Efeito rbST qualidade embriões vacas Nelore

162
Rev. Cient. Prod. Anim., v.10, n.2, 2008
1
1
Doutorando em Ciência Animal/UFPI, Bolsista da FAPEMA (fmoraesjr@hotmail.com)
2
DMV Reprodução Animal/UFMA (ttorresjunior@yahoo.com.br).
3
Doutoranda em Ciência Animal/UFPI (isolda.marcia@hotmail.com).
4
Laboratório de Reprodução Animal/CCA/UFPI (sousa_jr@uol.com.brl).
5
Médico Veterinário (helcioscorreia@hotmail.com).
6
Mestranda em Medicina Veterinária/UEMA (alinevet@hotmail.com).
7
DCCV/CCA/UFPI (rvieira@ufpi.br/adalmir@ufpi.br).
Efeito da Somatotropina Recombinante Bovina (rbST) na Resposta Ovulatória e
na Qualidade dos Embriões de Vacas Nelore
Felipe de Jesus Moraes Junior1
, José Ribamar de Souza Torres Junior2
, Isolda Márcia do
Nascimento3
, Antônio de Sousa Júnior4
, Hélcio Santos Correia5
, Aline Brito da Silva6
,
Rômulo José Vieira7
, José Adalmir Torres de Souza7
RESUMO – Avaliou-se os efeitos da rbST na produção in vivo de embriões de
oito vacas doadoras da raça Nelore. As superovulações foram realizadas em duas etapas,
em Julho e Outubro de 2007. Na primeira etapa, quatro animais (G1) receberam apenas
FSH e quatro (G2) receberam além do FSH, 250 mg de rbST, por via intramuscular, no
dia denominado D0. Na segunda etapa, no sistema crossover, os animais que receberam
apenas FSH, receberam 250 mg rbST.As superovulações foram iniciadas no D4, com 133
mg de FSH, aplicadas em quatro dias consecutivos, com doses decrescentes, a intervalo
de 12 horas. Os implantes foram retirados em D7 após aplicação de duas doses de PGF2α
em D6. No D8 foram aplicadas 200 μg de um análogo do GnRH e 12 a 24 horas após,
as inseminações foram realizadas. Os embriões foram coletados no sétimo dia após a
primeira inseminação. A resposta superovulátoria (presença de corpos lúteos), total de
estruturas, estádios de desenvolvimento e qualidade dos embriões recuperados não foram
afetados (P>0,05) pelo tratamento com a rbST. As médias obtidas nos tratamento G1
e G2 foram respectivamente: estruturas colhidas, 9,5±3,0 e 7,6±2,2; embriões viáveis,
8,1±2,6 e 5,0±1,6; estruturas não fertilizadas, 0,3±0,2 e 0,5±0,3; estruturas degenerados,
1,0±0,5 e 0,5±0,3; mórulas, 0,5±0,2 e 2,3±1,9; blastocistos iniciais, 2,2±2,1 e 1,3±0,9;
blastocistos, 4,7±1,6e2,5±0,5; blastocistos expandidos, 0,6±0,3 e 0,5±0,5; embriões grau
I 7,3±2,5 e 5,0±0,8; embriões grau II, 0,5±0,3 e 1,1±0,5 e embriões grau III, 0,2±0,1 e
0,5±0,5. A administração da rbST no D0, na dose de 250 mg, não constitui boa alternativa
para melhorar a qualidade de embriões em vacas Nelore.
Palavras-chave: bovino, FSH, GH
Rev. Cient. Prod. Anim., v.10, n.2, p.162-173, 2008

