1. UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
STRASBOURG I
1995
THESE
présentée à
L'UFR DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
domaine : BIOLOGIE MOLECULAIRE
par
Alain HEHN
LES GENES 3' PROXIMAUX DU RNA 2 DU VIRUS DES NERVURES JAUNES
ET NECROTIQUES DE LA BETTERAVE (OU BNYVV) :
LEUR ROLE DANS LA REPLICATION ET LA TRADUCTION DU GENOME
VIRAL AINSI QUE DANS LE MOUVEMENT DU VIRUS DE CELLULE A
CELLULE.
Soutenue le 27 juin 1995 devant la Commission d'Examen
Dr. M. LEGRAND Rapporteur interne
Pr. A. VAN KAMMEN Rapporteur externe
Dr. T. CANDRESSE Rapporteur externe
Dr. K. RICHARDS Examinateur
Pr. G. JONARD Directeur de Thèse
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes (IBMP-CNRS) Strasbourg

3. à mes parents,
à Valérie, à Michel

5. Je voudrais remercier ici, le professeur Jonard qui m'a accordé sa confiance un matin
d'avril 1991 en m'accueillant au sein de son groupe, me donnant ainsi l'opportunité de
réaliser cette thèse.
La recherche est un labyrinthe dans lequel on peut aisément s'égarer. Merci à
messieurs Guilley et Richards, les 2 autres membres du TCB, d'avoir été disponible
pour m'écouter, me conseiller et me diriger efficacement quand il le fallait.
J'aimerai exprimer ma gratitude aux membres du jury : messieurs Candresse, Legrand
et Van Kammen pour avoir accepté de juger ce travail.
Mes remerciements vont tout particulièrement à Salah Bouzoubaa qui, armé de
beaucoup de patience (si, si, beaucoup de patience ! ), a su m'initier à la paillasse et à
la recherche en général.
Merci également à Mme Marbach pour avoir préparé chaque semaine, inlassablement,
ces fameux protoplastes, source de joie et souvent de dépit.
Je tiens a exprimer ma reconnaissance à Mme Fritsch qui, au cours de nos discussions,
m'a permis de mieux comprendre la maturation mais aussi le frame-shift...!
Enfin, je voudrais remercier toutes les personnes qui, de près ou de loin, ont contribué à
faire de cette thèse ce qu'elle est et avec qui j'ai partagé tant de gâteaux, de chocolats et
autre thé à la menthe.

7. SOMMAIRE
SOMMAIRE.........................................................................................................................1
INTRODUCTION ...............................................................................................................7
RESULTATS
CHAPITRE 1 : LES PROTEINES EXPRIMEES A PARTIR DU "TRIPLE GENE
BLOCK" (TGB) SONT DIRECTEMENT IMPLIQUEES DANS LE
MOUVEMENT DU VIRUS DE CELLULE A CELLULE. ............................................17
I-Etat des connaissances sur les mécanismes de transport des virus. ....................................19
1-Stratégie utilisée par les tobamovirus. ....................................................................20
2-Stratégie utilisée par les comovirus, les népovirus et les caulimovirus..................20
3-Stratégie utilisée par les hordeivirus, les potexvirus et les furovirus......................21
II-Rôle du Triple Gene Block dans le mouvement de cellule à cellule du BNYVV. ............23
1-Le Triple Gene Block du BNYVV est impliqué dans le mouvement du virus de
cellule à cellule...........................................................................................................23
2-Les protéines P42 et P13 du Triple Gene Block sont exprimées à partir de
RNA subgénomiques. ................................................................................................27
III-Conclusions et perspectives. .............................................................................................28
Publication n°1 : EFFICIENT CELL TO CELL MOVEMENT OF BEET NECROTIC
YELLOW VEIN VIRUS REQUIRES 3' PROXIMAL GENES LOCATED ON RNA 2.....31

8. Sommaire
______________________________________________________________________
CHAPITRE 2 : ETUDE DE LA PROTEINE P14 CODEE PAR
L'ORF 3' PROXIMALE DU RNA 2 DU BNYVV............................................................ 41
I-Mise en évidence du rôle de la protéine P14 dans le cycle de multiplication du
BNYVV. ................................................................................................................................ 41
1-Des mutations introduites dans le gène VI du RNA 2 engendrent une
diminution du taux de réplication des RNA viraux. (publication n°1).....................41
2-La protéine P14 joue un rôle en cis dans la réplication du RNA 2 et active en
trans la synthèse de la protéine de coque. (publication n°2) ..................................... 48
3-Mode d'action de la protéine P14. .......................................................................... 54
II-Mise en évidence de l'importance des résidus cystéines 69, 72, 106 et 109 dans
l'activité de la protéine P14.................................................................................................... 60
1-Construction de mutants alanine (Giesman-Cookmeyer & Lommel, 1993). .........62
2-Propriétés biologiques des mutants alanine............................................................62
III-Mise en évidence d'interactions protéine P14-acides nucléiques. .................................... 65
1-Clonage du gène VI dans le vecteur pET. .............................................................. 65
2-Purification partielle de la protéine P14 par chromatographie d'affinité sur une
colonne "Zinc Chelate Affinity Adsorbent" (ZCAA). ............................................... 67
3-Mise en évidence d'interactions protéine P14-acides nucléiques par la
technique de "Northwestern" (Gramstat et al, 1990). ................................................69
IV-Conclusion ....................................................................................................................... 69
Publication n°2 : THE SMALL CYSTEIN-RICH PROTEIN P14 OF BEET NECROTIC
YELLOW VEIN VIRUS REGULATES ACCUMULATION OF RNA 2 IN CIS AND
COAT PROTEIN IN TRANS................................................................................................. 73
CHAPITRE 3 : DES RNA 2 DEFECTIFS SONT CAPABLES D'INHIBER LA
REPLICATION DU BNYVV ............................................................................................. 103
I-Rappel sur les stratégies de lutte antivirale par transgénose : expression de
séquences dérivées du pathogène............................................................................... 103
II-Obtention de RNA défectifs artificiels du BNYVV : leur effet sur la
réplication du virus. ................................................................................................... 109
2

9. Sommaire
______________________________________________________________________
1-Obtention de RNA défectifs.................................................................... 109
2-Seules les délétions introduites dans le RNA 2 produisent des RNA ayant
un effet Défectif Interférant........................................................................ 109
3-Analyse de l'effet DI en fonction de la quantité de RNA DI utilisée et du
temps. ......................................................................................................... 110
4-Analyse dans les plantes de l'effet DI des différents mutants du RNA 2.112
III-Conclusions et perspectives. .................................................................................113
Publication n°3 : ARTIFICIAL DEFECTIVE INTERFERING RNAs DERIVED FROM
RNA 2 OF BEET NECROTIC YELLOW VEIN VIRUS .....................................................115
CHAPITRE 4 : MISE EN EVIDENCE D'UNE ACTIVITE PROTEOLYTIQUE
ASSOCIEE A LA PROTEINE P237 CODEE PAR LE RNA 1 DU BNYVV. ...............125
I-Les protéases d'origine virale et leurs caractéristiques ............................................127
1-Généralités sur les protéases. .................................................................. 127
2-Exemples de protéines virales présentant une activité protéasique ........ 130
II-Cas du BNYVV......................................................................................................131
1-Comparaison de séquences avec des domaines protéases d'autres
phytovirus................................................................................................... 131
2-Mise en évidence d'une activité protéase associée à la protéine P237.... 134
III-Conclusions :.........................................................................................................135
CONCLUSION ....................................................................................................................137
MATERIEL ET METHODES
A-AMPLIFICATION, EXTRACTION ET MODIFICATIONS DE DNA
PLASMIDIQUE...................................................................................................................141
I-Souches bactériennes, vecteurs de clonage ou d'expression et milieux de culture. ............141
1-Souches bactériennes .............................................................................................141
2-Vecteurs .................................................................................................................143
3

10. Sommaire
______________________________________________________________________
3-Milieux. .................................................................................................................. 146
II-Transformation des souches bactériennes et mise en culture. ........................................... 146
1-Utilisation de Chlorure de Calcium........................................................................ 146
2-Transformation par électroporation ........................................................................ 147
3-Caractérisation des clones par hybridation in situ. ................................................. 148
III-Extraction et analyse de DNA plasmidique......................................................................148
1-Minipréparation et maxipréparation ....................................................................... 148
2-Analyse. ..................................................................................................................150
IV-Préparation de DNA plasmidique simple brin uridylé et mutagénèse dirigée selon la
méthode de Kunkel . .............................................................................................................. 152
1-Culture. ................................................................................................................... 152
2-Purification du DNA simple brin. ..........................................................................152
3-Mutagénèse dirigée en utilisant des oligonucléotides modifiés (Zoller & Smith,
1982). .........................................................................................................................152
V-Techniques de sous clonage par l'utilisation d'enzymes.................................................... 153
1-Digestion enzymatique. .......................................................................................... 153
2-Obtention d'extrémités franches. ............................................................................ 154
3-Déphosphorylation..................................................................................................155
4-Phosphorylation. ..................................................................................................... 156
5-Ligation................................................................................................................... 156
VI-Amplification d'un fragment de DNA par la technique de la PCR. .................................157
1-Principe de la méthode et conditions générales...................................................... 157
2-Cas particulier du RNA 2 du BNYVV. .................................................................. 158
VII-Purification sur gel d'agarose d'un fragment de DNA obtenu par digestion
enzymatique ou par PCR. ...................................................................................................... 158
1-Par électroélution....................................................................................................158
2-Par extraction d'un gel LMP. ..................................................................................159
VIII-Séquençage selon la méthode de Sanger, modifiée pour la T7 DNA polymérase.........159
1-Séquençage d'un DNA plasmidique. ...................................................................... 159
4

