BioanalytikInhaltsverzeichnis:Gebräuchliche Einheiten........................................................................
BioanalytikGebräuchliche EinheitenSubstanzquantität, Volumen und Konzentration   Substanzquantität wird als Masse oder als...
Bioanalytik                                                 kg   g                                               1  ...
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  1. 1. BioanalytikInhaltsverzeichnis:Gebräuchliche Einheiten.................................................................................................................................... 4 Substanzquantität, Volumen und Konzentration......................................................................................................4 Verdünnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S])...............................................................................5Kohlenhydrate..................................................................................................................................................... 7 Die glycosidische Bindung.......................................................................................................................................... 7Aminosäuren und Proteïne................................................................................................................................. 9 Biuret-Test..................................................................................................................................................................... 9 Molekularmasse von Proteïnen................................................................................................................................. 10 Denaturierung von Proteïnen.................................................................................................................................... 11Lipide.................................................................................................................................................................. 13Biologische Membranen................................................................................................................................... 15 Die 3 häufigsten Phospholipidtypen......................................................................................................................... 15Nucleïnsäuren.................................................................................................................................................... 17pH-Messung und Titration................................................................................................................................ 19 Berechnung des pH-Wertes einer schwachen Säure.............................................................................................19 Berechnung des pH-Wertes von Wasser..................................................................................................................19 Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base..........20 Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung......................................................................................................20 Ampholyte.................................................................................................................................................................... 21Elektrophorese.................................................................................................................................................. 23Chromatographie............................................................................................................................................... 25 Ionenaustauscher-Chromatographie........................................................................................................................ 25 Gelchromatographie................................................................................................................................................... 26Photometrie........................................................................................................................................................ 29 Gesetz von Lambert-Beer.......................................................................................................................................... 29 Konzentrationsbestimmung durch Photometrie.....................................................................................................29 Photometer und Spektralphotometer....................................................................................................................... 29Enzymreaktionen............................................................................................................................................... 31 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration........................................................................31Molekularbiologische Methoden...................................................................................................................... 39 Plasmide...................................................................................................................................................................... 39 Restriktionsenzyme.................................................................................................................................................... 39 Agarose-Gelelektrophorese....................................................................................................................................... 40 Restriktionskarten...................................................................................................................................................... 40 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus......................................................................................................41 Polymerase-Kettenreaktion....................................................................................................................................... 41Radioaktive Isotope........................................................................................................................................... 43 In Biochemie und Medizin gebräuchliche Radioisotope:......................................................................................43 Bestimmung der Radioaktivität................................................................................................................................ 43 Messmethodik............................................................................................................................................................. 43 „Background".............................................................................................................................................................. 44 Zählstatistik................................................................................................................................................................. 44 Einheiten der Radioaktivität...................................................................................................................................... 44 Spezifische Radioaktivität.......................................................................................................................................... 44 Wirkung radioaktiver Strahlung auf lebendes Gewebe - Radiodosimetrie..........................................................44 Richtlinien zum Arbeiten mit 3H- und 14C-markierten Substanzen.....................................................................45Immunologische Bestimmungsmethoden...................................................................................................... 47Anhang............................................................................................................................................................... 49 Abbildungsverzeichnis............................................................................................................................................... 49 Formelverzeichnis...................................................................................................................................................... 50 Gleichungsverzeichnis............................................................................................................................................... 51 Tabellenverzeichnis.................................................................................................................................................... 52 -3-
