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VIH : Genómica, proteómica y diagnóstico Dr. en C. Erwin Chiquete Medicina Interna Biología Molecular en Medicina [email_address] O.P.D. Hospital Civil de Guadalajara  “Fray Antonio Alcalde”
Objetivos ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Antecedentes En  1980  se publica por vez primera la existencia de un retrovirus humano: el  HTLV . En  1981  los CDC identificaron un grupo de homosexuales con una inusitada presentación clínica de inmunodeficiencia adquirida severa.
En  1983  se describe al VIH, como el agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Pero no es sino hasta  1984  cuando se confirma la relación entre el VIH y el SIDA. A partir de este momento, el panorama global de las enfermedades infecciosas cambia para siempre. Antecedentes
Estudios de sueros con décadas de almacenamiento han revelado que de hecho el primer caso documentado de infección por VIH ocurrió en  1959  en  África  (República Democrática del Congo). Antecedentes
Se estima actualmente que hasta el  40 millones de personas  en el mundo podrían estar actualmente infectadas con el VIH. La prevalencia es altamente variable, según la región estudiada. Importancia
En EUA la prevalencia es de  0.3% , dando cuenta de unos 900,000 individuos actualmente afectados. Importancia
En Latinoamérica, la prevalencia más alta de la infección por VIH se encuentra en los países más pequeños,  Belice ,  Guatemala  y  Honduras , donde  cerca del 1%  o más de los adultos estaban infectados por el VIH a finales de 2003. Importancia
En México se carece de estudios poblacionales amplios, pero estimaciones basadas en datos de bancos de sangre sugieren que la seroprevalencia puede oscilar entre  0.1 y 0.4% , según la región. Importancia
El virus
El VIH pertenece a la familia de los  retrovirus , y al subgrupo de los  lentivirus .  Existen dos principales subespecies: el VIH-1 (más común) y el VIH-2. Estos virus infectan a una gran variedad de especies de mamíferos incluyendo al hombre. El virus
El virus Existe evidencia convincente de que la infección por VIH-1 llegó al humano por el chimpancé ( Pan troglodytes ). El VIH-2 provino de un macaco africano ( Cercocebus atys ).
El virus Dadas las costumbres de alimentación en las regiones del centro y sur de África, la hipótesis más plausible del inicio de esta zoonosis establece que el VIH nació a partir del VIS (o SIV, en inglés), por el consumo de carne de primates inferiores infectados.
El virus La infección por VIS en primates inferiores ya ha llegado al equilibrio (adaptación mutua de las especies). Sin embargo, la infección por VIH en el humano no.
El VIH-1 y el VIH-2 tienen un porcentaje de homología genética que va del 40 al 60%. El ancestro humano más antiguo del VIH-1 se originó a principio de la década de 1930, mientras que el VIH-2 emergió en la de 1940. El virus
El virus HIV-2 SIVsm SIVcpz HIV-1 Década de 1930 Década de 1940
[object Object],[object Object],[object Object],El virus
El virus
El virus: genoma El VIH tiene sólo 9 genes (en carga diploide). Los genes  gag ,  pol  y  env  corresponden a las proteínas funcionales y estructurales. Los genes  tat ,  rev ,  nef ,  vif ,  vpr  y  vpu  (o  vpx , para el VIH-2) corresponden a proteínas funcionales que controlan la habilidad para infectar la célula y producir nuevos viriones.
El virus: genoma A cada lado del genoma del VIH existen regiones denominadas LTR ( Long Terminal Repeats ), que participan en el control de la replicación viral.
VIH y SIDA
Factores de riesgo Usualmente el VIH entra al humano a través de mucosas, donde se encuentra con sus células hospederas (principalmente linfocitos CD4+), para pasar posteriormente a la circulación general. También puede ocurrir que el VIH penetre directamente al torrente sanguíneo.
Factores de riesgo ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Factores de riesgo * Estas tasas correlacionan directamente con la carga viral, es decir, a más carga viral, más probabilidad de ser infectivo. Factor Probabilidad Contacto sexual sin condón 1 / 558 (0.2%) Accidente con punzocortantes 1 / 300 (0.3%) Transmisión perinatal 23%
El ciclo de vida del VIH El VIH tiene como células hospederas a aquellas que porten en su membrana los receptores  CD4  y los receptores de quimiocinas  CXCR4  y  CCR5 . Células como ciertos  linfocitos  (los CD4+, algunos CD8+, algunos NK, etc.),  macrófagos ,  células dendríticas  y algunas  epiteliales  poseen estos receptores, entre otras.
Erwin El ciclo de vida del VIH 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ NH 2 COOH 5’ 3’ 5’ 3’
[object Object],[object Object],[object Object],El ciclo de vida del VIH
Sorprendentemente, el VIH tiene un mayor tropismo por linfocitos T CD4+ activados específicos (sensibilizados contra el VIH), que contra los no activados. Se cree que en unos cuantos días después de la infección la población de linfocitos T CD4+ de las mucosas se agotan importantemente. El ciclo de vida del VIH
En cambio, la población de linfocitos T CD4+ circulantes (menos del 2% del total del cuerpo) se van agotando poco a poco con los años. El VIH se alberga con el tiempo sobretodo en el tejido linfático general, donde origina alteraciones estructurales características. Pero se encuentran nichos en SNC y tracto genito-urinario. El ciclo de vida del VIH
[object Object],[object Object],[object Object],El ciclo de vida del VIH
Con el tiempo, usualmente de 5 a 10 años, la población de linfocitos T CD4+ decrece dramáticamente; momento en que aparecen enfermedades oportunistas que ponen en peligro la vida del paciente. El ciclo de vida del VIH
Con la aparición de la terapia antirretroviral altamente activa ( HAART , por sus siglas en inglés) el curso clínico ha cambiado impresionantemente, con los siguientes beneficios: El ciclo de vida del VIH
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],El ciclo de vida del VIH
Diagnóstico
Diagnóstico Siempre usemos los datos clínicos
Diagnóstico Las técnicas de diagnóstico se desarrollaron poco después de la identificación del VIH como agente causal del SIDA. La detección de la infección se hace usualmente mediante análisis de una muestra de plasma o suero.