11. Sommaire
______________________________________________________________________
2-Séquençage d'un produit PCR.................................................................................160
IX-Transcription in vitro........................................................................................................161
1-Obtention de transcrits infectieux du BNYVV.......................................................161
2-Synthèse de sondes ribonucléiques.........................................................................163
X-Analyse des transcrits par hybridation in situ ....................................................................163
1-Séparation des RNA par migration sur gel d'agarose en conditions
dénaturantes................................................................................................................163
2-Hybridation avec des sondes spécifiques radioactives. ..........................................165
XI-Analyse de la descendance par réverse transcription........................................................166
B-EXPRESSION IN VIVO OU TRADUCTION IN VITRO DES PROTEINES DE
BNYVV .................................................................................................................................167
I-Expression de protéines dans un système bactérien (Studier et al, 1990)...........................167
II-Purification par chromatographie d'affinité sur une colonne ZCAA (Zinc Chelate
Affinity Adsorbent)................................................................................................................167
III-Traduction in vitro dans un système acellulaire de réticulocytes de lapins. .....................168
1-Préparation du lysat de réticulocytes de lapins. ......................................................168
2-Traduction des produits de transcriptions...............................................................169
IV-Analyse. ............................................................................................................................169
1-Par électrophorèse en conditions dénaturantes sur gel de polyacrylamide. ............169
2-Par immunorévélation après transfert. ....................................................................170
V-Etude de l'activité fixatrice d'une protéine par northwestern. (Gramstat et al, 1990)........173
C-MULTIPLICATION DU VIRUS DANS UNE PLANTE HOTE :
CHENOPODIUM QUINOA. ...............................................................................................173
I-Plante hôte. ..........................................................................................................................173
II-Préparation du virus. ..........................................................................................................174
III-Extraction de RNA viraux à partir de feuilles de C. quinoa.............................................174
1-En présence de tampon "polysome" (Jackson & Larkins, 1976) ...........................174
5

12. Sommaire
______________________________________________________________________
2- En présence de tampon Tris-Magnésium. .............................................................175
IV-Préparation, inoculation et mise en culture de protoplastes. ............................................176
1-Préparation des protoplastes (Veidt et al, 1992)..................................................... 176
2-Infection des protoplastes par des acides nucléiques (RNA de BNYVV ou
DNA plasmidique) et mise en culture........................................................................ 176
V-Extraction des RNA viraux de protoplastes. ..................................................................... 177
VI-Expression transitoire dans les feuilles de C. quinoa et Nicotiana tabacum. .................. 178
ANNEXES
Publication n°4 : IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF RESISTANCE
TO RHIZOMANIA IN AN ECOTYPE OF BETA VULGARIS SUBSP. MARITIMA. ......... 179
ABREVIATIONS ..................................................................................................................195
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................... 199
6

13. INTRODUCTION
C'est en 1959, dans la vallée du Pô (Italie), que Canova décrit pour la première
fois des betteraves malades présentant comme symptômes (1) des feuilles gaufrées avec
des tâches jaunes diffuses le long des nervures (voir figure 1-B) ; (2) un pivot de taille
réduite par rapport à celui d'une plante saine ; (3) une nécrose des anneaux vasculaires
facilement observable lorsque le pivot est coupé transversalement ; et (4) une abondante
barbe "poivre et sel" due à une prolifération anormale et anarchique des radicelles (voir
figure 1-A). Cette dernière observation, la plus caractéristique, donne son nom à la
maladie : la rhizomanie, ce qui signifie étymologiquement "démence des racines" (rhizo
= racines ; mania = folie) (voir figure 1-A). Cette maladie a ensuite été décrite au Japon
en 1965 et fait son apparition en France, plus précisément en Alsace, dans les années 70
(Putz et Vuittenez, 1974). La rhizomanie engendre une perte considérable dans le
rendement en sucre qui passe de 18 à 8%, rendant l'exploitation impropre.
Dès 1966, Canova suggère que la maladie est due à un champignon du sol :
Polymyxa betae. C'est un champignon inférieur, à zoospores biflagellées, parasite
intracellulaire des racines de betteraves. Il appartient à la classe des Myxomycètes et à
l'ordre des Plasmodiophorales (Chadefaud & Emberger, 1942). Les spores de résistance
se trouvant dans un sol contaminé vont germer et libérer des zoospores qui se déplacent
vers les radicelles d'une betterave, la propulsion se faisant grâce au mouvement
coordonné des 2 flagelles de la zoospore. Lorsque le contact avec une radicelle a lieu,
les flagelles disparaissent et la zoospore déverse son contenu cellulaire dans la cellule
hôte. Après 16 heures, on peut déjà observer un jeune plasmode qui va se différencier en

14. Introduction
______________________________________________________________________
A
B
Figure 1 : Sym ptômes de la rhizomanie : (A) photo représentant des betteraves saines (à
gauche) et rhizom aniées (à droite).(Photo fournie par l'INRA de Colm ar). (B) Photo
montrant les sym ptômes foliaires qui ont donné leur nom au virus.
8

15. Introduction
______________________________________________________________________
Figure 3 : Cycle de Polymyxa betae (d'après Keskin, 1967)
9

16. Introduction
______________________________________________________________________
zoosporange ou en cystosore (Keskin, 1964 et 1967) (voir figure 3).
Ce n'est qu'en 1973 que Tamada et Baba démontrent que l'agent responsable de la
rhizomanie est un virus : le beet necrotic yellow vein virus ou virus des nervures jaunes
et nécrotiques de la betterave (encore appelé BNYVV) ; ceci fut confirmé par Fujisawa
et Sugimoto en 1977. Le champignon Polymyxa betae, quant à lui, est seulement
impliqué dans la transmission du BNYVV (Fujisawa & Sugimoto, 1976). Enfin, les
premières études au plan moléculaire furent initiées en 1983 (Putz et al, 1983) et
démarrèrent vraiment en 1985 (Richards et al, 1985).
Le virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave est un phytovirus (Putz,
1977) appartenant à la famille des furovirus (fungus rod-shaped virus) (Brunt &
Richards, 1989 ; Brunt, 1991). Son génome est composé de 4 RNA (voir figure 4) de
polarité positive coiffés à leur extrémité 5' et polyadénylés à leur extrémité 3'. Ces 4
RNA sont encapsidés dans des particules virales de taille variable (390 nm, 265 nm, 100
nm et 89 nm) et de symétrie hélicoïdale avec un diamètre constant de 20 nm. Dans
certains isolats japonais, un 5ème RNA, de fonction inconnue, a été décrit (Tamada et al,
1989). Les RNA 1 et 2 sont nécessaires à la réplication, l'encapsidation et le mouvement
de cellule à cellule du virus. Ils sont donc suffisants pour provoquer un processus
infectieux quand ils sont inoculés mécaniquement à des feuilles de Chenopodium
quinoa, une plante hôte (voir figure 2-B). Les RNA 3 et 4 restent cependant essentiels
lors de l'infection naturelle des racines de betterave par l'intermédiaire du champignon
vecteur.
Le RNA 1 (6746 nt) code pour une protéine de poids moléculaire 237 kDa
renfermant les séquences consensus des méthyltransférase, hélicase (GKS) et
polymérase (GDD) (Bouzoubaa et al, 1987). D'autre part, comme nous le verrons dans
le chapitre IV, la protéine P237 contient une séquence caractéristique des protéases de
type papaïne (Koonin & Dolja, 1993 ; Rozanov et al, 1995) localisée entre le domaine
hélicase et le domaine polymérase. Le RNA 1 est capable de s'autorépliquer lorsqu'il est
inoculé seul à
10

17. Introduction
______________________________________________________________________
P 237
GKS GDD
RNA 1 MTR HEL PRO POL AAA
? ? ?
P75 TGB
CP P13 P14
RNA 2 GKS
AAA
UAG 15 K
P42
RNA Subgénomique
P25 P31
4.6 K
RNA 3 AAA RNA 4 AAA
N
Fonctions dans le cycle de multiplication.
Mouvement de
Réplication Transmission
cellule à cellule
Encapsidation
Symptomatologie et Régulation de la
amplification du réplication et de la
virus dans les racines traduction
Inconnue
Figure 4 : Organisation génétique du virus des nervures jaunes et nécrotiques de la
betterave ou BNYVV et fonctions associées aux protéines codées par les différents
RNA génomiques.
11

18. Introduction
______________________________________________________________________
des protoplastes de cellules de mésophylle de C. quinoa (voir figure 5) (Bouzoubaa &
Scheidecker, 1990 ; Gilmer et al, 1992).
Le RNA 2 (4612 nt) présente une organisation génétique plus complexe avec 6
phases de lecture ouverte (ORF). La première ORF dirige la synthèse de la protéine de
capside (CP) d'un poids moléculaire de 21 kDa. La protéine de translecture de 75 kDa
obtenue par suppression du codon stop UAG de la première ORF (Ziegler et al, 1985 ;
Bouzoubaa et al, 1986), joue un rôle dans l'initiation de l'encapsidation (Schmitt et al,
1992), dans la transmission du virus par le vecteur (Tamada & Kusume, 1991) et a été
visualisée par microscopie électronique à l'une des extrémités des particules virales
(Haeberlé et al, 1994). Les 3 ORF chevauchantes III, IV et V sont regroupées sous le
terme de "triple gene block" (ou TGB). Une organisation génétique analogue a été
décrite pour d'autres furovirus (Herzog et al, 1994 ; Scott et al, 1994) mais également
chez des virus comme les carlavirus, les hordeivirus et les potexvirus (Morozov et al,
1989). Ces 3 ORF du BNYVV codent respectivement pour des protéines potentielles de
poids moléculaire 42, 13 et 15 kDa. La protéine P42 dispose d'une séquence consensus
GKS caractéristique d'une activité NTP-binding souvent associée aux hélicases et a été
mise en évidence, ainsi que la protéine P13, dans les fractions membranaires préparées à
partir de feuilles de C. quinoa infectées par le virus (Niesbach-Klösgen et al, 1990). En
revanche, la protéine P15 n'a pas encore été détectée in planta. Enfin, l'ORF 3'
proximale du RNA 2 code pour une protéine de 14 kDa riche en cystéine et qui a été
localisée dans la fraction cytosolique de feuilles infectées (Niesbach-Klösgen et al,
1990). Cette protéine, comme nous le verrons ultérieurement (voir chapitre 2), joue un
rôle dans la régulation de l'infection virale.
Le RNA 3 (1773 nt) code pour une protéine de 25 kDa impliquée dans la
multiplication virale au niveau des racines de betteraves infectées (Koenig et al, 1986 ;
Lemaire et al, 1988 ; Tamada & Abe, 1989) ainsi que dans la symptomatologie au
niveau des feuilles (Jupin et al, 1992). Une étude immunocytochimique récente montre
que la protéine P25 est synthétisée très tôt dans le cycle viral ; de plus elle est détectée à
12

