Mª Isabel Prieto Santos – Jefe de Servicio de Biotecnología del Centro Nacional de Alimentación (CNA).

1. HERRAMIENTAS PARA LA DETECCIÓN DE
ALÉRGENOS: ESTADO ACTUAL, RETOS Y NECESIDADES
ACTUACIONES DEL CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
CENTRO NACIONAL
DE ALIMENTACIÓN
Mª Isabel Prieto Santos
Servicio de Biotecnología
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos
FIAB Madrid, 18 de octubre de 2016

2. Centro
Nacional de
Alimentación
 Métodos de detección de alérgenos
Características y limitaciones
 Posibles soluciones
 Retos
 Conclusiones
Índice:
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid 18 de octubre de 2016

3. Centro
Nacional de
Alimentación
REGLAMENTO (UE) Nº 1169/2011 (Anexo II): Sustancias que causan alergias o intolerancia:
Cereales con gluten
Crustáceos
Huevos Pescado
Cacahuetes
Soja Leche Frutos de cáscara
Apio Mostaza
Sésamo Sulfitos Altramuces Moluscos
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4. Centro
Nacional de
Alimentación
Estado Actual
Limitaciones en la aplicación de la legislación UE en el
etiquetado de alérgenos
• Falta de criterios normativos para la detección (Métodos de
detección)
• Falta de umbrales de alérgenos (Límite de detección)
Involuntaria - Contaminación cruzada
Excesivo etiquetado de precaución, sin relación con el
riesgo real:
´puede contener trazas de …
‘producido en una fabrica que utiliza….…
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid 18 de octubre de 2016

5. Centro
Nacional de
Alimentación
Detección de ADN del alimento alergénico
 Métodos inmunológicos
 Métodos Cromatográficos
Métodos de Análisis de Alérgenos
 Métodos Biología Molecular
Detección proteína o proteínas alergénicas
Detección proteína o fracciones de proteínas (péptidos)
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6. Centro
Nacional de
Alimentación
Métodos Inmunológicos: La mayoría de los kits comerciales
disponibles para el análisis en rutina de alérgenos de alimentos se
basan en métodos inmunológicos. Los Ensayos inmunoenzimático
(ELISA) son los más ampliamente utilizados debido a que son
sensibles y específicos para la detección de proteínas alergénicas y
fáciles de usar.
Sin embargo, los kits comerciales para análisis cuantitativos utilizan
diferentes tampones de extracción y diferentes calibrantes, se
diferencian en la calidad de los anticuerpos utilizados y los
resultados varían entre marcas comerciales y lotes.
Las principales limitaciones incluyen efectos de la matriz, la
extracción insuficiente de la proteína, la insuficiente especificidad
debido a reacciones cruzadas y la insuficiente reproducibilidad de
los resultados.
Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,
EFSA Journal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016

7. Centro
Nacional de
Alimentación
Métodos basados en la detección de una o más proteínas
o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión
específica antígeno-anticuerpo
Métodos Inmunológicos
Enzimoinmunoensayo ELISA
TIRAS Inmunoreactivas (LFD)
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8. Centro
Nacional de
Alimentación
Características de los sistemas Inmunológicos
• Alta sensibilidad
• Cuantitativos
• Aplicación Materias Primas y
Producto Procesado
• Equipamiento: Lector de microplacas
• Experiencia su realización
• Muy sencillos
• Cualitativos/semicuantitativos
• Rápidos ( 5-10 minutos)
• Útiles “Control de Riesgo” (APPCC)
• Materias primas
• Sensibilidad declarada
(entre 1 mg/kg - 10 mg/kg )
• Requieren confirmación
ELISA
Tiras (FDL)
• Detectan Proteínas Alergénicas
• Especificidad
• Sensibilidad
• Fácil Realización
• Gran disponibilidad en el mercado
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9. Centro
Nacional de
Alimentación
Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-1
Extracción de proteínas alergénicas
 Efecto de la matriz (grasas, taninos,
acidez, etc...)
 Efecto del procesado (tratamiento
térmico, hidrólisis, fermentación etc…)
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10. Centro
Nacional de
Alimentación
1.‐ Solución Cocktail con Etanol al 80% ‐‐ 2.‐ Solución de Guanidina / ‐mercaptoetanol /
Isopropanol ‐‐3.‐ Solución 1 con Gelatina de pescado ‐‐ 4.‐ Solución 1 con leche desnatada
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Estudio del efecto de los taninos de la fruta (CNA)
Matriz ricas en taninos
Matriz libre de taninos
mg/kg de gluten