163
Effect of the Bovine Recombinant Somatotropin (rbST) in the Ovulatory Response
and Embryos Quality of Nelore Cows
ABSTRACT - To evaluate the effect of rbST in the in vivo production of Nelore
cows embryos a study was carried with eight givers. The superovulation was carried
in 2007, in two stages, the first one in July and the second other in October. In the first
stage, four animals (G1) received only FSH and four (G2) received besides the FSH, 250
mg of rbST, both by intramuscular application, in the day D0. In the second stage, in the
crossover system, the animals that had received only FSH received 250 mg of rbST. The
superovulation was initiated in the D4, with 133 mg of FSH, applied in four consecutive
days, with decreasing doses in the 12 hours interval. The implantations were removed
in the D7 after application of two doses of PGF2α
in D6. In the D8, 200 μg of GnRH
analogous were applied, and after 12 and 24 hours inseminations took place. The embryos
were collected in the seventh day after the first insemination. The superovulated reply
(presence of lutea corpora), total of structures, developmental stage and quality of the
recouped embryos had not been affected (P>0.05) by the rbST treatment. The averages of
G1 and G2 treatment were: recovered structures, 9.5±3.0 and 7.6±2.2; viable embryos,
8.1±2.6 and 5.0±1.6; not fertilized, 0.3±0.2 and 0.5±0.3; degenerated, 1.0±0.5 and 0.5±0.3;
morulae, 0.5±0.2 and 2.3±1.9; early blastocysts, 2.2±2.1 and 1.3±0.9; blastocysts, 4.7±1.6
and 2.5±0.5; expanded blastocysts, 0.6±0.3 and 0.5±0.5; embryos degree I, 7.3±2.5 and
5.0±0.8; embryos degree II, 0.5±0.3 and 1.1±0.5 and embryos degree III, 0.2±0.1 and
0.5±0.5, respectively. The administration of 250 mg of rbST in the D0, do not improve
the embryos quality in Nelore cows.
Key Words: bovine, FSH, GH
Introdução
O maior entrave dos programas de
Transferência de Embriões (TE) continua
sendo o elevado custo e a variabilidade
da resposta ao tratamento superovulatório
entre as doadoras. Apesar do intenso
número de pesquisas desenvolvidas
em diversos países ainda não existe um
protocolocapazdecontornaresteproblema.
Alguns protocolos que sincronizam o
desenvolvimento da onda folicular têm se
revelado úteis por facilitarem o manejo das
doadoras e produzirem o mesmo número
de embriões dos tratamentos tradicionais
utilizados (Nagano et al., 2004).

164
A utilização da somatotropina
recombinante bovina (rbST) em doadoras
noiníciodocicloestral,temsidopesquisada
com o objetivo de aumentar a população de
folículos recrutados e, conseqüentemente,
melhorar a resposta superovulatória (Gong
et al., 1996).
Os principais hormônios utilizados
para superovular fêmeas são o hormônio
folículo-estimulante(FSH)eagonadotrofina
coriônicaeqüina(eCG)equandoassociados
à rbST têm a capacidade de aumentar o
número de folículos recrutados e embriões
viáveis (Gong et al., 1993; Gong et al.,
1996).
A rbST foi um dos primeiros fatores
de crescimento produzidos em escala
comercial como proteína recombinante
(Bauman, 1999). A maior quantidade de
receptores para a rbST é encontrada no
fígado, que é responsável pela produção
do fator de crescimento semelhante à
insulina (IGF-I). Entretanto a maioria dos
outros tecidos também responde à rbST.
Sobre o sistema reprodutor, esse hormônio
atua sobre os receptores do útero e ovário
induzindo-os à produção de IGF-I (Lucy,
2000).
Emvacas,arbSTdiminuiuonúmero
de estruturas não fertilizadas, melhorou
a taxa de sobrevivência embrionária e
acelerou o desenvolvimento embrionário
(Moreira et al., 2002). Por sua vez, Nagano
et al. (2004) observaram que 500 mg de
rbST aplicados no dia zero do protocolo
de FSH, em vacas, aumentaram o número
total de embriões, de ovócito e de embriões
viáveis.
Esta pesquisa foi realizada com o
objetivo de avaliar a rbST na produção in
vivo de embriões de vaca Nelore.
Material e Métodos
O experimento foi realizado na
fazenda Canarana, município de Vitória do
Mearim-MA, com coordenadas geográficas
03º27’44’’ latitude Sul e 44º52’14’’
longitude Oeste. O clima da região é
quente e úmido, com o período chuvoso
de dezembro a junho, temperatura de 22 a
35ºC e precipitação pluviométrica média
anual 1.404 mm (NUGEO/UEMA, 2004).
O experimento foi realizado nos meses de
julho e outubro de 2007, correspondendo
ao período de estiagem.
Foram utilizadas oito vacas puras de
origem (PO) da raça Nelore, não lactantes,
com peso vivo médio 525,37±26,84 kg
e escore de condição corporal 3,0 a 3,5,
em escala de 1 a 5, onde 1 corresponde
ao animal muito magro e 5 ao muito
gordo (Dirksen et al., 1993), mantidas em
pastagem de Brachiaria brizantha, sem
suplementação, com água e sal mineral à
vontade. Os animais foram previamente
examinados por palpação retal, no intuito
de eliminar fêmeas com problemas clínico-

