembranenMembranfunktion ● Geben den Zellen Individualität durch Abtrennung der Umwelt ● Bei Eukaryonten: Strukturierung von Zellorganellen durch interne Membranen Eukaryonten: Einzellige oder mehrzellige Organismen, die einen vom Cytoplasma durch eine Membran abgegrenzten Zellkern besitzen. Prokaryonten: Kein Zellkern. ● Kompartimentierung bestimmter Prozesse ● Extrem spezifische Permeabilitätsbarrieren ● Bewirken geordnete räumliche Anordnung bestimmter Enzyme zueinander (Reaktionsketten möglich) ● Enthalten Pumpen (molekulare), Rezeptoren (Hormone) zur Steuerung interner ProzesseBau der Membranen ● Keine kovalenten oder festen Strukturen, sondern eine „Flüssigkeitsschicht“, die durch Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel entsteht. ● Bestehen aus: Lipiden (v.a. Phospholipide, Glycolipide und Cholesterin) und Proteïnen Abbildung 35 : Membranen Die Flächen können Vesikel (kugelförmige Doppelschichten) bilden. Die Doppelschicht liegt nicht starr vor, sondern befindet sich ständig im Fluss, wobei die Proteïne ihre Positionenverändern können. Laterale Diffusion einfach, hochmobile Schicht. Transversale Diffusion (flip-flop) energetischungünstig. -45-
  41. 41. BiochemieMonosaccharideNomenklatur Abbildung 36 : Nomenklatur der Monosaccharide Aldose mit n C-Atomen: 2n-2 stereoisomere Formen Pentosen: n = 5 → 23 = 8 Isomere (4 L-Formen und 4 D-Formen) Hexosen: n = 6 → 24 = 16 IsomereFischer-Projektion - D-Zucker haben an ihrem carbonylfernsten Asymmetriezentrum die gleiche absolute Konfiguration wie D- Glycerinaldehyd - L-Zucker sind Spiegelbilder der D-ZuckerGlycerinaldehyd Formel 56 : Konfigurationen des GlycerinaldehydsEpimere: Zucker, die sich in der Konfiguration nur an einem C-Atom unterscheiden (z.B. Glucose / Mannose).Acetale und Ketale Acetale entstehen bei der Reaktion von Aldehydgruppen mit Alkoholen: Formel 57 : Reaktionsweg: Aldehyd zum Vollacetal Ketale entstehen bei der Reaktion von Ketogruppen mit Alkoholen. Formel 58 : Reaktionsweg: Ketogruppe zum Vollketal -47-
  42. 42. BiochemieSaccharose Formel 59 : SaccharoseZyklische Zucker5-Ring-Zucker Formel 60 : 5-Ring-Zucker6-Ring-Zucker Formel 61 : 6-Ring-ZuckerNucleotide Nucleoside: Zucker und eine Base Nucleotide: Zucker, Base und ein oder mehr PhosphatrestePurinbasen Formel 62 : PurinbasenPyrimidinbasen Formel 63 : Pyrimidinbasen -48-
  43. 43. BiochemieStoffwechsel Die grundlegenden Stoffwechselwege sind in den meisten Organismen identisch!Aufklärung durch ● Fütterungsversuche mit durch Isotopen markierten Substanzen ● Verwendung von Stoffwechselinhibitoren (Hemmstoffen) ● Verwendung von auxotrophen Mutanten (benötigen bestimmten Nährstoff für ihr Wachstum)Mutanten durch ● mutagene Substanzen ● Strahlung, z.B. Röntgenstrahlung ● molekularbiologische Methoden Ein Beispiel für die Wirkung von Mutanten ist die Arginin-Biosynthese im Harnstoff-Zyklus mit folgendenEnzymdefekten: Abbildung 37 : Mutanten bei der Arginin-BiosyntheseMutante 1 wächst auf: Ornithin oder Citrullin oder Arginin; Mutante 2 wächst auf: Citrullin oder Arginin; Mutante 3 wächst auf: Arginin Cross-feeding: Mutante 2 reichert Ornithin an und wächst mit Filtrat von Mutante 3 (da in diesem Citrullin angereichertist), aber nicht umgekehrtMetabolismus