19. Introduction
______________________________________________________________________
la fois dans le cytoplasme et dans le noyau des cellules infectées (Haeberlé & Stussi-
Garraud,
13

20. Introduction
______________________________________________________________________
Figure 4 : Protoplastes préparés à partir de cellules de mésophylle de
Chenopodium quinoa dans les conditions décrites dans Matériel et
méthodes.
14

21. Introduction
______________________________________________________________________
1995). Une seconde ORF, l'ORF N, est exprimée lorsque des délétions dans le gène
codant pour la protéine P25 rapprochent l'AUG initiateur de cette petite ORF de la
séquence 5' non codante (Jupin et al, 1990). L'expression de la protéine très hydrophobe
codée par ce gène N entraîne l'apparition de lésions nécrotiques sur les feuilles des
plantes hôtes infectées. Enfin, une troisième ORF a été mise en évidence et code pour
une protéine potentielle de 4,6 kDa qui serait exprimée à partir d'un RNA subgénomique
détecté dans les feuilles infectées et qui est redondant avec les 545 derniers nucléotides
du RNA 3 (Bouzoubaa et al, 1991). Le rôle de ce peptide est actuellement en cours de
caractérisation au laboratoire. Des résultats préliminaires montrent que des délétions
réalisées dans cette ORF inhibent le mouvement à longue distance du virus dans Beta
macrocarpa (Tamada, communication personnelle) alors que des mutations ponctuelles
introduisant des codons de terminaison restent sans effet (Guntz-Lauber, communication
personnelle). Cette observation semble indiquer que c'est la séquence nucléotidique de
ce RNA subgénomique qui est directement impliquée dans ce phénomène de transport à
longue distance et non pas son produit d'expression.
Le RNA 4 (1467 nt) code pour une protéine de 31 kDa (Bouzoubaa et al, 1985)
qui joue un rôle prépondérant dans la transmission du virus par le vecteur fongique
(Koenig & Burgermeister, 1989 ; Tamada & Abe, 1989).
Mon travail de thèse a consisté plus particulièrement à caractériser le rôle des
produits des gènes 3' proximaux du RNA 2. Pour cela nous disposions au laboratoire
des clones cDNA complets des 4 RNA viraux (Quillet et al, 1989) permettant d'obtenir
des transcrits infectieux. A partir de ces clones, nous avons construit des mutants
ponctuels ou des mutants de délétion dans l'une ou l'autre des séquences codantes, puis
nous avons étudié in vivo l'effet de ces modifications. Ainsi, dans le premier chapitre,
j'aborderai les problèmes du mouvement du virus de cellule à cellule et je démontrerai
que les protéines codées par les trois cistrons du triple gene block sont impliquées dans
ce processus. Dans le chapitre 2, je présenterai les résultats concernant le rôle de la
protéine P14, codée par l'ORF VI du RNA 2, dans la réplication et dans la traduction du
15

22. Introduction
______________________________________________________________________
RNA 2. Le 3ème chapitre traitera des stratégies antivirales qui peuvent être envisagées
pour bloquer la réplication du BNYVV. J'y montrerai comment nous avons obtenu des
RNA défectifs interférants (ou RNA DI) à partir du RNA 2, RNA DI que l'on peut
envisager d'utiliser comme outil de lutte contre ce virus. Enfin dans le chapitre IV, je
décrirai des résultats préliminaires qui permettent d'affirmer que la protéine P237, codée
par le RNA 1, est une polyprotéine susceptible d'être maturée au cours du cycle de
multiplication virale par une activité protéasique associée à cette polyprotéine.
16

23. CHAPITRE 1 :
LES PROTEINES EXPRIMEES A PARTIR DU "TRIPLE GENE
BLOCK" (TGB) SONT DIRECTEMENT IMPLIQUEES DANS LE
MOUVEMENT DU VIRUS DE CELLULE A CELLULE.
L'infection d'une plante par un virus à RNA passe, en général, par quatre étapes
majeures. Dans un premier temps le virus doit pénétrer dans les cellules de l'hôte. Cette
infection peut se faire par inoculation mécanique en provoquant une lésion au niveau
des tissus de la plante ; elle peut également s'établir par l'intermédiaire d'un vecteur
(aphide, nématode, champignon). Quand il est en place, le virus doit pouvoir se
multiplier, multiplication qui sous entend la décapsidation du ou des RNA génomiques
provenant de l'inoculum, leur traduction, leur réplication et finalement l'encapsidation
des RNA néosynthétisés. Dans un troisième temps, le virus est amené à quitter le site
d'infection pour migrer dans les cellules voisines. Finalement quand il atteint les
vaisseaux conducteurs, il va pouvoir infecter le reste de la plante provoquant ainsi une
infection systémique. La spécificité d'infection d'un virus pour un hôte particulier
consiste donc à pouvoir réaliser toutes ces étapes.

24. Résultats
______________________________________________________________________
Protéines de
mouvement Paroi
cellulaire
Type
TMV
Réplication
du virus ?
protéines
?
cellulaires
RNA viral
diffusion de
néosynthétisé ? l'infection
virale
Protéines de Type
Protéines de
mouvement CPMV
coque
Figure I-1 : Représentation schématique des 2 types de stratégies qui semblent
se dégager des études effectuées sur le mouvement de cellule à cellule des virus
de plantes. Le premier mécanisme fait appel à une protéine de mouvement qui
augmente la limite d'exclusion des plasmodesmes et qui permet une
linéarisation des RNA viraux qui pourront ainsi diffuser sous forme de
complexe ribonucléoprotéique. Cette stratégie est adoptée par le TMV. Le
second mécanisme engendre une modification irréversible des plasmodesmes
avec la présence de particules virales à l'intérieur de microtubules (c'est le cas
du CPMV).
18

25. Chapitre 1
______________________________________________________________________
Avant de présenter les résultats obtenus dans l'étude des gènes responsables de la
diffusion du BNYVV, je voudrais rappeler brièvement ce que l'on sait sur les différents
mécanismes de diffusion de cellule à cellule de l'infection virale.
I-Etat des connaissances sur les mécanismes de transport des virus.
En raison de la présence de la paroi pectocellulosique qui entoure chaque cellule
végétale, les possibilités de mouvement du virus de cellule à cellule sont très restreintes.
Le seul passage possible est représenté par les plasmodesmes qui sont des
communications intercellulaires assurant une continuité cytoplasmique entre 2 cellules
et permettant ainsi des échanges de métabolites. Des études par micro injection de
molécules fluorescentes de taille variable dans les cellules végétales ont permis de
mettre en évidence la limite d'exclusion moléculaire (SEL ou Size Exclusion Limit) des
plasmodesmes. Elle se situe entre 0,7 et 1 kDa ce qui correspond à peu près à un
diamètre de 1,5 à 2 nm. (Goodwin, 1983 ; Tucker, 1982).
Bien que la SEL soit relativement petite, Esau a montré, dès 1967, la présence de
virus de la jaunisse de la betterave (BYV) au niveau des plasmodesmes de plantes
infectées. Or le diamètre de ces virus à symétrie hélicoïdale est voisin de 10 nm, soit
cinq fois supérieure à la SEL. D'autres virus à symétrie hélicoïdale tels que le potato
virus X (ou PVX) (Allison & Shalla, 1974) et le barley stripe mosaic virus (ou BSMV)
(Mc Mullen et al, 1977), ainsi que des virus à symétrie icosaédrique comme les
lutéovirus (Gill & Chong, 1975 ; D'Arcy & De Zoeten, 1979) et les népovirus (De
Zoeten & Gaard, 1969) ont pu être observés au niveau de ces structures. Compte tenu de
leur SEL, il est évident que les plasmodesmes doivent donc subir des modifications
structurales pour permettre le passage de ces virus (Robards & Lucas, 1990).
A l'heure actuelle, 2 mécanismes majeurs (figure I-1) semblent être mis en jeu
dans la diffusion de l'infection virale à savoir le mécanisme utilisé par le virus de la
mosaïque du tabac (ou TMV) et d'autres tobamovirus et la stratégie employée par les
comovirus, les népovirus et les caulimovirus.
19