165
ginecológicos.
Adotou-se o delineamento
inteiramente casualizado, com dois
tratamentos (com e sem rbST, Figuras 1
e 2) e oito repetições (vacas doadoras),
no sistema crossover. O intervalo entre os
tratamentos foi de 90 dias (primeira etapa
em julho e segunda etapa em outubro).
Figura 1 - Protocolo de superovulação com FSH e rbST.
Figura 2 - Protocolo de superovulação com FSH e sem rbST.

166
As doadoras receberam dois
implantes auriculares com 6 mg de
Norgestomet (Crestar®
, Intervet, Boxmeer,
Holanda) e 2 mg de Benzoato de Estradiol
(RIC-BE®
, Syntex, Buenos Aires,
Argentina) associados a 250 mg de rbST
(Boostin®
, Schering-Plough Saúde Animal
Indústria e Comércio Ltda.) em um dia
aleatório do ciclo estral, denominado dia
zero (D0).
As superovulações foram realizadas
com 133 mg do FSH (Folltropin®
; Bioniche
Canadá Inc., Ontário, Canadá) divididas
em oito doses decrescentes, aplicadas duas
vezes ao dia, por quatro dias consecutivos.
Quando da 5ª e 6ª administração de
FSH as doadoras receberam 150 μg de
D-Cloprostenol (Prolise®
, Syntex, Buenos
Aires, Argentina) e à 8ª aplicação foi
retirado o implante auricular. No D8 foram
administrados 200 μg de um análogo do
GnRH (Fertagyl®
, Intervet, Boxmeer,
Holanda). A inseminação artificial,
realizada com sêmen de uma única partida
de um touro, foi efetivada 12 e 24 h após
aplicação do GnRH. Dois tratamentos, um
com rbST e outro sem rbST foram definidos
e estão apresentados nas Figuras 1 e 2.
No D15 do programa, os corpos
lúteos foram quantificados através de ultra-
sonografia, utilizando um aparelho Pie
Medical, munido de um transdutor linear
de 6/8 MHz. A seguir, realizou-se anestesia
epidural e higienização da região perineal,
procedendo-se então a colheita das
estruturas. Utilizou-se um cateter de duas
vias com um balão em sua extremidade
(sonda de Foley, N. 20), sendo este inflado
após passagem pela cérvix e posicionado
no corno uterino, vedando a passagem para
o corpo uterino, impedindo o refluxo de
líquidos. O meio utilizado para lavagem foi
oPBS(PhosphateBufferSolution)aquecido
a 37ºC, utilizando cerca de 500 ml para
lavagem de cada corno uterino. O líquido
recolhido foi passado em filtro apropriado,
onde ficaram retidas as estruturas em cerca
de 50 ml do meio. Repetido o processo no
outrocornouterino,oconteúdofoicolocado
em uma placa de Petri, para identificação e
captura de estruturas, com auxílio de uma
lupa estereoscópia sob aumento de 40X.
As estruturas capturadas foram colocadas
em outra placa de Petri com meio de
manipulação (HOLDING Embriocare) e
foram classificados quanto aos estádios de
desenvolvimento (Lindner & Wright,1983)
e avaliados quanto à qualidade (Kennedy
et al., 1983).
Os estádios de desenvolvimento
foram classificados: estádio 1 (mórula:
aglomerado celular em cuja superfície
blastômeros individuais podem ser
distinguidos); estádio 2 (mórula compacta:
blastômeros individuais não podem ser
distinguidos na superfície do embrião);
estádio 3 (blastocisto inicial: uma pequena
cavidade, a blastocele, está visível e a massa