Stoffwechsel: Bedeutung i.a. Anabolismus und KatabolismusAnabolismus Aufbau von KörpersubstanzenKatabolismus Abbau von Körpersubstanzen und NahrungsbestandteilenSpeicherung der Energie As ATP / hochreduzierte Verbindungen (z.B. Glucose) reduzierte Elektronenüberträger (NADH, FADH2, NADPH)Verwendung der Energie Für Biosynthesen (Anabolismus) / Muskelarbeit (ATP) / TransportprozesseUnterscheidung der Lebewesen 1. Nach der Kohlenstoffquelle: autotroph: „sich selbst ernährend“; C-Quelle ist CO2 heterotroph: C-Quelle sind andere Zellen bzw. deren Bestandteile 2. Nach der Energiequelle: phototroph: Licht chemotroph: Redoxprozesse 3. Nach den Elektronendonatoren: lithotroph: anorganische Verbindungen: (H2S, NH3, S, Co, Fe2+, H2O) organotroph: organische Verbindungen Organismen C-Quelle E-Quelle e—-Donatoren Beispielphotolithotroph CO2 Licht anorg. Verb. Bakteriënphotoorganotroph org. Verb./CO2 Licht org. Verb. Purpurbakteriënchemolithotroph CO2 Redoxprozesse anorg. Verb. Archaëbakteriënchemoorganotroph org. Verb. Redoxprozesse org. Verb. alle höheren Tiere -49-
  44. 44. BiochemieTabelle 3 : Unterscheidung der Lebewesen -50-
  45. 45. BiochemieKohlenstoff-StoffwechselGlycogen Glycogen ist eine leicht mobilisierbare Speicherform der Glucose. Es ist ein großes, verzweigtes Polymer ausGlucoseeinheiten in α-1,4-glykosidischer Bindung. Formel 64 : α-1,4- und α-1,6-glycosidische Bindung Die Synthese und der Abbau von Glycogen sind aus mehreren Gründen von Bedeutung: ● Regulation des Blutzuckerspiegels ● Glucosereservoir für anstrengende Muskelaktivität ● Synthese und Abbau laufen auf unterschiedlichen Reaktionswegen, dies verdeutlicht ein wichtiges Prinzip der Biochemie ● Generelle Bedeutung der Regulationsmechanismen auf hormoneller Ebene ● Reversible Phosphorylierung der EnzymeAbbau des Glycogens durch Glycogen-Phosphorylase Phosphorolyse bedeutet die Spaltung einer Bindung durch Einbau von Orthophosphat (im Gegensatz zur Hydrolyse,einer Spaltung durch Wasser). Formel 65 : Abbau des Glycogens durch Glycogen-Phosphorylase Für den Ablauf der Spaltung ist als Coënzym das Pvridoxal-5-phosphat (PLP), ein Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6)erforderlich. Die Aldehydgruppe dieses Coënzyms bildet eine Schiffsche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette desEnzyms. PLP spaltet mit seiner Phosphatgruppe zunächst die glycosidische Bindung und wird durch anorganisches Phosphatwieder freigesetzt (doppelte Inversion am C1).Abbau des Glycogens durch Phosphorylase Phosphorylase kann die Kette nur solange abbauen, bis sie einen endständigen Glucoserest erreicht, der nur 4 Einheitenbis zu einer Verzweigung entfernt ist. Abbildung 38 : Abbau des Glycogens durch PhosphorylaseÜbertragung durch eine Transferase Die Transferase überträgt einen Block von 3 Glucoseeinheiten von einem äußeren Zweig auf einen anderen. Abbildung 39 : Übertragung durch eine TransferaseAbbau durch ein debranching enzyme (= Aufhebung der Verzweigung) Das dritte Abbauenzym, die α-1,6-Glucosidase (unter dem Namen debranching enzyme bekannt), hydrolysiert dieBindung des einzelstehenden Glucosemoleküls, es entsteht ein Molekül Glucose. Abbildung 40 : Abbau durch ein debranching enzyme -51-