  2. 2. BioanalytikGebräuchliche EinheitenSubstanzquantität, Volumen und Konzentration Substanzquantität wird als Masse oder als Stoffmenge angegeben. Masse: Basiseinheit ist das Kilogramm. Gebräuchliche Einheiten sind: kg = 10 3 [g] g = 10 0 [g] mg ( milli) = 10 −3 [g] μg ( mikro ) = 10 −6 [g] ng (nano ) = 10 −9 [g] pg (pico ) = 10 −12 [g] fg ( femto ) = 10 −15 [g] Gleichung 1 : Gebräuchliche Masse-Einheiten Stoffmenge: Basiseinheit ist das mol. Ein mol ist die Stoffmenge, die der Molekularmasse einer Substanz inGramm entspricht. Gebräuchliche Einheiten sind: mol = 10 0 [mol] mm ( milli) = 10 −3 [mol] μm ( mikro ) = 10 −6 [mol] nm (nano ) = 10 −9 [mol] pm (pico ) = 10 −12 [mol] fm ( femto ) = 10 −15 [mol] Gleichung 2 : Gebräuchliche Stoffmengen-Einheiten Beispiel zur Umrechnung von Masse in Stoffmenge und umgekehrt:  g  Glucose = 180    mol  45[ g] 45[ g] Glucose = = 0,25[mol]  g  180    mol   g  0,05[mol] Glucose = 0,05[mol] ∗ 180   = 9[ g]  mol  Gleichung 3 : Umrechnung: Masse in Stoffmenge und vice versa Volumen: Basiseinheit ist der Liter. Gebräuchliche Einheiten sind: [ 1[l] = 1 dm 3 ] 1[ml] = 10 −3 [l] = 1 cm 3 [ ] 1[μl] = 10 −6 [l] = 1[mm ] 3 Gleichung 4 : Gebräuchliche Volumen-Einheiten Konzentration wird als Massenkonzentration oder Stoffmengenkonzentration angegeben. Massenkonzentration: Basiseinheit ist Kilogramm gelöste Substanz pro Liter Lösung. Gebräuchliche Einheitensind: -4-
  3. 3. Bioanalytik  kg  g 1  = 1   l   ml  g g  mg  1  = 10 −3   = 1  l   ml   ml   mg  −6  g   μg  1  = 10  ml  = 1 ml   l       μg  g  ng  1  = 10 −9   = 1   l   ml   ml   ng  g  pg  1  = 10 −12   = 1   l   ml   ml  Gleichung 5 : Gebräuchliche Massenkonzentrations-Einheiten Stoffmengenkonzentration: Basiseinheit ist mol gelöste Substanz pro Liter Lösung. Beispiel: 1 mol/l Glucose = 180 g Glucose gelöst in H2O und durch weitere Zugabe von H2O auf 1 Liter gebracht.Gebräuchliche Einheiten und Symbole sind:  mol   mmol  1  = 1 ml  = 1[M] ( molar )  l     mmol  −3  mol   μmol  1  = 10  l  = 1 ml  = 1[mM] ( millimolar )  l       μmol  −6  mol   nmol  1  = 10  l  = 1 ml  = 1[μM] ( mikromolar )  l       nmol  −9  mol   pmol  1  = 10  l  = 1 ml  = 1[nM] ( nanomolar )  l      Gleichung 6 : Gebräuchliche Stoffmengenkonzentrations-Einheiten Beispiele: Eine 1 M Lösung von Glucose enthält 1 mol/l bzw. 1 mmol/ml oder 1 µmol/µl. Eine 1 mM Lösung vonGlucose enthält 1 mmol/l bzw. 1 µmol/ml oder 1 nmol/µl.Umrechnung von Massenkonzentration in Stoffmengenkonzentration Eine Lösung von 9 g/l Glucose ist: g 9  l = 0,05M → 50mM  g  180    mol  Eine 10 nM Lösung von Glucose hat eine Massenkonzentration von:  nmol   ng  ng μg 10   l   ∗ 180  nmol  = 1.800 l → 1,8 l   Beachten Sie die verschiedene BedeutungVerdünnen von Lösungen (Konzentration einer Substanz [S]) Volumen des Ansatzes Verdünnungsfaktor = Volumen der Ausgangslösung [S Ausgangslösung ] = [ S verdünnt ] ∗ Verdünnungsfaktor Beispiele: Zur Bestimmung einer Enzymaktivität werde 1,9 ml einer Enzymlösung (11 µg/ml) zu 0,5 ml Pufferlösung und 0,1 mlSubstratlösung (5 mM) gegeben. Das Substrat wird 25-fach (2,5 ml Ansatz / 0,1 ml Substratlösung) verdünnt. ImMessansatz ist die Substratkonzentration 0,2 mM und die Enzymkonzentration 8,4 µg/ml (Verdünnungsfaktor:2,5 ml / 1,9 ml = 1,32). Wenn im Messansatz eine Enzymaktivität von 14,4 U/ml bestimmt wird, ist die Aktivität derverwendeten Enzymlösung (14,4 U/ml x 1,32) = 19,0 U/ml. -5-
  4. 4. Bioanalytik Zu 0,5 ml Serum werde eine Substanz durch Zugabe einer bestimmten Menge Fällungsreagens quantitativ ausgefällt,der Überstand nach Zentrifugation verworfen und das Präzipitat in 1,5 ml Puffer aufgelöst. Die gesamte Menge Substanz,die in 0,5 ml Serum enthalten war, ist nun in 1,5 ml enthalten (Volumen des Präzipitats ist vernachlässigbar klein).Verdünnung der Substanz: (1,5 ml/ 0,5 ml) = 3-fach. -6-
  5. 5. BioanalytikKohlenhydrate Kohlenhydrate sind primäre Oxidationsprodukte mehrwertiger Alkohole. Es sind entweder Polyhydroxyaldehyde(Aldosen) oder Polyhydroxyketone (Ketosen). Sie werden eingeteilt in Monosaccharide, Oligosaccharide (Disaccharide,Trisaccharide usw.) und hochmolekulare Polysaccharide. Monosaccharide sind Aldehyde oder Ketone, die entsprechend der Anzahl ihrer C-Atome in Triosen, Pentosen,Hexosen usw. unterteilt werden. Monosaccharide und Oligosaccharide mit gleicher Anzahl C-Atome werden aufgrundder sterischen Anordnung (Konfiguration) der Substituënten an den C-Atomen unterschieden. Monosaccharide und Oligosaccharide sind gut wasserlöslich. Gewisse Polysaccharide können in heißem Wasser gelöstwerden.Zucker in Lösung haben vorwiegend zyklische Struktur Viele Eigenschaften der Monosaccharide sind auf ihre Aldehyd- bzw. Ketogruppe zurückzuführen. Diese Gruppensind im Unterschied zu gewöhnlichen Aldehyd- und Keto-Funktionen nur zum kleineren Teil in freier Form vorhanden,größtenteils liegen sie als Cyklohalbacetal (-ketal) vor. Die Ringe entstehen durch Kondensation der Aldehyd- oderKetogruppe mit einer alkoholischen OH-Gruppe desselben Monosaccharids. Zucker mit fünfgliedrigen Ringen werdenFuranosen, solche mit sechsgliedrigen Pyranosen genannt wegen ihrer Ähnlichkeit zu Furan und Pyran. Freie Pentosenund Hexosen haben in der Regel Pyranosestruktur. Dagegen liegt in Saccharose die Fructose und in Nukleïnsäuren die Ribose und Desoxyribose in der Furanoseform vor.Bei der Ringbildung sind am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom 2 verschiedene räumliche Konfigurationenmöglich, die als α- und β-Formen bezeichnet werden (= anomere Formen). Beide gehen leicht ineinander über(Mutarotation). Der Übergang erfolgt über die offenkettige Form. Abbildung 1 : Ringbildung der Glucose (α- und β-Form)Die glycosidische Bindung Glycoside sind Zuckerderivate, bei welchen die OH-Gruppe am Hemiacetal- (bzw. Hemiketal-) Kohlenstoffatom miteinem organischen Rest (R) kondensiert ist. Je nach Konfiguration der dabei entstehenden Acetalgruppe unterscheidetman anomere α- und β-Glycoside, je nach Art der R-Gruppe O- oder N-Glycoside. Beispiel: Glycoside von Glucose. Abbildung 2 : Glykoside von Glucose -7-
  6. 6. Bioanalytik Die wichtigsten Glycoside sind die Oligo- und Polysaccharide. Bei den einfachsten Oligosacchariden, denDisacchariden, lassen sich 2 Bindungstypen unterscheiden. Bei der Saccharose erfolgt die glycosidische Bindungzwischen den hemiacetalischen (bzw. hemiketalischen) OH-Gruppen beider Zuckerreste. Solche Zucker tragen deshalbkeine freie Halbacetalgruppe. Bei der Maltose erfolgt die Bindung zwischen einer hemiacetalischen und eineralkoholischen OH-Gruppe. Disaccharide des Maltose-Typs besitzen noch eine freie Halbacetalgruppe (Pfeil inuntenstehenden Formeln). Abbildung 3 : Disaccharide Chemisch können glycosidische Bindungen mit Säure gespalten werden, gegen Basen sind sie stabil. Im Organismuswerden Polysaccharide und Oligosaccharide enzymatisch gespalten.Zucker mit freier Aldehyd- oder Ketogruppe sind reduzierend Freie Aldehyde und Ketone in Zuckern sowie die entsprechenden Hemiacetale und Hemiketale werden durch mildeOxidationsmittel oxidiert. Weil bei dieser Reaktion das Oxidationsmittel durch den Zucker reduziert wird, spricht manvon reduzierenden Zuckern. Alle Monosaccharide sind reduzierend. Disaccharide und Oligosaccharide dagegen sindnur reduzierend, wenn sie noch eine freie Hemiacetal- oder Hemiketalgruppe besitzen. Disaccharide vom Saccharose-Typsind demgemäss nicht reduzierend. Hochmolekulare Polysaccharide wie Stärke und Glycogen wirken nicht reduzierend,weil in Polysaccharidlösungen die Konzentration der reduzierenden Molekülenden sehr niedrig ist. In der Benedictschen Probe wird 2-wertiges Kupfer (alkalische Lösung von CuSO 4 in Natriumcarbonat undNatriumcitrat) zur Oxidation von Zucker verwendet gemäss Cu 2 + + Glucose → Cu + + Oxidationsprodukte von Glucose Formel 1 : Benedict-Probe Während der Reaktion entsteht aus dem blauen 2-wertigen Kupfer zuerst gelbes 1-wertiges Kupferhydroxid (CuOH)und später schwerlösliches Kupfer-(I)-oxid (Cu 2O) als roter Niederschlag. Der Benedict-Test ist eine einfacheNachweismethode für reduzierende Zucker. Neben reduzierenden Zuckern geben aber auch andere reduzierendeSubstanzen eine positive Benedict-Reaktion. Für den spezifischen Nachweis einzelner reduzierender Zucker sind deshalbenzymatische Methoden notwendig. Zum spezifischen Nachweis von Glucose wird Glucoseoxidase aus Schimmelpilzverwendet, die folgende Reaktion katalysiert: Glucose + O 2 + H2 O Glucoseoxi dase →Gluconsäure + H2 O 2   Formel 2 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 1 Das entstehende Wasserstoffperoxid wird in einer gekoppelten Reaktion dazu benutzt, eine farblose Verbindung(Chromogen) zu einem Farbstoff zu oxidieren. Die Reaktion wird durch eine Peroxidase katalysiert. Peroxidase H2 O 2 + Chromogen  →Farbstoff + H2 O  Formel 3 : Enzymatischer Glucosenachweis, Schritt 2 Für den semiquantitativen Glucosenachweis z.B. im Urin dient ein Teststäbchen (Diabur-Test), das mit den beidenEnzymen und dem Chromogen imprägniert ist. Für die quantitative Glucosebestimmung wird aus einer nichtabsorbierenden Verbindung eine im UV-Bereich absorbierende Indikatorverbindung gebildet, deren Konzentrationphotometrisch gemessen wird. -8-