167
celular interna começa a se formar); estádio
4 (blastocisto: o embrião ocupa a maior
parte dentro da zona pelúcida, a massa
celular interna começa a tornar-se mais
distinta, mas o diâmetro global do embrião,
incluindo a zona pelúcida, permanece
inalterado); e estádio 5 (blastocisto
expandido: o diâmetro embrionário está
aumentado e a espessura da zona pelúcida
pode ser reduzida para aproximadamente
1/3 da espessura original). Quanto à
qualidade, os embriões foram classificados
em quatro graus: grau I (excelente: estádio
de desenvolvimento com zona pelúcida
intacta e esférica, massa celular homogênea
com células de tamanho uniforme, nenhum
ou poucos fragmentos celulares no espaço
perivitelino); grau II (bom: alterações
mínimas na forma e coloração com
relação ao grau I, alguns fragmentos ou
debris celulares no espaço perivitelino e/
ou pequenas formações vesiculares nos
blastômeros); grau III (regular: claras
alterações comparadas com o grau II,
embora com a maior parte da massa
celular intacta); e grau IV (ruim: muitos
fragmentos ou debris celulares no espaço
perivitelino, vesículas maiores e em maior
número e claras mudanças degenerativas
nos blastômeros, com menos da metade da
massa celular intacta).
Após a avaliação, os embriões
(mórulaseblastocistos)degrausIeIIforam
colocados em uma placa de Petri contendo
meio de congelação (etilenoglicol), onde
permaneceram por 10 min. Em seguida,
foram envasados em palhetas de 0,25
mL contendo cinco colunas, duas de PBS
nas extremidades e três mais internas de
etilenoglicol, sendo que a coluna central
continha o embrião. As palhetas, depois
de vedadas com lacradores plásticos e
identificadas, foram congeladas utilizando-
se uma máquina modelo TK 3000®
.
Os dados foram analisados
utilizando-se o pacote estatístico SAS
(1997), para obtenção de médias e erros
padrões dos parâmetros avaliados (total
de estruturas, embriões viáveis, estruturas
não fertilizadas, estruturas degeneradas,
estádios de desenvolvimento e qualidade
embrionária). Foi utilizado o teste não-
paramétrico Wilcoxon, com probabilidade
de 5%.
Resultados e Discussão
Para corpos lúteos, estruturas
recuperadas (embriões viáveis, não
fertilizados e degenerados) e estádios de
embriões (mórulas, blastocistos iniciais,
blastocistos e blastocistos expandidos) não
houveefeito(P>0,05)dostratamentos,onde
as médias gerais foram 12,4±8,5; 9,9±8,7
e 7,5±6,1, respectivamente, (Tabelas 1
e 2). Das 16 superovulações, 14 (87,5%)
responderam ao tratamento com FSH com
três ou mais ovulações. Estes dados foram

168
similares aos obtidos por Borges et al.
(2001), onde cerca de 88,5% dos animais
(n=23) responderam ao tratamento com
FSH.
Tabela 1 - Médias e erros padrões para corpos lúteo e estruturas recuperados de vacas da
raça Nelore superovuladas com FSH associado ou não à rbST
*Médias na mesma linha seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de
Wilcoxon (P>0,05).
Tabela 2 - Médias e erros padrões para estádios de desenvolvimento dos embriões
recuperados de vacas da raça Nelore superovuladas com FSH associado ou não à rbST
Wilcoxon (P>0,05).
ao grupo controle (P<0,05) (18,1 x 13,4
respectivamente). Lucy (2000) relatam
que a rbST age no corpos lúteo, devido à
presença de receptores para somatotropina.
Este fato não foi verificado neste trabalho,
pois todas as doadoras passaram pelos
dois tratamentos, onde o grupo sem rbST
apresentou maior número de corpos lúteos
em relação ao grupo com rbST, indicando
pouca presença de receptores nos ovários.
Essa variação, segundo Lucy et al. (1993),
De La Sota et al. (1993) e Kirby et al.
(1997), pode ser influenciada pela raça.
Para estruturas totais colhidas
(8,7±7,3) e embriões viáveis (7,1±5,9),
as médias obtidas estão de acordo com
resultados relatados por Cushman et al.
(2001), 7,9±1,3 estruturas colhidas e
6,1±1,3 embriões transferíveis. A não
influência positiva (P>0,05) da rbST no
grupo tratado difere de resultados obtidos
por Gong et al. (1993, 1996), Moreira et
al. (2002) e Nagano et al. (2004), onde
a rbST influenciou positivamente no
A média de corpos lúteo
diagnosticados (12,4±8,5) difere do obtido
por Kuehner et al. (1993) onde o grupo
tratado com 500 mg de rbST foi superior