  46. 46. Biochemie Somit liegt das Glycogen wieder in einer linearen Form vor und kann weiter von der Phosphorylase abgebaut werden.Synthese von Glycogen Die Synthese hat als erste Vorstufe die UDP-Glucose. Glucose - 1- Phosphat + UTP → UDP - Glucose + PPi Glycogen( n) + UDP - Glucose → Glycogen( n + 1) + UDP Gleichung 7 : Synthese von GlycogenUDP-Glucose Formel 66 : UDP-Glucose Die Verzweigungen (α-1,6-Bindungen) werden durch ein branching enzyme gebildet.GlycolyseAblauf der Glycolyse Formel 67 : Ablauf der Glycolyse -52-
  47. 47. Biochemie Die Glycolyse ist eine Folge von Reaktionen in denen im Cytosol (Cytoplasma) Glucose in Pyruvat umgewandelt wirdund gleichzeitig ATP entsteht. In aeroben Organismen geht sie dem Citratzyklus und der Atmungskette voraus. Unteranaëroben Bedingungen tritt das Pyruvat in die Mitochondriën über und wird hier vollständig zu CO 2 und H2O oxidiert. Beiungenügendem Sauerstoffangebot, etwa in einem Muskel, wird das Pyruvat in Lactat überführt. Bei einigen anaeroben wirddas Pyruvat in Ethanol umgewandelt. Die Bildung von Lactat oder Ethanol aus Glucose sind Beispiele für Gärungen.Netto-Stoffbilanz der Glycolyse Glucose + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ → 2Pyruvat + 2ATP + 2NADH/H+ + 2H2 O Gleichung 8 : Netto-Stoffbilanz der GlycolyseBildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose Die Umwandlung besteht aus 3 Reaktionen: einer Phosphorylierung, einer Isomerisierung und einer2. Phosphorylierung. Der Sinn dieser Reaktionen ist die Überführung der Glucose in eine reaktionsfähige Form, welchesich in 2 C3-Einheiten spalten lässt. Formel 68 : Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose (Gesamtreaktion) Formel 69 : Phosphorylierung der Glucose durch Hexokinase Formel 70 : Isomerisierung von Glucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat durch Glucosephosphat-Isomerase (Umwandlung einer Aldose in eine Ketose) Formel 71 : Phosphorylierung zu Fructose-l,6-bisphosphat durch PhosphofructokinaseBildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat Formel 72 : Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch Aldolase Formel 73 : Mechanismus der Aldolase -53-
  48. 48. Biochemie Aldolase führt die umgekehrte Reaktion einer Aldolkondensation (z.B. Aldehyd + Keton) durch. Die Reaktion läuft nurmit GAP weiter, dass DHAP wird durch Triosephosphatisomerase in GAP überführt.1. energiegewinnender Schritt Phosphorylierung und Oxidation des GAP (keine ATP-Bildung!) Formel 74 : Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-phosphat in 1,3-Bisphosphoglycerat durch Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase Formel 75 : Mechanismus der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase2. energiegewinnender Schritt Dies ist die erste ATP-bildende Reaktion, katalysiert durch Phosphoglycerat-Kinase. Formel 76 . Erste ATP-bildende Reaktion Formel 77 : Bildung von Pyruvat und eines zweiten Moleküls ATPRegulation der Glycolyse Abbildung 41 : Regulation der Glycolyse Glycolyse und Gluconeogenese sind so koordiniert, dass beide Vorgänge nicht gemeinsam anlaufen. Bei dieserKontrolle spielt ein Signalmolekül, das Fructose-2,6-bisphosphat eine wichtige Rolle. -54-