  7. 7. BioanalytikAminosäuren und Proteïne Zwanzig verschiedene Aminosäuren sind die üblichen Bausteine der Proteïne. Man unterscheidet saure, neutrale undbasische Aminosäuren oder apolare (aliphatische, aromatische) und polare Aminosäuren. In den Proteïnen sind dieAminosäuren durch Peptidbindungen miteinander verknüpft. Formel 4 : Peptidbindung in Proteïnen Die Aminosäurensequenz (Primärstruktur) bestimmt die 3-dimensionale Anordnung der Peptidkette im Raum(Sekundär- und Tertiärstruktur). Häufig sind 2 und mehr Peptidketten mit ausgebildeter Sekundär- und Tertiärstruktur zustabilen oligomeren Molekülen zusammengelagert (Quartärstruktur).Primäre Aminogruppen von Aminosäuren und Proteïnen werden mit der Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen Ninhydrin reagiert mit Ammoniak und primären Aminogruppen zu einem blauen Farbstoff. Formel 5 : Ninhydrin-Reaktion α-Aminosäuren werden durch Ninhydrin oxidativ desaminiert und decarboxyliert. Auf analoge Weise reagiert auchdie ε-NH2-Gruppe der Lysin-Seitenkette. Deshalb geben auch Proteïne eine positive Ninhydrin-Reaktion. Zurquantitativen Bestimmung von Aminosäuren wird die blaue Ninhydrin-Farbe photometrisch gemessen. Die Trennungverschiedener Aminosäuren durch Ionenaustauscher-Chromatographie und die anschließende photometrischeKonzentrationsbestimmung mit Ninhydrin wird im sog. Aminosäurenanalysator vollautomatisch durchgeführtBiuret-TestPeptidbindungen bilden blau-violette Cu 2+-Komplexe In stark alkalischer Lösung entstehen aus Proteïnen und Kupfersulfat Koordinationskomplexe zwischen Cu 2+-Ionenund benachbarten Amid-Stickstoffatomen von Peptidbindungen. Biuret (H 2N-CO-NH-CO-NH2) ist die einfachsteVerbindung, welche einen derartigen blauvioletten Kupferkomplex bildet. Der Biuret-Test dient zur quantitativenphotometrischen Proteïnbestimmung. Die Farbe des Komplexes ist in der Regel unabhängig von der Art des Proteïns, sodass eine für Serumalbumin bestimmte photometrische Kalibrierkurve auch für viele andere Proteïne benutzt werdenkann. Tryptophan und Tyrosin geben den Proteïnen ein charakteristisches UV-Spektrum mit Absorptionsmaximum bei280 nm. Wie die Spektren in Abb. 4 zeigen, trägt Tryptophan am meisten und Phenylalanin kaum zur Absorption derProteïne im nahen UV-Bereich bei. Abbildung 4 : Absorptionsspektren der aromatischen Aminosäuren -9-
  8. 8. Bioanalytik In Abb. 4 bedeutet εmM „millimolarer Extinktionskoëffiziënt“. Der millimolare Extinktionskoëffiziënt ist dieAbsorption einer millimolaren Lösung der entsprechenden Aminosäure. Je nach dem Gehalt an aromatischenAminosäuren ändert die UV-Absorption von Proteïnen. In Abbildung 5 sind die UV-Spektren von Lösungen gleicherMassenkonzentration (mg/ml) von Lysozym, γ-Globulin und Ribonuclease dargestellt. Alle Peptide und Proteïneabsorbieren sehr stark bei 220 nm aufgrund ihrer Peptidbindungen. Die 3 Proteïne enthalten unterschiedlich viel Tyrosinund Tryptophan. Zur Konzentrationsbestimmung kann die UV-Absorption bei 280 nm benutzt werden, wegen desvariablen Gehalts an aromatischen Aminosäuren gilt jedoch eine Kalibrierkurve nur für ein bestimmtes Proteïn. MancheProteïne absorbieren sichtbares Licht. Für das sichtbare Absorptionsspektrum sind prosthetische Gruppen verantwortlich(Häm, Flavin, etc.). Abbildung 5 : Absorptionsspektren von Proteinen mit verschiedenem Gehaltan aromatischen Aminosäuren Die Spektren wurden mit Proteïnlösungen gleicher Konzentration (1 mg/ml) aufgenommen. Proteïn Tryptophangehalt Tyrosingehalt Lysozym (Hühnereiweiß) 8,6 4,0 Ovalbumin (Hühnereiweiß) 1,3 3,8 Ribonuclease (Rind) 0,0 7,9 Tabelle 1 :Tryptophan- und Tyrosingehalt in g Aminosäure pro 100 g ProteïnGroßmolekulare Proteïne werden von kleinen Molekülen durch Dialyse oderGelchromatographie abgetrennt Gewisse Cellophanmembranen sind für große Moleküle undurchlässig, für Wasser und andere kleine Moleküledurchlässig. Wird eine Proteïn-Salzlösung in einem Cellophanschlauch für längere Zeit (Stunden) in Wasser eingetaucht,so stellt sich für die frei passierbaren Moleküle durch Diffusion ein Konzentrations-Gleichgewicht über das gesamteFlüssigkeitsvolumen ein. Die großen Proteïnmoleküle werden im Schlauch zurückgehalten. Der Vorgang wird Dialysegenannt. Durch Dialyse können Proteïnlösungen entsalzt werden, oder ein Proteïn in einem Puffer A kann durch Dialysein einen neuen Puffer B gebracht werden. Die Hämodialyse (künstliche Niere) arbeitet nach demselben Prinzip. Mit derGelchromatographie ist eine feinere Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe möglich als mit der Dialyse.Molekularmasse von Proteïnen Die meisten Proteïne haben eine Molekularmasse (M r) im Bereich 10.000 bis 100.000. Proteïn Molekularmasse Glucagon (ein Peptid) 4.500 Ribonuclease 13.700 Myoglobin 17.000 Chymotrypsin 25.000 Hämoglobin 64.500 Serumalbumin 69.000 Aldolase 160.000 Phosphorylase a 390.000 Tabelle 2 : Molekularmasse einiger Proteïne - 10 -
  9. 9. Bioanalytik Gebräuchliche Methoden zur Molekularmassebestimmung von Proteïnen sind Gelchromatographie, SDS-Gelelektrophorese und Sedimentationsanalyse in der Ultrazentrifuge. Die heute gebräuchlichste Methode ist die SDS-Gelelektrophorese. Bei dieser speziellen Elektrophoresemethode ist die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feldfast ausschließlich eine Funktion der Molekülgröße. Proteïne mit niedriger Molekularmasse wandern schneller als solchemit hoher Molekularmasse. Die SDS-Gelelektrophorese ist nicht zu verwechseln mit der üblichen Proteïnelektrophorese,bei der native Proteïne aufgrund ihrer Ladung getrennt werden. Die Molekularmassebestimmung in der Ultrazentrifuge ist aufwendig. Sie gibt aber zusätzlich Information über dieForm und den Aggregationszustand von Proteïnmolekülen. Im künstlichen Schwerefeld der Ultrazentrifuge ist dieSedimentationsgeschwindigkeit Vs der Partikel von ihrer Größe abhängig gemäss Vs = S@Γ. Die Zentrifugalfeldstärke Γwird bestimmt durch den Radius der Zentrifuge und die Tourenzahl. S ist die für die untersuchte Partikelcharakteristische Sedimentationskonstante, welche experimentell gemäss der obigen Gleichung bestimmt werden kann.S ist unter anderem eine Funktion der Molekülmasse, und daher kann letzteres aus dem experimentell bestimmten Sberechnet werden. Die Beziehung lautet:  ρ  M ∗ D ∗ 1 − m   ρp  S=   R ∗T Gleichung 7 : Berechnung der Sedimentationskonstanten M = Molekularmasse, D = Diffusionskonstante, ρm und ρp = Dichte von Medium und Partikel, R = Gaskonstante,T = Temperatur (absolut). Die Sedimentationskonstanten werden in Svedberg-Einheiten [S] (1 Svedberg = 10-13 sec)ausgedrückt und auf ρm von Wasser und 20 °C normalisiert (S20,w). Typische Werte sind: Myoglobin 2 Ribosomen- 40 Untereinheiten 60 Viren 200 Zellen (komplett) 1000 Tabelle 3 : Typische Werte für SDenaturierung von Proteïnen Die native Struktur von Proteïnen wird unter dem Einfluss verschiedenster Faktoren zerstört, dazu gehören Wärme,Schaumbildung, Zusatz von organischen Lösungsmitteln, Säuren, Basen, Schwermetallionen oder hohe Konzentrationvon Harnstoff. Die für die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur verantwortlichen, nicht-kovalenten Bindungen werdenteilweise oder ganz gelöst, während die für die Primärstruktur verantwortlichen kovalenten Bindungen erhalten bleiben.Man bezeichnet diesen Prozess der partiellen oder vollständigen Entfaltung der Peptidkette als Denaturierung. Eindenaturiertes Proteïn hat die gleiche Primärstruktur wie das native, hat aber keine einheitliche räumliche Struktur undandere physikalisch-chemische Eigenschaften (Beispiel: Hartwerden von Eiern beim Kochen). Bei der Denaturierung geht die biologische Aktivität verloren. (Beispiele: Hitze-Inaktivierung von Enzymen undProteïnhormonen). Denaturierung kann, muss aber nicht reversibel sein. Denaturierung verringert in der Regel die Löslichkeit der Proteïne. Denaturierte Proteïne werden von Proteasenleichter gespalten als native: gekochtes Fleisch ist leichter verdaulich.Proteïne sind an ihrem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich Die Löslichkeit der Proteïne variiert stark. Globuläre Proteïne wie Serumalbumin und Globuline sind im allgemeinengut, Faserproteïne (Kollagen, Keratin) sehr schlecht löslich. Proteïne sind Polyelektrolyte. Elektrostatische Kräftezwischen Proteïnmolekülen einerseits und zwischen Proteïnmolekülen und Wasserdipolen andererseits beeinflussen dieLöslichkeit. Proteïne mit vielen geladenen Gruppen sind häufig gut wasserlöslich. Die Löslichkeit eines Proteïns ist amgeringsten, wenn seine Gesamtladung gleich Null ist. Dies ist der Fall, wenn das Molekül gleich viele positive wienegative Ladungen trägt. Man bezeichnet den pH-Wert der wässrigen Lösung, bei dem dies zutrifft, als isoelektrischenPunkt (IEP) des Proteïns. Manche Proteïne fallen am IEP aus (= werden unlöslich). Bei pH-Werten über und unter demIEP bewirken negative bzw. positive Überschussladungen gegenseitige Abstoßung der Proteïnmoleküle und damit bessereLöslichkeit. - 11 -