11. Centro
Nacional de
Alimentación
▄ Sin desengrasar
▄ Desengrasado
Efecto del pH en la detección
de huevo en salsas
▄ pH ácido
▄ pH neutro
Determinación de caseína
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12. Centro
Nacional de
Alimentación
Diferencias de los Resultados en los distintos
sistemas ELISA
 Detectan diferentes proteínas
 Diferente anticuerpos
 Diferentes calibrantes
 Diferentes unidades de expresión de resultados
 Diferencia en los límites de detección
 Variación entre marcas comerciales y lotes
Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-2
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13. Centro
Nacional de
Alimentación
0
5
10
15
20
25
30
35
Cacahuete(mg/kg)
BioKits Romer Labs R-Biopharm Neogen
Resultados diferentes ELISAS
FAPAS Proficiency Test 2776C
FAPAS 2776‐ C
Cacahuete en chocolate
•Biokits 11,8 mg/kg
• Romer Labs 8,7 mg/kg
• R‐Biopharm 24,2 mg/kg
• Neogen 15,0 mg/kg
Valor asignado:
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14. Centro
Nacional de
Alimentación
TEPNEL
BIOKITSAgraQuant®
A B C D
Huevo 0,4 mg/kg 0,25 mg/kg 0,5 mg/kg 1 mg/kg
Caseína 0,2 mg/kg 0,25 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg
Β-lactoglobulina 10 μg/kg 0,2 mg/kg 5 mg/kg 0,1 mg/kg
Soja 40 μg/kg 0,3 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg
Cacahuete 1 mg/kg 1,5 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg
Diferente LD/LC
Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016

15. Centro
Nacional de
Alimentación
 β-lactoglobulina en un alimento :
Sistema A : < 10 µg/kg
Sistema C: < 5 mg/kg
RESULTADO :
NO DETECTADO
 Cacahuete en un alimento (1,5 mg/kg) :
Sistema A (LC 1 mg/kg): 1,5 mg/kg
Sistema C (LC 2,5 mg/kg): < 2,5 mg/kg ?
DETECTADO
NO DETECTADO
ETIQUETAR
NO ETIQUETAR
Ejemplos :
Qué pasa entre 10 µg/kg y 5 mg/kg ???
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16. Centro
Nacional de
Alimentación
rente expresión de resultados
función de la solución calibrante utilizada
s sistemas proponen conversiones en la expresión de resultados
HUEVO LECHE CACAHUETE
huevo entero en mg/kg proteína de leche cacahuete
proteína clara de mg/kg leche entera en
polvo
Proteína de cacahuete
ovomucoide mg/kg caseína
mg/kg β lactoglobulina

17. Centro
Nacional de
Alimentación
ción de muestras fortificadas con NIST SRM 8445
Comparativo kits ELISA Determinación de huevo
RAS
Valor Esperado
mg/kg
1 2 3 4
mg/kg (ppm) proteína
clara de huevo
mg/kg (ppm) mg/kg (ppm) mg/kg (ppm)
Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo
do 1,5 0,53 3,4 1,72 1,6
a 1,5 0, 75 2,4 1,7 1,6
do 3 1,1 5,6 3,15 4
a 3 1,21 6,8 3,05 3
do 6 3,2 9,5 6,1 5,6

18. Centro
Nacional de
Alimentación
o Comparativo kits ELISA Determinación de Avellana
1 2 3 4
LC LC LC LC
z ETIQUETADO
0,5 mg/kg de
Proteína de
avellana
1 mg/kg de
Avellana
2,5 mg/kg de
Avellana
2,5 mg/kg de
Avellana
NO ETIQUETADO > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg
inas
NO ETIQUETADO 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg
Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO
Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
Puede contener
trazas de nueces,
almendras y soja
NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
Trazas de frutos
secos
NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO

19. Centro
Nacional de
Alimentación
s Indirecto : Amplificación de un fragmento del gen del alérgeno o
na secuencia genética específica presente en el Alimento o
ente
ación
ados
PCR tiempo final
odos Biología Molecular

20. Centro
Nacional de
Alimentación
R tiempo real

21. Centro
Nacional de
Alimentación
os basados en la detección de ADN permiten la
ón del alimento alergénico, en lugar de la proteína
nica y son complementarios a ensayos inmunológicos. ADN
eralmente más estables que las proteínas y por lo tanto
do para el análisis de alimentos procesados. Los
imientos de extracción y amplificación están bien
cidos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tanto a
final como en tiempo real permiten el análisis que varios
nos a la vez. El análisis del ADN se convierte en el método de
n siempre que no están disponibles kits de ELISA o no sean
icos para el análisis de un alimento alergénico/ingrediente
ico (por ejemplo el apio). PCR en tiempo real puede
cionar resultados cuantitativos y permite el análisis de
Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,
nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf

22. Centro
Nacional de
Alimentación
blemas en la extracción (presencia de inhibición en
mentos procesados)
ultados cualitativos / semicuantitativos
• Cuantificación ng ADN (número de copias)
unos alérgenos no pueden diferenciarse por PCR
Carne vacuno /leche
aves /huevo
rente distribución entre ADN y proteína
ADN en baja concentración, leche, proteína de clara de huevo,
ciones analíticas de los métodos biológicos:

23. Centro
Nacional de
Alimentación
AD DE MEDIDA/EXPRESIÓN DE RESULTADOS
PROTEÍNAS ADN
Cantidad de ADN (nº de
copias) detectado
dad de ingrediente
énico o proteína
énica por kilo de
ento (mg/kg)
No se puede establecer una correlación
entre cantidad de PROTEÍNA y cantidad

24. Centro
Nacional de
Alimentación
SULTADOS PCR
stras fortificadas con 5 mg/kg
de Soja
Bollería Líquidos Salsas Postres

25. Centro
Nacional de
Alimentación
ación ELISA/PCR sobre muestras reales (Detección de Avellana)
MUESTRAS ELISA (mg/kg) PCR
Bollo 8 DETECTADO
Galleta de chocolate > 20 DETECTADO
Galletas < 2,5 NO DETECTADO
Bombón > 20 DETECTADO
Turrón de cacahuete < 2,5 DETECTADO
Cereales de trigo y chocolate > 20 DETECTADO
Barrita de cereales > 20 DETECTADO
Muesli > 20 DETECTADO
Barrita de trigo y chocolate > 20 DETECTADO
Cereales Fruta y fibra > 20 DETECTADO
Barquillo relleno de cacao > 20 DETECTADO
Bizcocho cubierto de chocolate < 2,5 NO DETECTADO
Copos de maíz < 2,5 NO DETECTADO
Desayuno a la taza < 2,5 NO DETECTADO
RAS DUDOSAS
ontener trazas
avellana)
UESTRAS
VAS (No figura
RAS POSITIVAS
avellana como
rediente)

26. Centro
Nacional de
Alimentación
LC MS/MS
NA
ica
Digestión Enzimática
IONES:
dificultad analítica
AS :
dianas en un único análisis
Péptidos
Cromatografía:
HPLC
LC MS/MS
odos Cromatográficos

27. Centro
Nacional de
Alimentación
Qué queremos detectar ?
• Detección del ingrediente:
Alimento
• Detección del alérgeno:
Proteína alergénica
ción de un Método de análisis
do analizar?
cto final: Cumplir la Legislación
- Suficiente para cumplir
la legislación
-Más información para
el paciente

28. Centro
Nacional de
Alimentación
o de matriz
- Matriz grasa ADN X ELISA 
- Productos hidrolizados ADN  ELISA X
uraleza del alérgeno buscado
Apio
vamos a analizar?
ADN

29. Centro
Nacional de
Alimentación
ETOS O DESAFIOS:
Determinar umbrales tóxicos
Materiales de Referencia Certificados
EuroPrevall
VITAL