26. Résultats
______________________________________________________________________
1-Stratégie utilisée par les tobamovirus.
Les résultats majeurs ont été obtenus avec le TMV qui fut pendant longtemps le
phytovirus le plus étudié sur le plan physico-chimique et biologique. Il code notamment
pour une protéine de 30 kDa essentielle au mouvement du virus de cellule à cellule
(Leonard & Zaitlin, 1982 ; Meshi et al, 1987). Des études par microscopie électronique
ont permis de montrer que des plantes infectées par ce virus ont des plasmodesmes
ayant une SEL supérieure à celle d'une plante saine. Elle passe de 1,5 nm à 5-6 nm. Des
plantes transgéniques exprimant la protéine P30 de manière constitutive présentent
même une SEL de 6 à 9 nm (Deom et al, 1990 ; Wolf et al, 1989). La protéine P30 a pu
être localisée au niveau de ces plasmodesmes (Ding et al, 1992 ; Atkins et al, 1991 ;
Moser et al, 1988, Tomenius et al, 1987) sans pour autant en modifier la structure
(Shalla et al, 1982). Cette augmentation de la SEL n'est pourtant pas suffisante pour
permettre le passage du TMV d'une cellule à une autre, les particules virales en bâtonnet
ayant un diamètre moyen de 18 nm et l'encombrement moyen d'une molécule de RNA
étant de 10 nm (Gibbs, 1976). La protéine P30 a également la propriété de fixer les
acides nucléiques (Citovsky et al, 1990). Ces propriétés ont donc amené Citovsky et
collaborateurs (1992) à proposer un modèle dans lequel la protéine P30 joue un rôle
double dans le mécanisme de mouvement : (1) elle augmente la SEL des plasmodesmes
d'un facteur 3 à 4 et (2), en se fixant au RNA, elle lui confère une structure déroulée qui
lui permet de passer au travers des plasmodesmes. Ceci sous-entend que le mouvement
de cellule à cellule se fait sous forme de complexe ribonucléoprotéique sans intervention
de la protéine de capside. L'intervention de facteurs cellulaires n'a pas encore été
démontrée pour le moment.
2-Stratégie utilisée par les comovirus, les népovirus et les caulimovirus.
Ce second mécanisme a été plus particulièrement étudié pour un comovirus : le
cowpea mosaic virus (ou CPMV), un virus à génome bipartite qui exprime son
information sous forme de polyprotéines qui sont ensuite maturées. L'information
génétique de ce virus est portée par 2 RNA génomiques. Le B-RNA dispose de
20

27. Chapitre 1
______________________________________________________________________
l'information nécessaire et suffisante à la réplication car il est capable de s'auto répliquer
dans les protoplastes (Goldbach et al, 1980). Par contre, en l'absence du M-RNA, le
virus n'est pas capable d'induire une infection dans la plante. Une analyse détaillée a
montré que non seulement les protéines 48K/58K, dont l'information est portée par la
région 5' terminale du M-RNA, sont nécessaires au mouvement de cellule à cellule
(Rezelman et al, 1982), mais également les protéines de capsides VP37 et VP23. Les
protéines non structurales 48/58 K ont été localisées au niveau de structures tubulaires
dans les plasmodesmes de plantes infectées (Van Lent et al, 1990) : ces structures
modifient les plasmodesmes de façon irréversible et renferment des particules virales.
Ces tubules peuvent également être observées au niveau de la membrane de protoplastes
infectés (Van Lent, 1991). Enfin, plus récemment, grâce à des expériences d'expression
transitoire, il a été possible de démontrer que la protéine de 48 K était, d'une part, la
protéine de mouvement et, d'autre part, la seule protéine virale responsable de la
formation in vivo de ces tubules (Kasteel et al, 1993 ; Wellink et al, 1993). Cependant,
comme dans le cas de la stratégie utilisée par les tobamovirus, la participation de
protéines cellulaires ne peut être exclue à l'heure actuelle.
La formation de tubules et la présence de particules virales à l'intérieur de ces
structures ont également été observées pour d'autres types de virus comme l'euphorbia
mosaic virus (EMV), un géminivirus (Kim & Lee, 1992), le cauliflower mosaic virus
(CaMV), un caulimovirus (Stussi-Garraud et al, 1994), le tomato spotted wilt virus
(TSWV), un tospovirus (Kormelink, 1994) et le grapevine fanleaf virus (GFLV), un
népovirus (Ritzenthaler et al, 1995).
3-Stratégie utilisée par les hordeivirus, les potexvirus et les furovirus.
Enfin d'autres virus utilisent une stratégie de mouvement qui nécessite la synthèse
de 3 protéines à partir de 3 gènes regroupés en triple gene block, mais, à l'heure actuelle,
le mécanisme mis en oeuvre n'est pas encore élucidé. Cette stratégie est utilisée par le
21

28. Résultats
______________________________________________________________________
BNYVV
RNA 1 A
CP
RNA 2 A
TGB
RNA 3 A RNA 4 A
WClMV
CP
A
TGB
BSMV
RNA α AA
RNA ß CP AA
TGB
RNA γ AA
Figure I-2 : Organisation génétique du BNYVV, du WClMV et du BSMV.
Domaine hydrophobe
Séquence GDD caractéristique des polymérases
virales
Séquence GKS, site de fixation de nucléotides
triphosphates
CP Protéine de capside
TGB Triple Gene block impliqué dans le mouvement
du virus de cellule à cellule
Protéine jouant un rôle dans la réplication du virus
22

29. Chapitre 1
______________________________________________________________________
BSMV) (Petty et al, 1990), un hordeivirus et le white clover mosaic virus (WClMV)
(Beck et al, 1991), un potexvirus. Le BNYVV fait appel également à un ensemble de 3
gènes pour assurer la fonction de transport. Les ressemblances entres ces 3 virus ne
s'arrêtent pas là ; il faut également noter des homologies de séquences importantes entre
ces protéines, plus particulièrement au niveau des protéines codées par les 2 premiers
gènes du TGB (Figure I-2).
II-Rôle du Triple Gene Block dans le mouvement de cellule à cellule du BNYVV.
L'inoculation mécanique de feuilles de Chenopodium quinoa par des transcrits du
RNA 1 et du RNA 2 provoque des lésions chlorotiques localisées. Les RNA 1 et 2 du
BNYVV sont donc nécessaires et suffisants aux fonctions de base du virus, à savoir la
réplication, l'encapsidation et le mouvement de cellule à cellule de l'infection virale.
Les ORF III, IV et V du RNA 2 du BNYVV sont organisées en triple gene block.
La protéine P42 exprimée à partir de l'ORF III renferme une séquence GKS souvent
associée aux hélicases. Les protéines P13 et P15 codées respectivement par les ORF IV
et V contiennent des domaines hydrophobes. Les protéines P42 et P13 ont été localisées
au niveau de fractions membranaires dans des plantes infectées (Niesbach-Klösgen et al,
1990).
1-Le Triple Gene Block du BNYVV est impliqué dans le mouvement du virus de
cellule à cellule.
a-Construction de mutants du TGB.
Pour tous les RNA génomiques, nous disposons de clones cDNA complets à partir
desquels il est possible de synthétiser in vitro des transcrits qui se sont révélés être
infectieux lors d'une inoculation mécanique de feuilles de C. quinoa. Partant de ces
constructions, nous avons pu réaliser des modifications au sein des RNA génomiques
23

30. Résultats
______________________________________________________________________
CP
RNA 2 A
TGB
mutant H A
sauvage ACA CTA GTA GAG
mutant ACA CTA GCT AGT
mutant I A
sauvage AT AGA G
mutant AT AAC TCG
mutant J A
sauvage AGG AAT TCG
mutant AGG AAT T AA TTC G
Figure I-3 : Localisation des mutations introduites dans le triple gene block (TGB) du
RNA 2 du BNYVV. Les sites de restriction utilisés pour introduire les
modifications (Spe I pour le mutant H et Eco RI pour le mutant J) sont
représentés en rouge. Les nucléotides insérés sont soulignés.
24

31. Chapitre 1
______________________________________________________________________
afin de pouvoir étudier le rôle des différents gènes. Par mutagénèse dirigée, nous avons
construit les mutants décrits figure I-3. Pour obtenir le mutant H, nous avons linéarisé le
plasmide pB218 en un site Spe I, puis, par l'utilisation du fragment de Klenow de la
DNA polymérase, ce site a été rempli, générant ainsi, après religation, un plasmide
pB218 ayant une insertion de 4 nucléotides au niveau de l'ORF III. L'utilisation d'un
oligonucléotide mutagène nous a permis d'insérer 4 nucléotides (ACTC) dans le gène IV
et d'obtenir ainsi le mutant I. Enfin, pour construire le mutant J, il nous a fallu faire une
digestion partielle Eco RI du plasmide pBF14 suivie d'un remplissage du site de
restriction par le fragment de Klenow de la DNA polymérase. Après ligation, le clone
obtenu dispose d'une insertion de 4 nucléotides. Pour tous les mutants décrits ci dessus,
l'insertion de 4 nucléotides génère un changement du cadre de lecture, l'apparition d'un
codon stop et donc la synthèse de protéines tronquées non fonctionnelles.
b-Etude de l'effet des mutations introduites dans le TGB.
Afin de vérifier si les protéines codées par le TGB jouent un rôle dans la
réplication, les transcrits correspondants à ces différents mutants ont été coinoculés avec
du RNA 1 (nécessaire à la réplication) à des protoplastes de C. quinoa. Après 48 heures
de culture, les RNA totaux ont été extraits puis analysés par hybridation moléculaire en
utilisant des sondes spécifiques des RNA 1 (pB12 : nt 4740 à 6560) et 2 (pB21 : nt 2335
à 3793). Nous avons ainsi pu constater qu'en l'absence des protéines P42 (mutant H),
P13 (mutant I) et P15 (mutant J) fonctionnelles le virus était encore capable de se
répliquer (voir publication 1, figure 4, pistes 2, 3 et 4). Les mutations introduites dans
ces 3 gènes n'altèrent donc pas une structure impliquée en cis dans la reconnaissance par
le complexe de réplication.
Pour tester l'impact des modifications introduites dans le TGB sur la diffusion de
l'infection virale, les différents mutants ont ensuite été transcrits et coinoculés avec du
RNA 1 à des feuilles de C. quinoa. Une semaine après l'infection, alors qu'il apparaît
25

32. Résultats
______________________________________________________________________
des symptômes chlorotiques classiques sur les feuilles inoculées par du RNA 1 et 2
sauvage,
P75
CP 54 kDa P13 P14
RNA 2 A 4,6 kb
P42 P15*
TGB
nt 2324-3789
pB21
A
nt 638 à nt 3949 à
2081 ² BB nt 2078 à 4481 ² AS
2715 218Bg
2 sub c A 0,7 kb
B 2 sub b A 1,4 kb
2 sub a A 2,6 kb
Figure I-4 : Localisation (A) des sondes riboprobes utilisées pour la mise en évidence
des RNA subgénomiques (B). (* le produit d'expression du gène V n'a jamais pu
être détecté in vivo).
26