  10. 10. Bioanalytik Abbildung 6 : Löslichkeit von β-Lactoglobulin (IEP 5,2) in Abhängigkeit vom pH-Wert bei 25 °C. Die Löslichkeit ist bei pH 6,0 mehr als 40 mal größer als bei pH 5,2.Proteïne werden aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von Salz, organischenLösungsmitteln oder bestimmten Säuren ausgefällt Zur Isolierung und Reinigung werden Proteïne häufig ausgefällt. Solche Fällungen müssen reversibel sein, soll dasProteïn seine biologische Aktivität behalten: Ein isoliertes Enzym muss nach der Fällung wieder gelöst werden könnenund unverminderte Aktivität besitzen. Bei manchen Analysemethoden stören anwesende Proteïne; sie werden deshalbirreversibel ausgefällt (z.B. durch ein Fällungsreagens wie Perchlorsäure oder Trichloressigsäure) und durchZentrifugation abgetrennt. Eine solche "Deproteïnisierung" ist z.B. nötig bei der Bestimmung von Glucose im Serum. Die meisten Fällungen beruhen auf der Änderung der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischenProteïnmolekülen. So werden Proteïne aus wässrigen Lösungen durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln ausgefällt,weil in organischen Lösungsmitteln die gegenseitige Anziehung der geladenen Proteïnmoleküle größer wird (Proteïnehaben ein unregelmäßiges Muster von positiven und negativen Ladungen auf ihrer Oberfläche). Gemäss demCoulombschen Gesetz über die Anziehung entgegengesetzt geladener Teilchen nimmt die elektrostatische Anziehungmit abnehmender Diëlektrizitätskonstante des Mediums zu. Organische Lösungsmittel haben eine niedrigereDiëlektrizitätskonstante als Wasser. Industriell bedeutungsvoll ist die Fällung von Blutplasmaproteïnen mit Alkohol undAceton (Cohn-Fraktionierung). Die Fällung geschieht bei tiefen Temperaturen, damit die Plasmaproteïne nichtirreversibel denaturiert werden. Zusatz eines Salzes in hoher Konzentration zu einer Proteïnlösung bewirkt die Erniedrigung der effektivenKonzentration (Aktivität) des Wassers und dadurch eine Herabsetzung der für die Lösung des Proteïns verfügbarenWassermenge. Das Proteïn wird ausgefällt. Man bezeichnet die durch Salzzugabe bewirkte Ausfällung als Aussalzung.Sie ist meist reversibel und deshalb zur Isolierung von Enzymen geeignet. Gewöhnlich wird für die AussalzungAmmoniumsulfat verwendet, weil es besonders gut löslich ist. Zur Ausfällung von verschiedenen Proteïnen werdenunterschiedliche Konzentrationen von Ammoniumsulfat benötigt. Ein Proteïngemisch kann deshalb durch schrittweisesZufügen von Ammoniumsulfat aufgetrennt werden. - 12 -
  11. 11. BioanalytikLipide Die Lipide sind eine heterogene Stoffklasse. Ein hoher Gehalt an hydrophoben Gruppen ist ihnen gemeinsam. Lipidesind daher in organischen Lösungsmitteln gut, in Wasser schlecht löslich. Die Lipide können unterteilt werden ineinfache Lipide, komplexe Lipide und Isoprenoidlipide. Zu den einfachen Lipiden gehören die Neutralfette oderTriacylglycerole. Es sind häufige Nahrungsbestandteile und Energiespeicher der Zelle. Zu den komplexen Lipiden werdenz.B. die Membranbestandteile Lecithin, Cerebroside und Cardiolipin gezählt. Die Isoprenoidlipide sind Abkömmlinge desIsoprens und umfassen Verbindungen wie Cholesterin, Vitamin A, Steroidhormone und Gallensäuren. Cholesterin ist einuniverseller Membranbestandteil, aber auch Ausgangsprodukt für die Biosynthese von Gallensäuren, Steroidhormonenund Vitamin D.Die physikalischen Eigenschaften der Neutralfette werden durch die Struktur derFettsäuren bestimmt Die Fette und Öle der Nahrung sind Gemische verschiedener Triacylglycerole. Triacylglycerole sind Verbindungen,die aus einem Molekül Glycerol, verestert mit 3 Molekülen Fettsäure, bestehen. Sie tragen im Gegensatz zu denkomplexen Lipiden keine ionisierbaren Gruppen, daher auch der Name Neutralfette. Die physikalischen und chemischenEigenschaften der Neutralfette sind je nach Fettsäurenzusammensetzung verschieden. So ist der Schmelzpunkt von Fettenum so niedriger, je kürzer die Fettsäuren und je größer die Zahl der ungesättigten Bindungen. Öle enthalten vorwiegendTriacylglycerole mit ungesättigten Fettsäuren. Tierische Fette haben einen Schmelzpunkt, der etwas unter derphysiologischen Gewebstemperatur liegt. Fett aus dem Unterhautfettgewebe hat einen niedrigeren Schmelzpunkt als Fettaus dem Innern des Körpers. Fettsäuren und Lipide, die ungesättigte Fettsäuren enthalten, werden leichter oxidiert als gesättigte Fettsäuren. DasRanzigwerden von Fetten beruht zum Teil auf oxidativer Spaltung an den Doppelbindungen, wobei stark riechendeAldehyde oder Säuren geringerer Kettenlänge entstehen.Seifen, Detergentiën und Gallensäuren emulgieren wasserunlösliche Lipide In Haushalt und Labor werden wasserunlösliche Lipide mit Seifen oder Detergentiën emulgiert. Im tierischenOrganismus haben die Gallensäuren eine ähnliche Aufgabe. Die 3 Verbindungen sind aus einem hydrophoben, apolarenKohlenwasserstoffgerüst und einem hydrophilen, polaren „Kopfteil“ aufgebaut. Solche Verbindungen lösen sich inorganischen Lösungsmitteln in der protonierten Form, im Wasser als Anionen. Sie sind amphiphil. In Öl-Wasser Gemischen reichern sich amphiphile Verbindungen an der Grenzfläche zwischen Öl und Wasser an. Sie sindoberflächenaktiv, d.h. sie erleichtern die Vergrößerung von Grenzflächen und ermöglichen so die Bildungmikroskopisch kleiner Öltröpfchen im Wasser; das Öl wird emulgiert. Im Unterschied zu einer echten Lösung sind aberdie Lipidmoleküle in der Emulsion nicht direkt von Wassermolekülen umgeben, sondern von einer Hülle aus Seife,Detergens- oder Gallensäuremolekülen. Formel 6 : Unterschiede bei Seife, Detergens- und GallensäuremolekülenNur emulgierte Neutralfette können durch Lipase hydrolysiert werden Im Dünndarm werden Neutralfette durch die Pankreaslipase in Monoacylglycerole und freie Fettsäuren gespalten. DieLipase, ein Proteïnmolekül, ist nur in wässriger Phase löslich und aktiv. Die physiologische Funktion der Gallensäurenbesteht darin, die Neutralfette zu kleinen Tröpfchen zu emulgieren, so dass eine große Grenzfläche für den Angriff derLipase zur Verfügung steht. Im Blut werden wasserunlösliche Lipide an Proteïne gebunden transportiert. Fettsäuren werden an Serumalbumingebunden, Neutralfette, Cholesterin und Phospholipide an spezielle Lipoproteïne. Low Density Lipoproteïne (LDL) alshauptsächliche Träger von Cholesterin und Cholesterinestern sind besonders bedeutsam. Erhöhte Blutcholesterin-Wertesind ein Risikofaktor für die Entstehung von Arteriosklerose. Die Chylomikronen sind lichtmikroskopisch sichtbareAggregate von Neutralfetten, umgeben von weniger hydrophoben Phospholipiden und hydrophilen Proteïnen. Es sindTransportvehikel für schwerlösliche Lipide aus der Dünndarmmucosa via Lymphe in die Blutbahn. - 13 -
  12. 12. BioanalytikBiologische Membranen Biologische Membranen verschiedener Herkunft (Plasmamembran, ER 1, Mitochondriënmembran, Golgi-Apparat,u.a.) können sich nicht nur in ihrer Proteïnzusammensetzung, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung starkunterscheiden. Ebenso können sich je nach Zelltyp die Gesamtmenge und die Anteile der verschiedenen biologischenMembranen unterscheiden. Die Erythrozytenmembran besteht wie andere biologische Membranen hauptsächlich ausLipiden und Proteïnen. Die Lipid-Doppelschicht ist 6-7 nm dick und enthält in einem Feld von 1 µm2 etwa 5 x 106Lipidmoleküle. Die speziellen Eigenschaften der Membranlipide ermöglichen, dass sich die Lipidmoleküle spontananeinander lagern und durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Die Lipidfraktion umfasstpolare Lipide, vor allem Glycerolphosphatide, aber auch Sphingolipide sowie Cholesterin. Die Grundstruktur derGlycerolphosphatide ist die mit einem Alkohol (R-OH) veresterte Phosphatidsäure. Formel 7 : Grundstruktur der Glycerolphosphatide R1 und R2 sind langkettige Fettsäuren. R2 ist meist eine ungesättigte Fettsäure, häufig die hochungesättigteArachidonsäure (20:4), die nach Abspaltung aus Phospholipiden als unmittelbare Vorstufe zur Synthese hormonähnlicherLipidsubstanzen dient (Prostaglandine, Thromboxane einerseits und Leukotriëne andererseits). Die polare Kopfgruppe Xbestimmt den Typ des Phospholipids.Die 3 häufigsten Phospholipidtypen Phospholipidtyp „Kopfgruppe“ (-X) − CH2 CH2N( CH3 ) 3 + Phosphatidylcholin PC + Phosphatidylethanolamin PE − CH2 CH2NH3 Phosphatidylserin PS ( − CH2 CH2 NH3 COO − + ) Phosphatidsäure −H Tabelle 4 : Phospholipidtypen Die Kohlenwasserstoffketten (Acylgruppen) der Membranlipide können entweder in starrem, geordnetem Verbandoder in relativ ungeordnetem, „flüssigem“ Zustand existieren. Der starre Zustand wird begünstigt durch gesättigteFettsäuren, während ungesättigte Fettsäuren infolge der cis-Doppelbindung(en) die geordnete Packung der Acylkettenstören. Biologische Membranen sind asymmetrisch aufgebaut. Während PC vorwiegend und Glycolipide fastausschließlich auf der extrazellulären Seite der Lipidmembran gefunden werden, befinden sich PE und PS hauptsächlichauf der cytoplasmatischen Seite. Einige der neutralen Glycolipide sind für die Blutgruppenspezifität von roten Blutzellenverantwortlich. Abbildung 7 : Schnitt durch eine Lipid-DoppelschichtSchnitt durch eine Lipid-Doppelschicht, die in der Darstellung eine flüssigkeitsähnliche Packungsdichte der Kohlenwasserstoffketten aufweist. Im dargestellten 30x30 Å großenSchnitt befinden sich sechs Cholesterinmoleküle, fünf Glycerophospholipidmoleküle (3 Typen) und vier Sphingolipidmoleküle (2 Typen). Die OH-Gruppe des Cholesterinmolekülssitzt an der Oberfläche der Lipid-Doppelschicht, während das Steroid-Ringsystem sich im äußeren Anteil der Lipid-Doppelschicht befindet und mitverantwortlich ist für eineVersteifung der Doppelschicht in diesem Bereich.1 Endoplasmatisches Retikulum - 15 -