  49. 49. BiochemieRegulation der Glycolyse / Gluconeogenese durch F-2,6-BP F-2,6-BP aktiviert die 6-Phosphofructo-1-Kinase der Leber, indem sie deren Affinität zu Fructose-6-Phosphat steigertund die Hemmwirkung von ATP herabsetzt. Dies hat die Synthese von F-1.6-BP durch die Phosphorylierung von Fructose-6-phosphat zur Folge. Gleichzeitig wird Fructose-1,6-bisphosphatase durch F-2,6-BP gehemmt.Regulation der Konzentration von F-2,6-BP F-2,6-BP wird durch Phosphorylierung (durch 6-Phosphofructo-2-Kinase) synthetisiert und kann von der Fructose-2,6-bisphosphatase zu Fructose-6-phosphat hydrolysiert werden. Beide Enzyme befinden sich auf einer einzigen Peptidkette,die man auch als Tandem-Enzym bezeichnet.Regulation des Tandem-Enzyms Die Aktivitäten von 6-Phosphofructo-2-Kinase und Fructose-2,6-bisphosphatase werden durch die Phosphorylierungeines Serinrestes kontrolliert. Bei Glucosemangel löst ein Konzentrationsanstieg des Hormons Glucagon eine Reaktionskaskade aus, die zurPhosphorylierung dieses bifunktionellen Enzyms führt (Fructose-6-phosphat → Gluconeogenese). Ist dagegen Glucose imÜberschuss vorhanden, verliert das Enzym seine Phosphorylgruppe, wodurch der F-2,6-BP-Spiegel ansteigt (→Glycolyse). unphosphoryliert: aktiviert Kinase, hemmt Bisphosphatase → Aufbau von F-2,6-BP phosphoryliert aktiviert Bisphosphatase, hemmt Kinase → Abbau von F-2,6-BP Abbildung 42 : Regulation des Tandem-EnzymsWeiterverarbeitung des PyruvatsAërobiërPyruvat-Dehydrogenase-Komplex ● Acetyl-CoA ● Citronensäure-Zyklus → oxidative Phosphorylierung ● CO2 + H2O Abbildung 43 : Pyruvat-Dehydrogenase-KomplexHöhere Organismen und Bakterien bei O2-Mangel (anaërob)Homolaktische Fermentation → Lactat (Muskel) Glucose + 2ADP + 2Pi → 2Lactat + 2ATP + 2H2 O Formel 78 : Anaërobe Lactatbildung -55-
  50. 50. BiochemieHefe und Mikroorganismen (anaërob)Alkoholische Gärung zum Ethanol Glucose + 2ADP + 2Pi + 2FT → 2Ethanol + 2CO 2 + 2H2 O 1 Decarboxylierung durch Pyruvat-Decarboxylase 2 Reduktion durch Alkohol-Dehydrogenase mit NADH Formel 79 : Alkoholische GärungOxidative Decarboxylierung Die Funktion dieses Reaktionsweges ist die Bildung von Acetyl-CoA aus Pyruvat in den Mitochondriën, welchesanschließend im Citratzyklus vollständig zu CO2 oxidiert wird. Die Reaktion wird durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex katalysiert. Es handelt sich dabei um einen sehrgroßen Multienzymkomplex aus 3 eng zusammenwirkenden Enzymen (Vorteil des Multienzymkomplexes: HöhereGeschwindigkeit, kaum Nebenreaktionen). Komponente Abk. Ketten Coënzyme Reaktion Oxidative Decarboxylierung vonPyruvat-Dehydrogenase E1 24 TPP Pyruvat Transfer der Acetylgruppe aufDihydrolipoyl-Transacetylase E2 24 Liponamid CoA Regenerierung der oxidiertenDihydrolipoyl-Dehydrogenase E3 12 FAD + NAD+ Form des Liponamids Tabelle 4 : Komponenten des Pyruvat-Dehydrogenase-KomplexesDecarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP Pyruvat + TPP → Hydroxyethyl - TPP + CO 2 Gleichung 9 : Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP (Gesamtreaktion) Formel 80 : Ionisierung des TPP Durch die Ionisierung des TPP kommt es zur Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert. Formel 81 : Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert -56-

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