33. Chapitre 1
______________________________________________________________________
les feuilles inoculées en présence des mutants du TGB ne présentent pas de lésions.
L'analyse par hybridation moléculaire des RNA extraits de ces feuilles ne permet pas de
mettre en évidence de RNA viral (Voir publication 1, figure 2, pistes 3, 4 et 5). On peut
donc conclure que les protéines du TGB sont toutes les 3 essentielles au mouvement de
cellule à cellule de l'infection virale. En absence de mouvement, il est impossible de
détecter une infection qui reste limitée aux seules cellules initialement infectées.
2-Les protéines P42 et P13 du Triple Gene Block sont exprimées à partir de RNA
subgénomiques.
Pour exprimer des protéines codées par des cistrons internes d'un RNA
génomique, les virus de plantes ont élaboré de nombreuses stratégies comme : (1) le
mécanisme de "terminaison-réinitiation" où les ribosomes, après avoir traduit une ORF
glissent sur le messager jusqu'à ce qu'ils rencontrent un nouvel AUG initiateur (Kozak,
1989) ; (2) le "leaky scanning" où les ribosomes initient la traduction au niveau du
premier AUG, mais également au niveau d'un autre AUG plus en aval si le premier
AUG n'est pas dans un contexte favorable (Kozak, 1989) ; (3) le mécanisme "d'entrée
interne" quand les ribosomes reconnaissent une séquence au sein d'un RNA génomique
(Pelletier & Sonnenberg, 1988) ; (4) la translecture obtenue par suppression d'un codon
stop (Ziegler et al, 1985) ; (5) le changement de cadre de lecture ou frame shift (Brault
& Miller, 1992), enfin (6) l'utilisation de RNA subgénomiques où le gène à exprimer se
trouve localisé à l'extrémité 5' du RNA messager.
Pour mettre en évidence la présence de RNA subgénomiques correspondant aux
cistrons 3' proximaux du RNA 2, nous avons inoculé des feuilles de C. quinoa ou une
autre plante hôte Tetragonia expansa avec du BNYVV isolat Stras 12 contenant les
RNA 1 et 2. Lorsque les lésions apparaissent, les RNA totaux sont extraits puis analysés
par hybridation moléculaire en utilisant des sondes ribonucléiques correspondant à des
séquences internes du RNA 2 (figure I-4). L'utilisation d'une sonde ∆AS correspondant à
l'extrémité 3' terminale du RNA 2 (nt 3949 à 4481) nous a permis de mettre en évidence
4 bandes ayant une taille de 0,7 kb pour le RNA 2sub c, 1,4 kb pour le RNA 2sub b,
27

34. Résultats
______________________________________________________________________
2,6 kb pour le RNA 2sub a et enfin 4,6 kb pour le RNA 2 complet (voir publication 1,
figure 5, piste 4). Lorsque l'on utilise d'autres sondes, seule l'une ou l'autre de ces bandes
apparait après autoradiographie. Ainsi la sonde 218Bg (nt 2078 à 2715) ne révèle que le
RNA 2sub a et le RNA 2. Enfin la sonde ∆BB (nt 638 à 2081) ne s'hybride qu'au RNA
génomique. La taille de ces différents RNA subgénomiques correspond aux tailles
attendues pour des RNA permettant l'expression de la protéine P42 (RNA 2sub a), de la
protéine P13 (RNA 2sub b) et de la protéine P14 (RNA 2sub c).
Pour la protéine P15, aucun RNA subgénomique n'a pu être mis en évidence. Pour
expliquer cela, 2 hypothèses peuvent être émises : soit la synthèse du RNA
subgénomique est très faible, soit la protéine P15 est exprimée sous forme d'une
protéine de fusion P13-P15. Ceci impliquerait alors un changement de cadre de lecture
de l'ORF IV. Dans ce cas, la synthèse de la protéine P13-P15 se ferait à un taux très
faible, ce qui expliquerait pourquoi elle n'a pas encore pu être détectée in vivo en
utilisant un sérum anti P13.
III-Conclusions et perspectives.
Nous avons montré dans ce chapitre que les protéines exprimées à partir du TGB
étaient toutes les 3 essentielles au mouvement du virus de cellule à cellule. En leur
absence, l'infection d'une plante ne peut avoir lieu. Nous avons également montré que
l'expression de 2 des 3 protéines au moins se faisait à partir de RNA subgénomiques.
Ces résultats vont dans le sens d'observations faites pour d'autres virus comme le
WClMV, un potexvirus (Beck et al, 1991) et pour le BSMV, un hordeivirus (Petty et al,
1990).
Des études ont été entreprises au laboratoire, afin de mieux comprendre le rôle de
ces 3 protéines dans le mouvement de cellule à cellule. Les résultats préliminaires
indiquent que la protéine P42 est dotée d'une activité ATP binding à l'image de la
protéine de 58 K codée par le RNA ß du BSMV (Jackson et al, 1991). Enfin, comme
dans le cas de la protéine de coque d'AMV (Baer et al, 1994), il semblerait que
28

35. Chapitre 1
______________________________________________________________________
l'extrémité N-terminale de la protéine P42 soit indispensable à l'activité de fixation des
acides nucléiques (C. Bleykasten, communication personnelle). Des études d'interaction
entre les 3 protéines du TGB ont également été initiées en utilisant la technique "double
hybride" (Hope & Struhl, 1986 ; Keegan et al, 1986 ; Ma & Pasthne, 1987). En effet, les
protéines P13 et P42 ont été retrouvées au niveau de fractions membranaires (Niesbach-
Klösgen et al, 1990). Or, seule la protéine P13 est dotée de régions hydrophobes
pouvant faciliter l'ancrage au niveau des membranes. Pour expliquer la colocalisation
membranaire de la protéine P42, on peut donc imaginer des interactions entre cette
protéine et la protéine P13.
29

36. Résultats
______________________________________________________________________
30

37. Publication n°1
EFFICIENT CELL TO CELL MOVEMENT OF BEET NECROTIC YELLOW
VEIN VIRUS REQUIRES 3' PROXIMAL GENES LOCATED ON RNA 2
D. Gilmer, S. Bouzoubaa, A. Hehn, H. Guilley, K. Richards and G. Jonard.
Virology
(189, 40-47)
(1992)

38. Résultats
______________________________________________________________________
32

39. Publication n°1
______________________________________________________________________
33

40. Résultats
______________________________________________________________________
34

41. Publication n°1
______________________________________________________________________
35

42. Résultats
______________________________________________________________________
36

43. Publication n°1
______________________________________________________________________
37

44. Résultats
______________________________________________________________________
38

45. Publication n°1
______________________________________________________________________
39

46. Résultats
______________________________________________________________________
40

47. CHAPITRE 2 :
ETUDE DE LA PROTEINE P14 CODEE PAR
L'ORF 3' PROXIMALE DU RNA 2 DU BNYVV.
I-Mise en évidence du rôle de la protéine P14 dans le cycle de multiplication du
BNYVV.
1-Des mutations introduites dans le gène VI du RNA 2 engendrent une diminution du
taux de réplication des RNA viraux. (publication n°1)
Dans le chapitre précédent, nous avons montré que les trois protéines codées par
le TGB sont nécessaires au mouvement à courte distance du virus. Dans ce deuxième
chapitre, nous allons nous intéresser plus particulièrement au rôle de l'ORF 3' proximale
du RNA 2 (encore appelée ORF VI) dans le cycle de multiplication du BNYVV. Cette
ORF code pour une protéine de 14 kDa qui a été localisée par immunochimie au niveau
de la fraction cytosolique (Niesbach-Klösgen et al, 1990) et qui est exprimée à partir
d'un RNA subgénomique, le RNA 2sub c. Pour essayer de mieux comprendre la
fonction de cette protéine dans le cycle de multiplication viral, nous avons utilisé la
même approche

48. Résultats
______________________________________________________________________
TGB
P75
RNA 2 CP P13 P14
A
P42
15 kDa
nt 4043
mutant 3722
ATG GAG ATC TGG TAG
nt 4043 nt 4078
mutant 4003
GGT TGA TGC
nt 4043 nt 4148
mutant 3992
TGG TAA TTG
Figure II-1 : Caractéristiques des mutants du RNA 2 n'exprimant pas la
protéine P14. Les nucléotides introduits dans le génome viral sont
écrits en rouge. Les codons stop qui apparaissent sont soulignés.
42

49. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
que précédemment dans l'étude du TGB, à savoir l'introduction de mutations dans l'ORF
VI et l'analyse des conséquences au niveau biologique.
a-Construction de mutants n'exprimant pas la protéine P14.
L'introduction de mutations dans la région 3' proximale du RNA 2 pouvait
toucher des séquences impliquées en cis dans la réplication du RNA 2. C'est pourquoi,
pour minimiser ce risque, nous avons multiplié les constructions et réparti les mutations
tout au long de la séquence de l'ORF VI. Deux approches différentes ont été utilisées : la
première a consisté à insérer un linker Bgl II de 10 nucléotides au niveau du site Sma I
situé en position 4331, entraînant ainsi un changement du cadre de lecture (+1) (voir
publication 1, figure 1) et donnant le mutant RNA 2-L. La seconde approche repose sur
l'introduction de mutations ponctuelles (figure II-1) dans un fragment correspondant aux
824 derniers nucléotides du RNA 2 cloné dans le vecteur Bluescribe. Trois mutants ont
ainsi été obtenus : (1) le mutant RNA 2-3722 (voir publication 1, figure 1) où 2
nucléotides ont été insérés en position 4050 ce qui a pour conséquence d'éliminer le
2ème ATG initiateur et d'introduire un changement du cadre de lecture qui entraîne
l'apparition d'un codon stop. (2) Le mutant RNA 2-3992 où la substitution d'un
nucléotide génère un codon stop en position 4148. (3) Le mutant RNA 2-4003 où
l'introduction d'un T en position 4078 fait apparaître un codon de terminaison TAA.
Toutes ces mutations entraînent soit l'absence de synthèse de protéine P14
(mutant 3722), soit conduisent à la synthèse d'une protéine P14 plus ou moins tronquée
(mutants 3994 et 4003). Le fragment de 824 nt a finalement été réinséré dans le clone
cDNA complet du RNA 2.
b-Effet in planta des mutations introduites dans le gène VI.
Pour analyser les effets des mutations introduites dans le gène VI, les différents
mutants ont été transcrits puis coinoculés avec des transcrits du RNA 1 à des feuilles de
C. quinoa. Huit à dix jours après l'infection, on voit apparaître des lésions ayant un
43