  13. 13. Bioanalytik Abbildung 8 : Diffusion von Phospholipidmolekülen in einer Lipid-DoppelschichtDie spontane “Flip-Flop-Bewegung” ist ein äußerst seltenes Ereignis. - 16 -
  14. 14. BioanalytikNucleïnsäuren Zur Reinigung und Trennung großmolekularer Nucleïnsäuren, deren Aufbau und Struktur hier nicht behandeltwerden soll, dienen ähnliche Methoden wie für Proteïne; die Gelchromatographie zur Trennung nach Molekülgröße unddie SDS-Gelelektrophorese zur Molekularmassebestimmung. Oligonucleotide können aufgrund ihres Gehalts an negativgeladenen Phosphatgruppen durch Ionenaustauschchromatographie getrennt werden. Nucleïnsäuren sind gutwasserlöslich, fallen aber in saurem Milieu aus. Gegen Wärme oder organische Lösungsmittel sind Nucleïnsäurenwesentlich stabiler als Proteïne. Chemisch können Nucleïnsäuren durch Kochen in Säure in die Bausteine Phosphat,Pentose und Nucleïnbasen zerlegt werden. Im Organismus werden sie durch Nucleasen verschiedener Spezifität zu Oligo-und Mononucleotiden hydrolysiert. Pankreatische Ribonuclease spaltet die Esterbindung zwischen der Phosphatgruppeeines Pyrimidinnucleotids und dem C 5 der Ribose des nächsten Nucleotids. Es entstehen freie Pyrimidin-3-phosphate undOligonucleotide mit einem Pyrimidin-3-phosphat am einen Ende.Die Purine und Pyrimidine haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm Das Absorptionsmaximum ist um rund 20 nm im kurzwelligeren Bereich des Spektrums als dasjenige der Proteïne.Die Extinktionskoëffiziënten der Purine und Pyrimidine sind wesentlich höher als diejenigen von Tryptophan undTyrosin. Im allgemeinen sind die Spektren aller Nucleïnsäuren gleich, allerdings gibt es gewisse von Struktur undKonformation abhängige Unterschiede. Zum Beispiel ändert sich das Spektrum von DNA bei der Denaturierung vondoppelsträngiger zu einsträngiger DNA.Das unterschiedliche UV-Spektrum von reduzierten und oxidierten Pyridinnucleotidenwird zur Messung vieler Enzymreaktionen benutzt Pyridinnucleotide (NAD+↔NADP+) absorbieren ebenfalls maximal bei 260 nm, der Nicotinamidrest zeigt zusätzlicheine vom Redoxzustand (NAD+↔NADH) abhängige Absorption im längerwelligen UV. Enzymreaktionen, die mit denReaktionen NAD+↔NADH oder NADP↔+NADPH gekoppelt sind, können daher bequem photometrisch verfolgtwerden. Die Methode, historisch als „Optischer Test nach Warburg" bekannt, wird im klinisch-chemischen Laboraußerordentlich häufig angewandt. - 17 -
  15. 15. BioanalytikpH-Messung und Titration Eine Säure kann nach Brönsted definiert werden als eine Substanz, die in Lösung in ein Wasserstoffion und diekonjugierte Base A- dissoziiert. Eine Base ist eine Substanz, die ein Wasserstoffion aufnehmen kann und dadurch zurkonjugierten Säure wird. Diese Beziehungen sind gegeben durch die folgenden Gleichgewichte: AH ⇔ A + + H − ( Säure ) B + H + ⇔ BH + (Base ) Formel 8 : Brönstedsche Säure-Base-Definition Je nach Lage des Gleichgewichts kann eine Säure in wässriger Lösung in der undissoziierten, der dissoziierten Formoder einer Mischung der beiden vorliegen. Wasserstoffionen existieren in wässriger Lösung nur in hydratisierter Form alsH3O+. Aus Gründen der Vereinfachung wird aber im folgenden auf diese Schreibweise verzichtet. Bei der acidimetrischen Titration von Säuren werden sowohl die freien wie auch alle potentiell dissoziierbarenWasserstoffionen (undissoziierte saure Äquivalenzen) erfasst. Bei der pH-Messung (pH = -log (H+)) wird nur die freieH+-Konzentration (bzw. Aktivität) gemessen. Starke Säuren sind in wässriger Lösung vollständig dissoziiert. Eine 0,1 M HCl-Lösung liegt beispielsweisevollständig in Form von H+ und Cl--Ionen vor und ergibt daher eine H+-Konzentration von 0,1 M = 10-1 M, also einen pH-Wert von 1. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern in diesem Fall das gleiche Resultat. Bei einer schwachen Säure ist die Dissoziation unvollständig. Das Gleichgewicht zwischen der dissoziierten undundissoziierten Form ist gegeben durch die Säuredissoziationskonstante Ka: [ A ] + [H ] =K − + [ AH ] a Gleichung 8 : Definition der Säuredissoziationskonstante Je schwächer eine Säure, desto kleiner ist Ka. Acidimetrische Titration und pH-Messung liefern ungleiche Resultate.Eine 0,1 M Essigsäurelösung ist z.B. nur zu 1,5 % dissoziiert. Ihr pH-Wert ist etwa 2,85. Gl. 8 gestattet die Berechnungdes pH-Wertes von wässrigen Lösungen schwacher Säuren, von Wasser, von wässrigen Lösungen von Salzen einerschwachen Säure und einer starken Base und von Mischungen der Lösungen solcher Salze und der zugehörigenschwachen Säure (Pufferlösungen).Berechnung des pH-Wertes einer schwachen Säure Wenn eine schwache Säure der Hauptlieferant von H+ ist, dann ist [H+] = [A-]. Gl. 8 wird somit umgeformt in: [H ] + 2 = Ka [ AH ] [ H ] = K [ AH ] + 2 a 2 ∗ log[ H ] = log K + log[ AH ] + a Gleichung 9 : Säuredissoziationskonstante einer schwachen Säure Bei einer schwachen Säure in einer Konzentration > 10 * Ka entspricht [AH] fast der ursprünglichenGesamtkonzentration c [mol/l], somit [ ] log H + = ( log K a + log c ) / 2 pH = ( pK a − log c ) / 2 Gleichung 10 : pH-Wert einer schwachen Säure wobei pKa = -log Ka. Damit lässt sich der pH-Wert einer schwachen Säure angenähert berechnen. Für 0,01 MEssigsäure (pKa 4,7) ist der berechnete pH-Wert 3,35.Berechnung des pH-Wertes von Wasser Wasser ist eine sehr schwache Säure und die Konzentration der undissoziierten Form (H 2O) ist praktisch in allenwässrigen Lösungen konstant (55 M). Das Dissoziationsgleichgewicht ist somit [ H ] ∗ [OH ] = 1,7 ∗10 + − −16 = KA 55 Gleichung 11 : Dissoziationsgleichgewicht von Wasser Daraus ergibt sich das Ionenprodukt, Kw, des Wassers - 19 -
  16. 16. Bioanalytik [H ] ∗ [OH ] = 10 + − −14 = K W ( 25°C ) Gleichung 12 : Ionenprodukt des Wassers In Abwesenheit anderer H -Donatoren ist [H+] = [OH-], und daher [H+]2 = l0-14, bzw. pH = 7. Dies ist der pH-Wert von +reinem Wasser. Wegen der Aufnahme von Kohlensäure aus der Luft ist der pH-Wert von destilliertem Wasser jedochmeist niedriger (≈ pH 5).Berechnung des pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachenSäure mit einer starken Base Salze starker Säuren mit starken Basen sind in wässriger Lösung annähernd neutral; hingegen sind Salze schwacherSäuren mit starken Basen leicht alkalisch. Ein solches Salz ist in wässriger Lösung vollständig dissoziiert: XA = X+ + A-.A- reagiert mit H2O gemäss A- + HOH = AH + OH-. Da die Menge von AH gleich der Menge des gebildeten OH- ist, undda [A-] praktisch gleich der Salz-Konzentration [Salz] ist, folgt aus Gl. 8 [ H ] = [ AHA] ∗]K + a = [OH ] ∗ K − a [ − [ Salz ] [OH ] = [ K ] − H W + [ H ] = [ HK ] ∗ [K ] + ∗ + a Salz W [ ] log H + = log KW K + log a − log [ Salz ] 2 2 2 pH = 7 + pK a + log [ Salz ] 2 2 Gleichung 13 : pH-Wertes einer Lösung des Salzes einer schwachen Säure mit einer starken Base Nach Gl. 13 ist der pH-Wert von 0,1 M Na-Acetat 8,85.Berechnung des pH-Wertes einer Pufferlösung Lösungen, die eine schwache Säure (AH) und deren Salz (X+, A-) enthalten, werden Pufferlösungen genannt. Siekönnen dank dem gleichzeitigen Vorhandensein der konjugierten Säure (AH) und Base (A-) Wasserstoffionen bindenoder abgeben. Sie vermögen deshalb Änderungen der H+-Konzentration bei Zugabe von Säuren oder Basen innerhalbenger Grenzen abzudämpfen. Dieses als Pufferwirkung bezeichnete Verhalten spielt eine grundlegende Rolle bei derAufrechterhaltung des pH-Wertes in physiologischen Systemen und auch bei der Kontrolle des pH-Wertes inExperimenten. Pufferlösungen können durch partielle Neutralisierung einer schwachen Säure mit einer starken Base (z.B. NaOH),oder praktischer durch Vermischen einer Lösung der Säure und der Lösung eines ihrer Alkalisalze hergestellt werden. Der pH-Wert einer Pufferlösung bekannter Zusammensetzung lässt sich nach Gl. 8 berechnen. Unter der Annahme,dass [AH] der zugegebenen totalen Säurekonzentration und [A-] der zugegebenen totalen Salzkonzentration entspricht(diese Annahme ist nur gültig im Bereich, wo der Anteil von Säure oder Salz mehr als 5 % oder weniger als 95 % ihrerSumme ausmacht), ergibt sich: [ H ] = K [[AH]] = K [ Säure] ] + A a − [ Salz a  [ Säure]  log[ H ] = log K +   [ Salz ]   a  pH = pK a + log [ Salz ] = pK + log A − [ ] [ Säure] a [ AH ] Gleichung 14 : Henderson-Hasselbalch-Gleichung Aus Gl. 14 folgt, dass pH = pKa, wenn [A-] = [AH]; d.h. der pH-Wert einer zur Hälfte neutralisierten schwachenSäurelösung entspricht ihrem pK a-Wert. Beispiele: Zu 10 ml 0,1 M Essigsäure werden 5 ml 0,1 M NaOH zugefügt. Damit wird die Hälfte der Essigsäure in die Salzformübergeführt, so dass [Salz]/[Säure] = 5/5 wird. - 20 -