169
recrutamento dos folículos, no aumento
do número de folículos ovulatórios e,
conseqüentemente, no de embriões viáveis.
Resultados semelhantes também foram
relatados por Neves et al. (2005) em três
grupos experimentais: controle 0 mg,
250 mg e 500 mg de rbST. O número de
estruturas recuperadas pelos autores foi
8,47±5,60; 9,36±8,37 e 8,86±6,88 e de
embriões viáveis 3,33±2,61; 5,91±9,31 e
4,79±5,79, respectivamente, e por Borges
et al. (2001), onde as médias das estruturas
totais 15,3±9,5 e 17,4±10,9 e embriões
viáveis 8,5±8,3 e 11,0±10,0 foram menores
em animais tratados que no grupo controle.
Segundo esses autores, a utilização do
rbST antes do início da superovulação não
aumenta as médias de estruturas colhidas e
embriões viáveis.
Um fator que pode ter contribuído
para a não influência da rbST sobre as
estruturas colhidas e embriões viáveis,
foi a dose utilizada, pois, segundo Rieger
et al. (1991), em vacas da raça holandesa,
para estímulo dos ovários são necessárias
doses maiores que 500 mg de rbST. De
modo geral, fêmeas zebuínas necessitam
de menor dose hormonal para estimulação
ovariana quando comparada com fêmeas de
raças européias. Na presente pesquisa a raça
foi Nelore e a dose utilizada 250mg. Outro
fator que também pode ter influenciado os
resultados é a raça, já observado em vacas
da raça Holandesa (Hasler et al., 1983),
Angus, Brahman (Segerson et al., 1984),
Charolês, Simental e Hereford (Breuel et
al., 1991).
A ausência do efeito do tratamento
sobre embriões degenerados e não
fertilizados, verificada nesta pesquisa,
corrobora com os dados de Nagano et
al. (2004) e contrapõe-se aos resultados
de Moreira et al. (2002), que atribuem à
rbST o aumento da taxa de fertilização e
melhoria na qualidade dos embriões. Lucy
et al. (1995), atribuem os efeitos diretos
e indiretos a este hormônio, pois a rbST
aumenta as concentrações IGF-I, podendo
melhorar a qualidade embrionária, o que
não foi observado nesta pesquisa.
A rbST não afetou (P>0,05) os
estádios de desenvolvimento embrionários
quando colhidos sete dias após a primeira
inseminação. As maiores médias, tanto
no tratamento com rbST como sem rbST
referem-se aos estádios de blatocisto
inicial (1,8±4,6) e blastocisto (3,7±3,6).
Coelho (1986), ao obter embriões no
sétimo dia de superovulação, também não
observou diferença nas médias de mórulas
compactaseblastocistosjovensemtaurinos
(Bos taurus), como também no número de
mórulas e mórulas compactas em zebuínos
(Bosindicus),demonstrandoavariabilidade
individual no desenvolvimento e na
qualidade embrionária. Variações de 24 a
48 h na idade dos embriões podem ocorrer
no desenvolvimento embrionário (Lindner

170
e Wright, 1983). Deste modo, é importante
considerar o dia das colheitas dos embriões
em função da raça do animal. As médias
e erros padrões da qualidade dos embriões
recuperados estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 - Médias e erros padrões para qualidade dos embriões recuperados em vacas da
raça Nelore superovuladas com FSH associado ou não à rbST
Wilcoxon (P>0,05).
A rbST também não antecipou a
emergência da onda folicular, melhorando a
qualidadedofolículo,e,conseqüentemente,
a qualidade embrionária. Neste sentido,
Maffili et al. (2001) relataram que o
uso de rbST, em associação com a
superovulação não aumentou a quantidade
de embriões produzidos, mas melhorou
o desenvolvimento e a qualidade dos
mesmos.
Conclusões
Em vacas da raça Nelore
superovuladas com FSH não se justifica
o tratamento prévio com rbST visando-se
melhoria da resposta ovariana quanto ao
número e qualidade dos embriões.
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