30. Centro
Nacional de
Alimentación
SPONIBILIDAD MATERIALES DE REFERENCIA
: MR disponibles
Alérgeno MATERIAL PROCEDENCIA CERTIFICACION
Huevo RM 8445 ( Whole egg powder) NIST
Contenido
proteico (ELISA)
mina/Gluten PWG standar Prolamin Group Alérgeno
Leche BCR-638 IRMM
Contenido
proteico

31. Centro
Nacional de
Alimentación
al de Referencia
ncipal problema para la cuantificación de alérgenos por
os inmunológicos, espectrometría de masas o los métodos
s en ADN es la falta de disponibilidad de materiales de
cia certificados (MRC).
les de referencia (no certificados) desarrollados por diferentes
tores están disponibles comercialmente para los alérgenos
tarios más importantes, pero los resultados obtenidos pueden
comparables.
equiere la disponibilidad de MRC para la
ificación de alérgenos alimentarios.
Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,
nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf

32. Centro
Nacional de
Alimentación
les soluciones
 Muestras Fortificadas: muestra preparada por adición de una
determinada cantidad de alérgeno
obrantes de ensayos de intercomparación
Valor de Referencia : Valor Asignado en el ensayo
(Con cada Kit ???)
tilización de reactivos químicos (cuando el alérgeno exista
reactivo, Proteína purificada ej. caseína, β-lactoglobulina, etc…)
tilización del alimento alergénico
reparación de muestras control: Valor teórico
 “Incurred”: muestra adicionada y sometida

33. Centro
Nacional de
Alimentación
QUETADO PRECAUTORIO
aración voluntaria que usan los fabricantes en las
etas de los alimentos que indica la presencia
ncial y no intencionada de un alérgeno
77 % ‐ Puede contener trazas de…….
6 % ‐ Puede contener indicios de….
13 % ‐ Elaborado en fábrica que utiliza……
3 % ‐ Aroma de …..
uestras analizadas con etiquetado precautorio:

34. Centro
Nacional de
Alimentación
BGL 28%
Caseína
39%
Avellana
60%
Cacahuete
Huevo10%
Apio 13% Soja 30%
Total
Muestras
analizadas
Muestras
Positivas %
18 5 28
a 18 7 39
a 10 6 60
ete 18 4 22
10 1 10
8 1 13
10 3 30

35. Centro
Nacional de
Alimentación
IÓN INTERNA :
firmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se
los requisitos particulares para un uso especifico previsto (Norma UNE/IEC
005)
o garantizar los resultados ?
Comprobar
resultados
por el
son
bles en el
o
• repetibilidad
• Reproducibilidad
PRECISIÓN DEL
MÉTODO
• Comprobar en distintas matrices
• Aceptable (Recuperación 80% ‐120%)
EXACTITUD DEL
MÉTODO
• LD Límites de detección
• LC Límites de cuantificación
LD/LC

36. Centro
Nacional de
Alimentación
nización de los métodos de detección
UNE‐ EN 15633‐1:2009. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos mediante métodos inmunológicos‐
Parte 1: Consideraciones generales”
UNE‐ EN 15634‐1:2009. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos mediante métodos de biología
molecular‐Parte 1: Consideraciones generales”
UNE‐ EN 16388 IN‐:2012. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos alimenticios. Formato para
proporcionar información sobre métodos inmunológicos y métodos de biología molecular ”
DACION DE MÉTODOS POR ORGANISMOS INTERNACIONALES
UNE‐ EN 15842:2010. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos Consideraciones generales y Validación
de métodos”

37. Centro
Nacional de
Alimentación
clusiones /Necesidades
eación de un Laboratorio Europeo de
eferencia. Armonizar métodos
tablecer Umbrales de toxicidad / Límites
gales
ateriales de referencia

38. Centro
Nacional de
Alimentación
Muchas Gracias
Servicio de Biotecnología ‐ CNA
Mª Isabel Prieto Santos mprietos@msssi.es
Mª del Camino Martín‐Forero Buendía mmartinforero@msssi.es