  17. 17. Bioanalytik 5 pH = 4 ,7 + log = 4,7 + log 1 = 4 ,7( pH = pK a ) 5 Zu 10 ml 0,1 M Essigsäure werden 0,2 ml 1 M NaOH zugefügt. Das entspricht der Addition von 2 ml 0,1 N NaOH.Damit wird 1/5 der Essigsäure in die Salzform übergeführt, so dass [Salz]/[Säure] = 1/4 wird. 1 pH = 4 ,7 + log = 4,7 + log 0 ,25 = 4,7 + 0 ,4 − 1 = 4,1 4 Zu 10 ml 0,15 M Na2HPO4 werden 5 ml 0,15 M NaH2PO4 zugefügt (pKa2 = 7,2) 10 pH = 7 ,2 + log = 7 ,2 + 0,3 = 7 ,5 5 Aus je 0,3 M Na2HPO4 und NaH2PO4 soll eine 0,15 M Phosphatpufferlösung mit pH = 7,4 hergestellt werden. 7 ,4 = 7 ,2 + log [ Salz ] [ Säure] log [ Salz ] = 7 ,4 − 7 ,2 = 0,2 = [ Salz ] = 1,58 [ Säure] [ Säure] Also müssen 1,58 Teile 0,3 M Na2HP04, 1 Teil 0,3 M NaH2P04 und 2,58 Teile H20 gemischt werden.Ampholyte Substanzen, welche sowohl saure wie basische Gruppen enthalten, nennt man Ampholyte, z.B. Aminosäuren sindAmpholyte. Bei Säurezusatz verhalten sich Aminosäuren wie Basen, bei Basenzusatz wie Säuren (Zwitterionen): Formel 9 : Ampholyt Am isoelektrischen Punkt (IEP) liegen sie als Zwitterionen vor. Der isoelektrische Punkt ist derjenige pH-Wert, beiwelchem die Nettoladung der Aminosäure gleich Null ist. Bei diesem pH-Wert wandert die Aminosäure in einemelektrischen Feld nicht. Da Proteïne aus Aminosäuren zusammengesetzt sind, sind Proteïne auch amphoter und weisenauch einen IEP auf. Der IEP eines Proteïns wird durch Elektrophorese bestimmt: Der pH-Wert der Proteïnlösung wird solange variiert, bis keine Wanderung im elektrischen Feld mehr feststellbar ist.Berechnung des isoelektrischen Punktes einer Aminosäure Der pKa-Wert der Carboxylgruppe wird pK1 genannt, derjenige der Aminogruppe pK2. Am isoelektrischen Punkt ist 1 pH = ∗ ( pK 1 + pK 2 ) 2 Glycin: pK 1 = 2,34 pK 2 = 9 ,60 IEP = 5,97 Gleichung 15 : IEP einer Aminosäure Saure und basische Aminosäuren haben 3 pKa-Werte: Formel 10 : Dissoziation von sauren und basischen Aminosäuren (Aspartat) pK1 = 1,88, pK2 = 3,65, pK3 = 9,60, IEP = 2,77 - 21 -
  18. 18. Bioanalytik Aminosäure Carboxylgruppe Α-Aminogruppe Seitenkettengr.2 IEP (protonierte Form) Glycin 2,30 9,60 5,95 Asparaginsäure 1,90 9,60 3,70 (β-COOH) 2,80 Glutaminsäure 2,20 9,70 4,30 (α-COOH) 3,50 Tyrosin 2,20 9,10 10,10 (-OH) 5,65 Cysteïn 1,90 10,70 8,40 (-SH) 5,15 Histidin 1,80 9,20 6,0 (Imidazolium) 7,60 Lysin 2,20 9,00 10,5 (ε-NH3+) 9,75 Arginin 2,20 9,00 12,5 (Guanidinium) 10,75 Tabelle 5 : pKa- und IEP-Werte einiger AminosäurenTitrationskurven zeigen die Abhängigkeit des pH-Wertes vom Verhältnis Base / Säure Der Verlauf der Titrationskurve einer einzelnen protonierbaren Gruppe wird von der Henderson-HasselbalchschenGleichung vorausgesagt. Die Titrationskurve eines Gemisches von Aminosäuren oder einer Proteïnlösung ist die Summeder Titrationskurven der einzelnen ionisierbaren Gruppen. In der Praxis wird statt des Verhältnisses Base / Säure dieMenge der zugegebenen Base gegen den pH-Wert aufgetragen. Titrationskurven zeigen anschaulich, dass bei Zugabeeiner gleich großen Menge Base oder Säure die pH-Änderung im Bereich der pK-Werte gering, im Bereich derÄquivalenzpunkte groß ist. Als Faustregel gilt: Aminosäuren (aber auch andere Säuren und Basen) puffern gut im pH-Bereich von pK ±0,5.pH-Indikatoren sind schwache Elektrolyte, bei denen die protonierte und die nicht-protonierte Form verschiedenfarbig sind Sie wechseln deshalb im Bereich ihres pK a über ein Intervall von 1-2 pH-Einheiten die Farbe. Statt eine Titration ampH-Meter zu verfolgen, kann durch Zusatz eines geeigneten Indikators der Endpunkt der Titration am Farbwechsel desIndikators erkannt werden.2 In Proteïnen gelten oft andere pK-Werte, weil im Proteïnverband räumlich benachbarte Seitenketten sich gegenseitig beeinflussen können. Beispiel: -COO -,NH3+-, pKNH2 steigt, pKCOO- sinkt. - 22 -
  19. 19. BioanalytikElektrophorese Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von geladenen Partikeln in einem elektrischen Feld. Je nachdem,ob die Nettoladung dieser Substanzen positiv oder negativ ist, wandern sie zur Kathode (negativer Pol) oder zur Anode(positiver Pol). Unterschiede in der Nettoladung äußern sich in Unterschieden der Wanderungsgeschwindigkeit undkönnen so zur Trennung von Substanzgemischen verwendet werden. Die Elektrophorese ist eine wichtige Methode zurTrennung von Aminosäuren, Peptiden und Proteïnen. Wegen ihres Ampholytcharakters wandern diese Verbindungen jenach ihrem isoelektrischen Punkt (IEP) und je nach dem pH-Wert des Milieus zur Kathode oder zur Anode. Wenn derpH-Wert dem IEP des Ampholyts entspricht, erfolgt keine Wanderung. Die gebräuchlichste Methode zur Auftrennung von Gemischen ist die Zonenelektrophorese. Eine kleine Menge deszu trennenden Gemisches wird als schmale Zone auf einem mit Puffer getränkten Träger aufgetragen. ÜblicheTrägermaterialien sind Agarose-Gel und Polyacrylamid-Gel. An den Elektrophorese-Träger wird eine Gleichspannungangelegt. Unter dem Einfluss des im Streifen wirksamen elektrischen Feldes kommt es zur räumlichen Auftrennung derKomponenten, die durch geeignete Anfärbemethoden lokalisiert und auch quantitativ bestimmt werden können. Abbildung 9 : Elektropherogramm von Serum eines Menschen a) angefärbter Elektrophoresestreifen b) die bei der photometrischen Auswertung der Farbbänder entstandene Extinktionskurve; die Zahlen geben die Anteile der Fraktionen in Prozenten an, die durch Integration der Flächen unter den einzelnen Peaks der Extinktionskurve ermittelt werden. Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel Moleküle aufgrundihrer Ladung und ihrer Größe aufgetrennt werden. Während auf Agarose die Serumproteïne nur in die größeren GruppenAlbumin, α1- und α2-, β1- und β2-, und γ-Globuline aufgetrennt werden, vermag die Polyacrylamid-GelelektrophoreseDutzende verschiedener Serumproteïne zu unterscheiden. Ausschließlich nach der Größe aufgetrennt werden Proteïne inder SDS-Gelelektrophorese.Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit geladenerTeilchen im elektrischen Feld Auf ein Teilchen mit der Ladung Q wirkt im elektrischen Feld E (V/cm) die Kraft Q*E, so dass dieWanderungsgeschwindigkeit des Teilchens v = Q*E/f beträgt. Für den Idealfall einer Kugel ist der Reibungskoëffiziëntf = 6*πηr (r = Stokesscher Radius, η = Viskosität des Mediums). Gl. 8 zeigt, dass die Wanderungsgeschwindigkeitproportional zum Spannungsabfall (= Feldstärke = Spannung pro Längeneinheit des Elektrophoresestreifens, V/cm) undproportional zur Ladung des wandernden Teilchens ist. Die Ladung ist bei Aminosäuren und Proteïnen vom pH-Wertabhängig. Der Reibungskoeffizient f ist abhängig von Form und Größe der Teilchen und von der Viskosität des Mediums. Bei der Elektrophorese entsteht Wärme. Die pro Zeiteinheit gebildete Wärme H beträgt R*I2 (R = elektrischerWiderstand, I = Stromstärke). Bei der Hochspannungselektrophorese (Feldstärken bis einige 100 V/cm und Stromstärkenvon gegen 1 Ampère) wird die entstehende Wärme mit einem Kühlsystem abgeführt. - 23 -