50. Résultats
______________________________________________________________________
phénotype différent de celui des lésions provoquées par l'isolat sauvage : ces lésions
sont
44

51. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
A
Stras 123 Mutant 2-3722
B
RN RN RN
A A A
RN 2- 2-
2-
A2 37 39 40
22 92 03
RNA 1
RNA 2
1 2 3 4
Figure II-2 : Effets des mutations introduites dans le gène VI. (A) Symptômes observés sur
des feuilles de C. quinoa inoculées avec l'isolat sauvage et le mutant RNA 2-3722
(B) Analyses par hybridation moléculaire des RNA totaux extraits des feuilles de
C. quinoa : sur la piste 1 ont été déposés 1/20 des RNA totaux extraits des feuilles
inoculées avec l'isolat sauvage Stras 123. Les pistes 2, 3 et 4 correspondent
respectivement à la totalité des RNA extraits de feuilles inoculées par les mutants
RNA 2-3722, RNA 2-3992 et RNA 2-4003.
45

52. Résultats
______________________________________________________________________
petites et nécrotiques en leur centre (figure II-2-A). Afin d'analyser la quantité de RNA
viral présent dans les feuilles inoculées, nous avons prélevé ces lésions ainsi que les
lésions provoquées par les RNA viraux sauvages, en prenant garde de récupérer la
même surface foliaire dans les 2 cas. Les RNA sont extraits en présence de tampon
polysome, comme cela a été décrit dans le chapitre matériel et méthodes. La lecture de
la DO260nm permet d'estimer la quantité de RNA total présent dans l'extrait et 300 ng
sont déposés sur gel d'agarose en conditions dénaturantes. Après transfert sur membrane
de nitrocellulose, les RNA sont analysés par hybridation moléculaire en utilisant des
sondes ribonucléiques spécifiques complémentaires du RNA 1 (pB12 : nt 4740 à 6560)
et du RNA 2 (pB21 : nt 2335 à 3793). Quel que soit le mutant analysé, on peut constater
une forte diminution de la quantité de RNA 2 mutant par rapport au RNA 2 sauvage. La
réplication du RNA 1 est également affectée mais dans des proportions plus faibles
(publication 1, figure 2, pistes 6, 7, 9 et 10, et voir figure II-2, pistes 2, 3 et 4).
Ces résultats suggèrent donc que la protéine P14 n'est pas essentielle à l'infection
virale mais la favorise, soit en améliorant l'efficacité du mouvement de cellule à cellule,
soit en stimulant la multiplication du virus. Pour discriminer entre ces 2 possibilités,
nous avons inoculé ces mêmes mutants à des protoplastes de C. quinoa.
c-Mise en évidence du rôle de la protéine P14 dans la réplication du BNYVV et la
quantité de protéine de capside synthétisée.
Les transcrits des différents mutants n'exprimant pas la protéine P14 ainsi que les
transcrits du RNA 1 (nécessaire à la réplication) ont été coinoculés à des protoplastes de
C. quinoa. Après 48 heures de culture, nous avons extrait et analysé les RNA totaux par
hybridation moléculaire. Les résultats que nous avons obtenus révèlent une chute
importante de la quantité de RNA 2 et une diminution beaucoup plus faible voire parfois
nulle du signal correspondant au RNA 1 (voir publication 1, figure 4, pistes 5 et 6). Ces
résultats qui sont tout à fait comparables à ceux obtenus sur plantes sont regroupés dans
le tableau II-1 : le pourcentage d'inhibition de la réplication du RNA 2 en absence de
synthèse de protéine P14 peut atteindre 85 à 98 % ; par contre ce pourcentage n'est plus
46

53. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
Accumulation par rapport au
témoin sauvage
Expérience n° Mutant RNA 1 RNA 2
2-4003 120 % 13 %
1 2-3992 150 % 14 %
2-3722 42 % 2%
2-4003 58 % 2%
2
2-3992 38 % 7%
3 2-4003 64 % 5%
4 2-4003 37 % 2%
Tableau II-1: Effets des mutations introduites dans le gène VI sur la réplication des
RNA 1 et RNA 2 de BNYVV.
Synthèse de
Réplication
protéine de
du RNA 2
coque
RNA 1 + RNA 2 ++++ ++++
RNA 1 + RNA 2-4003 + +
RNA 1 + RNA 2-4003
+ RNA 2-F + ++++
RNA 1 + RNA 2-4003
+ rep 14 + +++
Tableau II-2 : Bilan des expériences de complémentation démontrant que
la protéine P14 a une action en cis sur la réplication du RNA 2 et
en trans sur la synthèse de protéine de capside.
47

54. Résultats
______________________________________________________________________
Figure II-3 : Cinétique de réplication des RNA viraux et de synthèse des protéines
P14, CP et P42 dans des protoplastes de C. quinoa infectés par l'isolat
Stras 12 de BNYVV.
Les prélèvements ont été effectués au bout de 9, 16, 24 et 48 heures
d'infection et les analyses réalisées par hybridation moléculaire et par
immunoempreinte pour détecter les RNA viraux (A) et les protéines P14
(B), CP (C) et P42 (D)
48

55. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
que de 63 % dans le pire des cas pour le RNA 1. D'autres expériences ont également
montré que la réplication du RNA 3 est peu ou pas affectée par l'absence de protéine
P14.
L'autre effet significatif des mutations introduites dans l'ORF VI est une
diminution importante de la quantité de protéine de capside synthétisée (tableau II-2 et
publication 2, figure 4-B, pistes 3 et 4) alors que la synthèse de protéine P25 codée par
le RNA 3 n'est pas affectée (publication 2, figure 4-A, pistes 3 et 4). Enfin, pour
expliquer la petite taille des lésions et leur phénotype nécrogène, on peut émettre
l'hypothèse suivante. En absence de protéine P14, les taux de réplication des RNA
viraux et de synthèse de protéine de coque sont considérablement abaissés ce qui peut se
répercuter de manière directe ou indirecte sur la synthèse des protéines de mouvement
du virus, ralentissant ainsi sensiblement le processus infectieux. Cet effet pourrait alors
permettre à la plante de mettre en place un système de défense qui s'apparenterait, dans
ce cas là, à une réaction d'hypersensibilité sévère caractérisée par l'apparition de lésions
nécrotiques.
2-La protéine P14 joue un rôle en cis dans la réplication du RNA 2 et active en trans
la synthèse de la protéine de coque. (publication n°2)
Avant de décrire les expériences de complémentation qui nous ont permis de
mieux comprendre le mécanisme d'action de la protéine P14 dans la réplication et dans
la traduction du RNA 2, il était intéressant d'étudier la cinétique d'apparition de cette
protéine ainsi que son rôle dans la synthèse de RNA de polarité négative.
a-Cinétique d'apparition de la protéine P14 lors de l'infection de protoplastes de
C. quinoa.
Les cinétiques réalisées avec l'isolat Stras 12 montrent que la protéine P14 peut
être détectée en western blot à partir de 16 heures (figure II-3-B, piste 3). Des études
effectuées en parallèle sur la synthèse de protéine capsidaire et de la protéine P42
révèlent que toutes ces protéines apparaissent en même temps (figure II-3-C et D, piste
49

56. Résultats
______________________________________________________________________
3). Cependant au bout de 48 heures de culture, la synthèse de protéine P42 atteint un
maximum alors que les protéines P14 et CP continuent à s'accumuler ; nous avons pu
montrer dans d'autres expériences que l'accumulation de protéine de coque et de
protéine P14 continuait jusqu'au temps 72 heures. Au delà de ce temps, le taux de
mortalité des protoplastes devient trop important pour que les résultats obtenus puissent
être pris en considération. Ces observations suggèrent que la synthèse de protéine P42
est donc régulée différemment des 2 autres protéines étudiées. Des observations
analogues ont été faites par Davies et collaborateurs (1993) en ce qui concerne la
protéine P25 synthétisée à partir de la première ORF du TGB du potato virus X (ou
PVX).
b-L'absence de protéine P14 a un effet inhibiteur sur la synthèse de RNA (-).
Après avoir mis en évidence un effet négatif sur la synthèse des brins (+), nous
avons cherché à savoir si l'absence de protéine P14 affectait également la synthèse des
brins (-). Pour cela, les RNA totaux ont été extraits de protoplastes infectés après 36
heures de culture dans les conditions décrites dans le chapitre matériel et méthodes. La
seule modification introduite dans le protocole expérimental consiste à précipiter
l'ensemble des acides nucléiques en présence d'éthanol et d'acétate d'ammonium 2 M.
Nous avons ainsi pu montrer qu'en l'absence de protéine P14, l'effet observé pour les
RNA brin (+) se retrouve au niveau de la synthèse des RNA brins (-) (publication 2,
figure 5-A et B) en provoquant une réduction importante de l'intensité des signaux plus
particulièrement au niveau des brins (-) correspondant au RNA 2.
c-La protéine P14 agit en cis sur la réplication du RNA 2.
Dans les expériences décrites ci-dessous, nous avons entrepris de complémenter
l'effet des mutations introduites dans l'ORF VI par l'apport de protéine P14 sauvage. Ces
expériences de complémentation ont été réalisées de 2 façons différentes :
50

57. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
- Dans une première série d'expériences, nous avons utilisé le mutant RNA 2-F
(figure II-4) caractérisé par une délétion de 935 nt au niveau de l'ORF II. Ce mutant est
capable de se répliquer dans les protoplastes (voir publication 1, figure 4, piste 1 ;
1143 2077
RNA 2-F
An
RNA 2 sub c An
382 1688
tRep 14 An
Protéine P14
Figure II-4 : Caractéristiques des transcrits RNA 2 F et tRep 14 exprimant la protéine P14
dans les expériences de complémentation.
: Séquences 5' et 3' non codantes du RNA 3.
: ORF VI dirigeant la synthèse de la protéine P14.
: Protéine P14.
.
51

58. Résultats
______________________________________________________________________
52

59. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
380 linker BamHI 1470
Bam HI Bam HI
+ P14
promoteur
T7
pB6 (²ES) PCR ORF VI
(+ sites Bam HI)
Rep 14 P14
tRep 14 P14 An
Figure II-5 : Représentation schématique de la construction du clone Rep 14.
Après amplification par PCR, l'ORF VI du RNA 2 de BNYVV est introduit dans le
clone cDNA du RNA 3 délété de toute l'information codante (pB6 (²ES).
53

60. Résultats
______________________________________________________________________
publication 2, figure 1, piste 2) et permet la synthèse d'une protéine P14 native. Les
expériences de complémentation ont consisté à coinoculer le mutant RNA 2-F avec le
RNA 1 et le RNA 2-4003 n'exprimant pas la protéine P14. Ces expériences qui ont été
répétées un grand nombre de fois n'ont jamais permis de déceler une stimulation de la
réplication du RNA 2-4003 (publication 2, figure 1, piste 4) suggérant ainsi que la
protéine P14 ne peut être efficace lorsqu'elle est apportée en trans. Cependant on peut
imaginer une autre explication : la synthèse de protéine P14 à partir du RNA 2-F se
ferait à un taux trop faible pour être efficace dans une action en trans.
- C'est pourquoi, dans une deuxième série d'expériences, nous avons utilisé un
transcrit exprimant la protéine P14 en grande quantité, le transcrit rep 14 (figure II-4)
correspondant obtenu de la manière suivante (voir figure II-5) : le gène VI a d'abord été
amplifié par PCR en utilisant des amorces contenant les sites de restriction Bam HI.
Après digestion Bam HI, le produit PCR a été introduit dans le clone pB6 (∆ES) entre
les séquences 5' (1 à 380) et 3' (1470 à 1773) non traduites du RNA 3 du BNYVV. Dans
ce clone construit par Isabelle Jupin (Jupin et al, 1990), la séquence virale est placée
sous le contrôle du promoteur T7 . Le produit de transcription rep 14 est capable de se
répliquer dans les protoplastes lorsqu'il est inoculé en présence de transcrits du RNA 1.
De plus ce transcrit est capable d'exprimer efficacement la protéine P14 (publication 2,
figure 3-B, piste 4 et 5). Le transcrit rep 14 a donc été coinoculé avec les RNA 1 et 2-
4003 et, là encore, les résultats de ces expériences de complémentation ne révèlent
aucune stimulation de la réplication du RNA 2-4003 (publication 2, figure 1, piste 6).
On peut donc en conclure que la protéine P14 joue très certainement un rôle en cis sur la
réplication du RNA 2 (voir tableau II-2).
d-La protéine P14 stimule en trans la synthèse de la protéine de capside.
Parallèlement à ces analyses par hybridation moléculaire, nous avons recherché
par immunoempreinte la présence de protéine de coque. Nous avons ainsi pu mettre en
évidence une seconde fonction liée à la protéine P14 : indépendamment de l'effet en cis
sur la réplication, la protéine P14 peut stimuler fortement en trans, la synthèse de la
54

61. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
protéine de coque. En effet, le signal correspondant à la protéine de coque est beaucoup
plus intense en présence de protéine P14 apportée en trans par le transcrit rep 14
(publication 2, figure 3-A, piste 5) qu'en son absence (publication 2, figure 3-A, piste 3)
bien que le taux de réplication du RNA 2-4003 ne soit pas stimulé (publication 2,
figure 2, piste 3 et 6 et tableau II-2).
Pour expliquer ce résultat, nous avons émis l'hypothèse que la protéine P14 a une
affinité pour une séquence spécifique du RNA 2 et favorise ainsi la traduction de la
protéine capsidaire. C'est pourquoi nous avons entrepris des expériences d'expression
transitoire en bombardant des feuilles de C. quinoa et de Nicotiana tabacum avec 2
types de vecteurs : l'un permet la synthèse de protéine P14 et l'autre renferme la
séquence cible potentielle reconnue par la protéine P14, en l'occurrence la région 5'
terminale de l'un ou l'autre RNA du BNYVV. Cette séquence cible est placée en amont
d'un gène rapporteur permettant de visualiser la stimulation si celle-ci a lieu. Les
caractéristiques de ces vecteurs sont les suivantes :
- Les vecteurs permettant l'expression de la protéine P14 native ou tronquée ont
été obtenus par insertion de la séquence nucléotidique correspondante dans le plasmide
pMJD 82 (Dowson Day et al, 1994). Pour cela, nous avons amplifié, par PCR, le cistron
de la protéine P14 sauvage ou mutée en utilisant une amorce 5' renfermant le site Nco I
et un oligonucléotide correspondant à l'extrémité 3' du RNA 2. Ce produit PCR a
ensuite été digéré par les enzymes Nco I et Stu I (site naturel localisé en position 4479
du RNA 2) puis inséré dans le vecteur pMJD 82 linéarisé par Nco I et Sma I. Nous
avons ainsi obtenu les vecteurs pMJD-P14 exprimant la protéine P14 sauvage et pMJD-
P14∆1 exprimant une protéine P14 délétée de 30 acides aminés. Ce mutant de délétion
a été obtenu par une digestion à l'exonucléase III générant une délétion de 98 nt (nt
4286-4284) suivie d'une insertion d'un linker de 8 nucléotides permettant de récupérer la
phase de lecture. Lorsque ce mutant du gène VI est introduit dans le RNA 2 et que le
transcrit correspondant est inoculé à des protoplastes, on obtient des résultats analogues
aux résultats obtenus avec les mutants ponctuels RNA 2-3722, -3992 et -4003. Le clone
55

62. Résultats
______________________________________________________________________
pMJD-P14∆1 nous a servi de témoin négatif dans les expériences d'expression
transitoire décrites ci-dessous.
- Les vecteurs renfermant les séquences cibles ont été obtenus par insertion de
produits PCR correspondant aux extrémités 5' non codantes des RNA 2, 3 et 4 du
BNYVV (respectivement les 142, 442 et 377 premiers nucléotides) dans le vecteur
pRT2-syn-LUC : les amplifications PCR ont été effectuées en utilisant des
oligonucléotides renfermant un site Xho I pour l'amorce 5' et un site Nco I pour l'amorce
3'. Après digestion par ces 2 enzymes, les fragments ont été introduits dans le vecteur
rapporteur pRT2-syn-LUC coupé par Xho I et Nco I. Les plasmides recombinants ainsi
obtenus ont été appelés pRT-BN2-LUC, pRT-BN3-LUC et pRT-BN4-LUC. Les
différents plasmides recombinants ont ensuite été cobombardés (un vecteur de type
pMJD avec un vecteur de type pRT) sur des feuilles de C. quinoa et de N. Tabacum
(voir matériel et méthodes). Vingt quatre heures après l'inoculation, la stimulation de
l'activité luciférase a été analysée. Les résultats (publication 2, tableau 2) démontrent
que la protéine P14 est en mesure de stimuler l'activité luciférase dans les 2 types de
feuilles bombardées ; ce facteur de stimulation peut varier de 2,4 à 4,5 . Cependant,
cette stimulation n'est pas spécifique d'une séquence présente dans la région 5' leader du
RNA 2 car elle a lieu quelle que soit la séquence cible utilisée ; même le vecteur
rapporteur renfermant uniquement la cassette de clonage montre une stimulation de
l'activité luciférase en présence de la protéine P14. Cependant, le facteur de stimulation
est plus faible que celui observé lors de la synthèse de protéine CP dans les expériences
de complémentation dans les protoplastes où la protéine P14 est apportée en trans. Il est
clair que ces expériences devront donc être reprises avec des séquences du RNA 2 du
BNYVV allongées au delà de la séquence 5' leader si l'on veut observer une stimulation
beaucoup plus significative.
3-Mode d'action de la protéine P14.
Pour expliquer les résultats décrits ci dessus, nous avons proposé le modèle
suivant (voir figure II-6) : dans les premiers instants de l'infection, les RNA décapsidés
56

63. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
CP
P75
5' 3' Brin plus
Brin moins 3' 5'
Rôle au
niveau de la
RNA 2 sub c 5' 3' réplication
Rôle au niveau (en cis)
de la traduction
P14
(en trans)
CP
P75
5' 3' Brin plus
Figure II-6 : Modèle permettant d'expliquer le rôle de la protéine P14
dans le cycle de multiplication du BNYVV.
57

64. Résultats
______________________________________________________________________
Synthèse de RNA brin + et de RNA subgénomiques
3' 5'
-
Complexe de
réplication
5'
3'
-
+
La protéine P14 naissante se fixe au complexe de réplication et reconnait
une séquence sur le brin + néosynthétisé. Puis elle stimule la synthèse de
RNA brin -.
3'
-
+
+
-
Figure II-7 : Modèle proposé pour expliquer le rôle en cis de la protéine P14
dans la réplication du RNA 2.
58

65. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
de polarité positive provenant de l'inoculum, sont traduits permettant, entre autre, la
synthèse de RNA polymérase RNA dépendante. Cette enzyme va permettre la formation
d'un complexe de réplication induisant, à un taux que nous allons qualifier de basal, la
synthèse de RNA de polarité négative. Ces RNA (-) servent ensuite de matrice pour la
formation des RNA complémentaires génomiques et subgénomiques. Puis la protéine
P14 néosynthétisée à partir du RNA 2sub c pourra stimuler en cis la synthèse de
nouveau brin moins à partir desquels se fera une synthèse massive de RNA génomiques.
Cet effet en cis est assez peu courant et mérite que l'on s'y attarde un peu plus : comme
on peut le voir sur la figure II-7, le RNA de polarité négative sert de matrice à la
synthèse de RNA génomique, mais également à la synthèse de RNA subgénomique.
Celui ci pourra être pris en charge, durant sa synthèse par les ribosomes pour initier la
production de protéine P14. Dans ces conditions, on aura un couplage
réplication/traduction. La protéine P14 ainsi synthétisée pourra ensuite reconnaître une
séquence spécifique dans la région 3' terminale du RNA brin plus génomique et stimuler
ainsi la synthèse de nouveaux brins de RNA de polarité négative. On peut imaginer que,
durant sa synthèse, un site cryptique de la protéine P14 reconnaît une séquence
spécifique du RNA 2. Le masquage de ce site sur la protéine mature pourrait expliquer
pourquoi la protéine P14 apportée en trans reste sans effet sur la réplication du RNA 2.
Après avoir stimulé en cis la synthèse de RNA brin moins, la protéine P14 qui
commence à s'accumuler dans la cellule pourra alors induire en trans la synthèse de la
protéine de coque.
Pour mieux comprendre l'intérêt d'un tel système, il faut se rappeler que la
plupart des virus de plante expriment leur protéine de coque à partir d'un RNA
subgénomique (TMV, AMV, etc...) ou alors par l'intermédiaire d'une polyprotéine
maturée (CPMV, GFLV, etc ...). Ces 2 systèmes permettent une régulation relativement
facile de la production de la CP. Par contre dans le cas du BNYVV, du BSMV, un
hordeivirus ou du TRV, un tobravirus, le cistron codant pour la protéine de coque est
localisé en 5' d'un RNA génomique et sera donc traduit en premier. Si tel est le cas, la
présence de protéine CP dès le début du cycle de réplication devrait favoriser la
59

66. Résultats
______________________________________________________________________
réencapsidation des
60

67. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
A
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Hydrophilicité
(KD)
Probabilité de
surface
B
ATGGGGATGGTAGATAGTTTGTGCGTGTTTGTTGGTCGAGTCATAACTGAGGGATCTGAA
M G M V D S L C V F V G R V I T E G S E
AGTGTTGAGGGTGTGGAAAGGTTTTCCATTAAGTTTAGTGAGTGGAAATTGTTCACCATC
S V E G V E R F S I K F S E W K L F T I
GCGGTGTTTGTTGAATATCGTGAGTTAGGTGAGAAAGAGTGCAGTTTGAAGGATGCTGGT
A V F V E Y R E L G E K E C S L K D A G
AGATTACACTTTAATGTGTCATGTGTGAAATGCTGTCAAAAACTTAAATGCAAGAAACAA
R L H F N V S C V K C C Q K L K C K K Q
AATAAAAATCATAGTAAACACGTCCAAAATGGATATTTACGCAAGGTACGTAATTTTTCC
N K N H S K H V Q N G Y L R K V R N F S
ATTTTAGGTGTTTGCGGTGATTGTTGTGAGTCTTTTACACTCGCGGACGAAAAACCTCAT
I L G V C G D C C E S F T L A D E K P H
GTTATTGTCGATCCTGAGGTGTAA
V I V D P E V *
Figure II-8 : Caractéristiques de la protéine P14 codée par l'ORF VI du RNA 2.
A : Profil d'hydrophilicité selon Kyte & Doolittle (1982) et probabilité de
surface des acides aminés : ces profils ont été obtenus en utilisant le
logiciel de prédiction de structure "plotstructure" de UWGCG.
B : Séquence nucléotidique de l'ORF VI du RNA 2 et structure primaire
de la protéine P14 correspondante.
61

68. Résultats
______________________________________________________________________
A
B
K80
K79
C72 C106
Zn
C69 C109
E118 K119
Figure II-9 : (A) Comparaison de séquence entre l'ORF 6 du RNA 2 du BNYVV et un
certain nombre de papillomavirus (Koonin et al, 1991). HPV 1a, human
papilloma virus type 1a ; BPV2, bovine papillomavirus type 2 ; DPV, deer
papilloma virus ; CRPV, cottontail rabbit papilloma virus. + correspond à des
acides aminés hydrophobes et * désigne des acides aminés du BNYVV
faisant partie de la séquence consensus.
(B) Structure en doigt de zinc hypothétique de la protéine P14 du BNYVV. Les
acides aminés représentés correspondent aux mutants alanines décrits dans le
chapitre II, paragraphe III.
62

69. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
RNA génomiques provenant de l'inoculum et empêcher ainsi la multiplication du virus.
Or, à la lumière des résultats obtenus, le rôle bifonctionnel de la protéine P14
permettrait une régulation temporelle du processus d'infection virale : au début de
l'infection virale, la protéine P14 serait intégralement utilisée pour stimuler la
réplication des RNA viraux ; dans un deuxième temps son accumulation stimulerait la
synthèse de protéine capsidaire et donc l'encapsidation des RNA viraux néosynthétisés.
II-Mise en évidence de l'importance des résidus cystéines 69, 72, 106 et 109 dans
l'activité de la protéine P14.
La protéine P14 est un polypeptide de 126 acides aminés très riche en cystéines
(8 %) et en lysines (10 %) et dont la séquence est présentée figure II-8-B.
Bien que codée par une ORF localisée à l'extrémité 3' du RNA 2, la protéine P14
présente très peu d'homologies avec d'autres protéines riches en cystéines également
exprimées à partir d'ORF localisées en 3' de RNA génomiques d'autres phytovirus
comme le BSMV ou encore le TRV. Par contre, des comparaisons de séquences
(Koonin et al, 1991) (figure II-9) montrent une homologie non négligeable entre cette
protéine P14 et la protéine E6 des papillomavirus, une protéine impliquée dans la
transactivation de la transcription du génome viral grâce à la présence d'une structure en
doigt de zinc (Lamberti et al, 1990).
Avant d'initier une étude fine des acides aminés essentiels à l'activité biologique
de la protéine P14, nous avons effectué des prédictions de structure à l'aide d'un
programme informatique "plotstructure" de UWGCG et les résultats sont décrits figure
II-8-A. L'examen du profil de probabilité des acides aminés d'être en surface de la
protéine P14 (figure II-8-A) révèle l'existence de 2 domaines : ces 2 domaines sont
situés au voisinage des acides aminés 80 et 120, le premier domaine très hydrophile est
encadré de résidus cystéines conservés chez les papillomavirus. Ces observations ainsi
que les résultats déjà obtenus par U. Niesbach-Klösgen (1990) et montrant que la
protéine P14
63

70. Résultats
______________________________________________________________________
A B C
Figure II-10 : Symptômes induits par le mutant RNA 2 (E118-K119) (A), le
mutant RNA 2 (K79-80) (B) et les mutants RNA 2 (C106-109) ou RNA
2 (C69-72) (C) inoculés à des feuilles de C. quinoa.
64

71. Chapitre 2
_____________________________________________________________________
était capable de fixer le zinc, permettent de proposer, pour cette région très hydrophile
comprise entre les acides aminés 69 et 109, l'existence d'une structure en doigt de zinc
qui est représentée figure II-9-B.
1-Construction de mutants alanine (Giesman-Cookmeyer & Lommel, 1993).
Pour vérifier l'importance de certains résidus aminés, nous avons entrepris de
construire des mutants ponctuels dans lesquels ces acides aminés sont remplacés par des
alanines. Ces mutations concernent plus précisément des acides aminés supposés en
surface tels que les lysines 79, 80 et 119 et l'acide glutamique 118 (figure II-8) ou alors
des cystéines (69, 72, 106 et 109) potentiellement impliquées dans une structure en
doigt de zinc. Nous avons ainsi obtenus les mutants pB2(C69-72), pB2(C106-109),
pB2(K79-80) et pB2(E118-K119).
2-Propriétés biologiques des mutants alanine.
Afin de tester l'effet de ces modifications sur la réplication du virus in planta,
nous avons transcrit les différents clones obtenus et nous les avons coinoculés à des
plantes en présence de transcrits correspondant aux RNA 1 et RNA 3. Après une dizaine
de jours d'infection, nous avons observé 3 types de lésions (figure II-10).
(1) Des lésions de type sauvage, chlorotiques et de grande taille pouvant diffuser
le long des nervures avec le mutant pB2(E118-K119). Ces lésions sont tout à fait
semblables à celles observées avec un isolat sauvage.
(2) Des lésions chlorotiques de taille beaucoup plus petite avec le mutant
pB2(K79-80).
(3) Des lésions nécrotiques avec les mutants pB2(C69-72) et pB2(C106-109) ;
ces lésions sont analogues aux lésions obtenues avec les mutants n'exprimant pas la
protéine P14 (figure II-2).
L'analyse des RNA extraits des lésions révèle une diminution de tous les RNA
viraux dans les lésions de type nécrotique (figure II-11-A, piste 4 et 5) et une diminution
65

72. Résultats
______________________________________________________________________
RNA 2 (E118-K119)2 (C106-109)
RNA RNA
RNA 2 (K79-80) 2 (C69-72)
RNA 2
A
RNA 1
RNA 2
RNA 3
B
CP
C
P14
1 2 3 4 5
Figure II-11 : Analyse par hybridation moléculaire des RNA extraits des
lésions locales provoquées par les mutants alanine (A). les quantités de
protéine de capside (B) et de protéine P14 (C) présentes dans ces mêmes
lésions ont été mises en évidence par immunoempreinte.
66