  20. 20. BioanalytikChromatographie Chromatographische Trennmethoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich die zu trennenden Substanzen je nachihren physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen einer stationären und einer mobilen Phase ungleich verteilen. Dieverschiedenen Verfahren können grob klassifiziert werden in Verteilungschromatographie (Papier-, Dünnschicht-,Gaschromatographie), Adsorptionschromatographie (Ionenaustauscher-, Affinitätschromatographie) undGelchromatographie (Gelfiltration). Die Verteilungschromatographie beruht auf der verschiedenen Löslichkeit der zutrennenden Substanzen in den Phasen. Bei der Adsorptionschromatographie wirken verschieden starke nicht-kovalenteBindungskräfte zwischen den zu trennenden Substanzen und den Molekülen der einzelnen Phasen. In derGelchromatographie beruht die Trennung auf der räumlich begrenzten Zugänglichkeit der verschiedenen Phasen fürunterschiedlich große Moleküle. Während der chromatographischen Trennung werden die stationäre und die mobilePhase gegeneinander verschoben. Verschiedene Kombinationen von festen, flüssigen und gasförmigen Phasen sind jenach Chromatographietyp möglich. Eine Übersicht gibt die folgende Tabelle. Phase 1 Phase 2 Typ (stationär) (mobil) H2O in Cellulosematrix desPapierchromatographie organisches Lösungsmittel PapiersDünnschichtchromatographie (TLC, organische Lösungsmittel (im Gemisch Aluminiumoxid, Kieselgel etc.HPTLC) mit Säuren oder Laugen)Gaschromatographie (GC) Silikone auf inertem Träger H2, He, N2Flüssigkeitschromatographie organische Lösungsmittel (im Gemisch Modifizierte Kieselgele, etc.(HPLC) mit Säuren oder Laugen)Ionenaustauschchromatographie Ladungen auf inertem Träger Elektrolyt (Puffer)(IC) Spezifischer Ligand aufAffinitätschromatographie Puffer, Lösungsmittel inertem Träger Puffer im Raum innerhalb derGelchromatographie Puffer außerhalb der Partikel Partikel Tabelle 6 : Chromatographietypen Die einzelnen Chromatographietypen können nicht immer eindeutig der Verteilungs-, Adsorptions- oderGelchromatographie zugeordnet werden. Beispielsweise beobachtet man bei der Papierchromatographie gelegentlich auchAdsorption an das Papier. Oder im Falle der Gelchromatographie werden aromatische Verbindungen wegen Adsorptionan die Gelpartikel besonders langsam aus den Gelpartikeln eluiert.Der Rf-Wert ist ein Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in Papier-und Dünnschichtchromatographie Der Rf-Wert ist der Quotient aus der Wanderungsdistanz der Substanz und der Lösungsmittelfront. Startpunkt bis Fleckenmitte Rf = Startpunkt bis Lösungsmittelfront Gleichung 16 : Allgemeine Definition des Rf-Wertes Der Rf-Wert ist für eine Substanz in einem bestimmten Lösungsmittelsystem und bei konstanter Temperaturcharakteristisch. Zur Identifikation ist aber der direkte Vergleich von unbekannter Substanz und Referenzsubstanz imgleichen Chromatogramm zuverlässiger. In der Gelchromatographie ist der Verteilungskoeffizient K d eine dem Rf-Wertentsprechende Größe.Ionenaustauscher-Chromatographie Bei dieser Art von Chromatographie werden gelöste Ionen gegen Ionen gleichen Vorzeichens, die an ein unlöslichesGegenion auf einem festen Träger gebunden sind, ausgetauscht. Auf diesem Prinzip beruht die Enthärtung von Wasser,bei der Ca2+ des „harten" Wassers gegen Na + von unlöslichem Zeolith (= Natrium-Aluminiumsilikat) ausgetauscht wird.Der entstehende Ca-Zeolith kann durch Waschen mit einer konzentrierten NaCl-Lösung wieder zum Na-Zeolithregeneriert werden. Die meisten Ionenaustauscher sind synthetische Polymere (Kunstharze), welche saure oder basische Gruppenenthalten. Austauscher-Harze kann man nach dem pK-Wert ihrer ionischen Gruppen einteilen. Ein stark saurerKationenaustauscher kann z.B. -S0 3 - Gruppen enthalten, ein schwach saurer z.B. -COO - Gruppen. Den Austausch kannman sich folgendermaßen vorstellen: Harz − SO3 Na + + R − NH 3 ⇒ Harz − SO3 H 3 N − R + Na + − + − Harz − NH 3 Cl − + R − COO − ⇒ Harz − NH 3 OOC − R + Cl − + + Formel 11 : Ionen-Austausch am Austauscherharz - 25 -
  21. 21. Bioanalytik Abbildung 10 : Trennung von zwei Aminosäuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz Bei pH 1 liegen A1 und A2 als Kationen vor. Beide werden am Kationenaustauscher adsorbiert und wandern nur sehrlangsam. Bei pH 6 liegt A1 als Kation vor. A2 wird als ungeladenes Zwitterion nicht adsorbiert und wandert deshalbschneller als A1. Statt einen Puffer konstanter Zusammensetzung zur Elution zu verwenden, können z.B. bei einemKationenaustauscher der pH-Wert oder die Ionenstärke oder beide schrittweise (schrittweise Elution) oder kontinuierlich(Gradientenelution) erhöht werden. Dadurch kann die Elution der aufgetrennten Komponenten beschleunigt werden. DieAminosäuren eines Proteïnhydrolysats werden im automatischen Aminosäuren-Analysator durchIonenaustauschchromatographie quantitativ aufgetrennt (s. Abb. 11). Abbildung 11 : Analyse von Aminosäuren mit Hilfe einer HPLC an einem Kationenaustausscher-HarzDie Fläche unter jedem Signal des Chromatograms ist der Menge jeder in der Mischung vorhandenen Aminosäure proportional.Gelchromatographie Vernetztes Dextran („Sephadex“) bildet in gequollenem Zustand ein poröses Gel. Das Flüssigkeitsvolumen innerhalbder Gelpartikel ist bei einem gegebenen Grad der Vernetzung nur für gelöste Moleküle unterhalb einer bestimmten Größezugänglich. Die Verteilung von gelösten Molekülen innerhalb und außerhalb der Gelpartikel ist somit abhängig vomzugänglichen Volumen innerhalb der Gelpartikel. Das Totalvolumen (Vt) einer Sephadex-Säule ist die Summe desVolumens außerhalb der Gelpartikel (Vo), des Volumens innerhalb der Gelpartikel (Vi) und des Volumens derGelsubstanz selbst (Vg): Vt = V0 + Vi +V g Gleichung 17 : Volumenverteilung in einer "Sephadex"-Säule Das Elutionsvolumen (Ve) einer Substanz ist abhängig von Vo und vom „Verteilungskoëffiziënten“ Kd, der denBruchteil des Vi angibt, der für die Substanz zugänglich ist. Ve = V0 + K d ∗Vi Gleichung 18 : Abhängigkeit des Elutionsvolumens einer Substanz - 26 -
  22. 22. Bioanalytik Für große Moleküle, die nicht in das Gel eindringen können, ist Kd = 0, somit Ve = Vo. Für kleine Moleküle, dievollständig in das Gel eindringen können, ist Kd = 1, somit Ve = Vo+Vi. Für Moleküle mit einem Kd zwischen 0 und 1 gilt: V0 < Ve < (V0 + Vi ) Je nach der Größe der Moleküle, die voneinander getrennt werden sollen, wird verschieden stark vernetztes Sephadexverwendet. Die gebräuchlichsten Typen sind: Ausschluss- Sephadex Molekularmasse G- 25 > 5.000 G- 50 > 25.000 G- 75 > 50.000 G-200 >200.000 Tabelle 7 : Ausschluss-Molekularmassen einiger "Sephadex"-Gele Sephadex G-25 eignet sich wie die Dialyse besonders zur Entsalzung von Makromolekülen. Sephadex G-50, G-75 undG-200 werden zur Trennung verschieden großer Proteïne verwendet. Sie dienen auch zur Schätzung der molekularenGröße und damit der Molekülmasse eines Proteïns. Als Referenzen braucht man die Elutionsvolumina von Proteïnen mitbekannter Molekularmasse. Für globuläre Proteïne ist das Verhältnis Ve/Vo über einen weiten Bereich umgekehrtproportional zum Logarithmus der Molekularmasse. Abbildung 12 : log Molekularmasse gegen Elutionsvolumen Die Abb. 12 zeigt solche Kurven für Sephadex G-50 und G-200. Die gesuchte Molekülmasse eines Proteïns erhältman anhand der Kurven aus dem gemessenen Elutionsvolumen. - 27 -
  23. 23. BioanalytikPhotometrieGesetz von Lambert-Beer Wird Licht durch eine Farbstofflösung gestrahlt und dabei absorbiert, so ist die Intensität des austretenden Lichts ( I)kleiner als diejenige des eintretenden Lichts (I0). Der Quotient I/I0 wird als Durchlässigkeit D oder Transmission Tbezeichnet und ist abhängig von der Konzentration c des Farbstoffs und der Schichtdicke d: D = I/I0 = l0-k@c@d. D wird oftin % angegeben. %D = 100*I/I0. Ein für photometrische Messungen gebräuchlicheres Maß ist die Extinktion E oder optische Dichte OD. Sie ist direktproportional zu c und d:  I  E = − log I  = − log D = k ∗ c ∗ d   0  Gleichung 19 : Definition der Extinktion E (optischen Dichte OD) Der Extinktionskoëffiziënt k ist charakteristisch für die absorbierende Substanz und ist abhängig von der Wellenlänge.Der numerische Wert von k ist ferner abhängig von den Einheiten von c und d. Wird der molare Extinktionskoëffiziënt εverwendet, wird d in cm und c in mol/Liter (M) angegeben. Die Dimension ist dann M-1*cm -1. Der molareExtinktionskoëffiziënt entspricht also der Extinktion einer 1 M Lösung der betreffenden Substanz bei einer Schichtdickevon 1 cm. Bei stark absorbierenden Substanzen ist der millimolare Extinktionskoëffiziënt gebräuchlicher ( εmM = ε/1000).Für Tryptophan beträgt εmM = 6 [mM-1*cm-1] bei 280 nm, für ATP 15 mM-1*cm-1 bei 260 nm. Zwischen % Durchlässigkeit und Extinktion besteht die Beziehung:  I  log %D = log 100 + log I  =2−E   0  Gleichung 20 : Bezeihung zwischen %D und E Durchlässigkeiten von 100 %, 10 %, 1 % entsprechen die Extinktionen 0, 1,0 und 2,0. Die meisten Photometer sindmit einer %D-Skala (linear) und einer E-Skala (logarithmisch) ausgerüstet.Konzentrationsbestimmung durch Photometrie Nach dem Gesetz von Lambert-Beer kann eine unbekannte Konzentration graphisch bestimmt werden. Zuerst werdendie Extinktionen (E1, E2, E3, E4) von Standardlösungen bekannter Konzentrationen (c1, c2, c3, c4) als Kalibrierkurveaufgezeichnet. Die Werte sollen auf einer Geraden liegen, die durch den Nullpunkt geht. Abweichungen von derLinearität können bei höheren Konzentrationen auftreten. Die unbekannte Konzentration cx kann aus der gemessenenExtinktion Ex auf der Kalibriergeraden abgelesen werden. Bereich, in dem das Lambert-Beer Gesetz nicht mehr erfüllt ist Abbildung 13 : Gültigkeitsbereich des Lambert-Beer GesetzesPhotometer und Spektralphotometer Das Lambert-Beer Gesetz gilt nur für monochromatisches Licht. Um eine möglichst große Extinktion zu erhalten,wird monochromatisches Licht gewählt, das zur Farbe der absorbierenden Substanz komplementär ist.Monochromatisches Licht wird beim Photometer durch die Verwendung eines Filters erzeugt, beim Spektralphotometerdurch ein Prisma oder ein Diffraktionsgitter. - 29 -
  24. 24. BioanalytikSchematische Darstellung eines Spektralphotometers Lichtquelle Monochromator Probenraum Photoelektrischer Empfänger mit Anzeigegerät Abbildung 14 : Schematische Darstellung eines Spektralphotometers1 Lichtquelle 2 Eintrittsspalt 3 Prisma oder Diffraktionsgitter 4 Drehmechanismus für Prisma5 Skala mit Angabe der Wellenlänge 6 Austrittsspalt 7 Küvette mit Lösung 8 Photozelle, wandelt Lichtimpulse in Strom um9 Elektronischer Verstärker 10 Regulier-Potentiometer 11 Ampèremeter mit %D- und E-SkalaPraktisches Vorgehen bei der Photometrie Extinktionswerte sind keine absoluten Größen, sondern Relativwerte bezogen auf eine Blindprobe. Als Blindwert dientgewöhnlich der verwendete Puffer. Vor der Messung der Extinktion E muss das Photometer mit dem Blindwert wie folgtkalibriert werden: 1. Lichtweg schließen, Photometeranzeige auf %D = 0 einstellen durch Kompensation des sogenannten Dunkelstroms (geschieht bei neueren Geräten automatisch). 2. Lichtweg öffnen, Blindprobe in den Lichtweg bringen, auf Photometeranzeige E = 0 einstellen durch Veränderung der Verstärkung des Photostroms (Nullpunkt-Abgleichung, "zero adjustment"). 3. Probe in den Lichtweg bringen und E ablesen. Wird die Wellenlänge verändert, so muss das Photometer wieder neu kalibriert werden, weil sich die Intensität derLichtquelle und die Empfindlichkeit der Photozelle mit der Wellenlänge ändert. - 30 -
  25. 25. BioanalytikEnzymreaktionen An fast allen chemischen Umsetzungen im Organismus sind Enzyme beteiligt. Enzyme sind Katalysatoren, welche dieStoffwechselprozesse unter den milden Bedingungen in der Zelle (niedrige Metabolitkonzentrationen, niedrigeTemperatur, neutraler pH-Wert) ermöglichen. Die wesentliche Eigenschaft eines Enzyms ist sein Vermögen, eine spezifische Reaktion ganz enorm zu beschleunigen(= katalysieren). Dabei werden die Geschwindigkeiten der Vorwärts- und der Rückwärts-Reaktion proportional erhöht,d.h. das chemische Gleichgewicht der Reaktion wird nicht verändert. Die im Reaktionsablauf verbrauchteVerbindung bezeichnet man als Substrat, die neugebildete als Produkt. Bei der Rückwärtsreaktion sind die Begriffevertauscht (z.B. Acetaldehyd und Ethylalkohol sind je nach Reaktionsablauf entweder Substrat oder Produkt der Alkohol-Dehydrogenase). Enzymreaktionen lassen sich durch Bestimmung der Menge des in der Zeiteinheit gebildeten Produktsoder des verbrauchten Substrats messen. Die reaktionsbeschleunigende Wirkung von Enzymen wird als Enzymaktivitätbezeichnet. Enzyme sind Proteïne und als solche empfindlich gegen denaturierende Einflüsse (Wärme, Säuren, Basen etc.). DieAminosäurensequenz und die räumliche Struktur verschiedener Enzyme sind heute bekannt. Die Molekularmassen Mrliegen zwischen 104 und 106 (Beispiele: Lysozym 14.400, Phosphorylase a 390.000). Viele, aber nicht alle Enzymebestehen aus mehreren Peptidketten (Quartärstruktur). Denjenigen Teil eines Enzymmoleküls, an den das Substrat (bzw.Produkt) bindet und wo die katalytische Umsetzung stattfindet, bezeichnet man als aktive Stelle. Sie umfasst u.a. die andiesen Prozessen direkt beteiligten Aminosäurereste. Bei gewissen Enzymen enthält die aktive Stelle auch nicht-proteïnartige Bestandteile (prosthetische Gruppen). Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion hängt von folgenden Reaktionsbedingungen ab. 1. Substratkonzentration 2. Enzymkonzentration und Enzymaktivität 3. pH-Wert 4. Temperatur 5. Konzentration von Inhibitoren und Aktivatoren Die Untersuchung der Abhängigkeit der Enzymaktivität von diesen Faktoren ist das Gebiet der Enzymkinetik.Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration Im Laufe einer durch ein Enzym E katalysierten Umwandlung von Substrat S in Produkt P entstehen ein Enzym-Substrat-Komplex ES und ein Enzym-Produkt-Komplex EP als Zwischenformen. Die Reaktionssequenz ist entsprechend: E + S ⇔ ES ⇔ EP ⇔ E + P Formel 12 : Formaler Ablauf einer enzymatischen Reaktion Es ist schwierig, aus diesem allgemein gültigen Schema (6 Teilreaktionen) eine experimentell leicht nachprüfbareBeziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Substratkonzentration abzuleiten. Zur Vereinfachungbeschränkt man sich deshalb auf Bedingungen, unter denen die Reaktion nur in einer Richtung abläuft, d.h. dieRückwärts-Reaktion P ⇒ S vernachlässigt werden kann. Dies ist der Fall am Anfang der Reaktion, solange dieKonzentration von P verschwindend klein ist im Vergleich zur Konzentration von S, oder unter Bedingungen, unterdenen das Produkt laufend abgefangen wird. Das Reaktionsschema ist dann: E + S ⇒ ES ⇒ EP ⇒ E + P Formel 13 : Reaktionsschema einer "normalen" enzymatischen Reaktion Wenn man weiter darauf verzichtet, den ES- und EP-Komplex gesondert zu betrachten (nur die Geschwindigkeit derersten Teilreaktion, der Bildung des ES-Komplexes, ist abhängig von der Substratkonzentration), ergibt sich alseinfachste Formulierung: E + S k11 ⇒ ES ⇒ E + P k− Formel 14 : Einfachste Formulierung einer enzymatischen Reaktion wobei k1, k-1 und k2 die Geschwindigkeitskonstanten der Teilreaktionen sind. Aus diesem Schema lässt sich einequantitative Beziehung zwischen der Anfangsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion und derSubstratkonzentration ableiten (Henry, 1903; Michaelis und Menten, 1913; Briggs und Haldane, 1925). Die Herleitung ist wie folgt: Die Geschwindigkeit, mit der die Konzentration des Produkts P zunimmt, ist d [ P] v= = k 2 [ ES ] dt Gleichung 21 : Geschwindigkeit der Produktentstehung Da v am Anfang der Reaktion, (d.h. solange die Substratkonzentration sich nicht merkbar verändert hat) konstantbleibt, folgt aus Gl. 21, dass ES ebenfalls konstant ist. Dies bedeutet, dass die Bildungs- und Zerfallsgeschwindigkeitenvon ES gleich groß sind (= Fliessgleichgewichtszustand). Daraus folgt: - 31 -
  26. 26. Bioanalytik k1 [ E ][ S ] = ( k −1 + k 2 )[ ES ] Gleichung 22 : Fliessgleichgewicht einer enzymatischen Reaktion Wir setzen für [E] = [Et]-[ES] ein, wobei [Et] die messbare Gesamtkonzentration des Enzyms darstellt. Eingesetzt inGl. 22 erhalten wir für [ES] k1 [ Et ][ S ] [ ES ] = k −1 + k 2 + k1 [ S ] Gleichung 23 : Umformung der Gl. 22 Gl. 23 können wir jetzt in Gl. 21 einsetzen, d.h. wir drücken die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion alsFunktion der gesamten Enzymkonzentration und der Konzentration des freien Substrats aus: k 2 k1 [ E t ][ S ] v = k 2 [ ES ] = k −1 + k 2 + k1 [ S ] Gleichung 24 : Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion Gl. 24 ist bereits die gesuchte Geschwindigkeitsgleichung für unsere Enzymreaktion, wenn auch noch nicht in derüblichen Form. Diese erhalten wir, indem wir Zähler und Nenner durch k 1 teilen: k 2 [ Et ][ S ] V [S] v= = max k −1 + k 2 Km + [S] + [S] k1 Gleichung 25 : Michaelis-Menten-Gleichung Dieses ist die Michaelis-Menten-Gleichung. Sie beschreibt die Anfangsgeschwindigkeit einer Enzymreaktion unterder Annahme des Fliessgleichgewichts. Die Konstanten Km und Vmax sind definiert als k −1 + k 2 Km = k1 Vmax = k 2 [ Et ] Gleichung 26 : Definition der Konstanten der Michaelis-Menten-Gleichung Km wird Michaeliskonstante genannt. Vmax ist die maximale Geschwindigkeit, die bei der Konzentration [Et] erreichtwerden kann. Sie entspricht dem Zustand, wo alle Enzymmoleküle als ES vorliegen, also [ES] = [Et]. Weil beiEnzymreaktionen [Et] << [St], kann man in Gl. 25 für [S] die Gesamtkonzentration des Substrats einsetzen. Nach Gl. 25 ist v eine hyperbolische Funktion von [S]. Abbildung 15 : Abhängigkeit der Aktivität von der Substratkonzentration (v gegen [S]-Darstellung)Bedeutung von Km und Vmax Die Michaelis-Menten-Gleichung liefert eine Arbeitsdefinition von Km. Km hat die Dimension einer Konzentration undentspricht numerisch derjenigen Substratkonzentration, bei welcher bei gegebener Enzymkonzentration die halbmaximaleReaktionsgeschwindigkeit erreicht wird (Substitution von v = Vmax/2 in Gl. 25 ergibt Km = [S]). Km kann als reziprokesMaß der „Affinität" von S zu E aufgefasst werden. Je größer die Affinität eines Substrats zum Enzym ist, desto kleiner istdie zum Erreichen der halbmaximalen Umsatzgeschwindigkeit benötigte Substratkonzentration, d.h. ein kleines Kmentspricht einer großen „Affinität" und umgekehrt. Es muss allerdings betont werden, dass Km nicht dieDissoziationskonstante Kd = k-1/k1 des Enzym-Substrat-Komplexes darstellt. Wie der obere Teil der Gl. 26 zeigt, ist Kmdurch drei Geschwindigkeitskonstanten bestimmt. Lediglich im Spezialfall k2 << k-1 wird der numerische Wert von Kmetwa gleich demjenigen von Kd der Reaktion E + S → ES. In allen andern Fällen ist Km > Kd. - 32 -

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