Diagnóstico ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Diagnóstico ,[object Object],[object Object],[object Object]
Detección de anticuerpos ,[object Object],[object Object],[object Object]
ELISA La prueba conocida como ELISA es altamente sensible, pero menos específica (falsos positivos pueden llegar al 2%). Con el tiempo se han ido generando pruebas que aumentan su especificidad.
ELISA En realidad en la actualidad el método usado es el EIA (con diversas variantes), que es un método automatizado con partículas en suspensión, no en sustrato sólido, como ocurre en el ELISA. Por tradición, se le sigue conociendo como ELISA.
ELISA / EIA Las técnicas de EIA  se usan únicamente como de escrutinio o tamizaje  (detección de  posibles  casos) y no para confirmar la presencia de infección por VIH. Por lo tanto es necesario el uso de un análisis confirmatorio complementario.
Western blot La  confirmación  de la presencia de  anticuerpos  anti-VIH específicos se hace con la técnica conocida como Western blot (WB). Con el WB se confirma que existen anticuerpos anti-VIH, mas no si el virus está presente en la sangre (viremia).
Western blot El criterio usual para considerar un WB como positivo es el de la presencia de anticuerpos contra el antígeno p24 más anti- gp120/160 ó anti-gp41 más anti- gp120/160. Es decir, presencia de al menos 2 bandas positivas. Los resultados posibles son: positivo, negativo ó indeterminado.
Western blot Un resultado indeterminado (la presencia de anticuerpos contra un solo de los 3 antígenos) obliga a repetición de la prueba en 3 a 4 meses.
Western blot Usando ELISA ó EIA más WB, la frecuencia de falsos positivos en poblaciones de alta prevalencia es de alrededor de 0.3%. En poblaciones de baja prevalencia es de 0.001%.
Western blot Con las nuevas técnicas de ELISA/EIA y WB el periodo de ventana se ha reducido a 2 ó 3 semanas.
Detección del ARN Las técnicas de detección del ARN del VIH se consideran confirmatorias de la presencia de viremia. Estas técnicas pueden ser  cualitativas  o  cuantitativas .
Detección del ARN Las técnicas  cualitativas  arrojan resultados de positividad o negatividad y  son más sensibles . El límite más bajo de detección de estas pruebas puede llegar a ser de 50 UI por mL de suero. Existen ensayos manuales (caseros) o automatizados.
Detección del ARN ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Detección del ARN La técnica más usada en México es la basada en RT-PCR. La RT-PCR puede ser  cualitativa  o  cuantitativa .
La RT-PCR  cuantitativa  nos da información sobre la  carga viral , es decir, nos arroja un resultado numérico (número de copias por mL). Sin embargo, esta técnica es  menos sensible  que la cualitativa (el límite inferior es en general de 500 copias por mL), por lo que  no debe ser usada para confirmar  la infección por VIH. Detección del ARN
Detección del ARN La determinación de la carga viral (RT-PCR cuantitativa) puede expresar si el virus está presente en la sangre (pues da un valor numérico), pero  no nos informa si el virus  no  está presente . Por eso no debe ser usada para diagnosticar una infección.
Detección del ARN La determinación de la carga viral  se usa para valorar la respuesta  al tratamiento durante y después del mismo, tomando una determinación de la carga viral basal (antes de iniciarlo). También orienta respecto al estado clínico del paciente y la probabilidad de ser infectivo.
¿Cómo se hace el diagnóstico de la infección por VIH?
Diagnóstico ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Algoritmo de diagnóstico Positivo (2 ocasiones) Negativo Nada WB Positivo PCR y carga viral Seguimiento y vigilancia (repetir a los 3-4 meses) Negativo Determinación de anti-VIH por ELISA / EIA (serología) Nada Indeterminado
Diagnóstico Siempre usemos los datos clínicos
Conclusiones ,[object Object],[object Object],[object Object]
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  • 1. VIH : Genómica, proteómica y diagnóstico Dr. en C. Erwin Chiquete Medicina Interna Biología Molecular en Medicina [email_address] O.P.D. Hospital Civil de Guadalajara “Fray Antonio Alcalde”
  • 2.
  • 3. Antecedentes En 1980 se publica por vez primera la existencia de un retrovirus humano: el HTLV . En 1981 los CDC identificaron un grupo de homosexuales con una inusitada presentación clínica de inmunodeficiencia adquirida severa.
  • 4. En 1983 se describe al VIH, como el agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Pero no es sino hasta 1984 cuando se confirma la relación entre el VIH y el SIDA. A partir de este momento, el panorama global de las enfermedades infecciosas cambia para siempre. Antecedentes
  • 5. Estudios de sueros con décadas de almacenamiento han revelado que de hecho el primer caso documentado de infección por VIH ocurrió en 1959 en África (República Democrática del Congo). Antecedentes
  • 6. Se estima actualmente que hasta el 40 millones de personas en el mundo podrían estar actualmente infectadas con el VIH. La prevalencia es altamente variable, según la región estudiada. Importancia
  • 7. En EUA la prevalencia es de 0.3% , dando cuenta de unos 900,000 individuos actualmente afectados. Importancia
  • 8. En Latinoamérica, la prevalencia más alta de la infección por VIH se encuentra en los países más pequeños, Belice , Guatemala y Honduras , donde cerca del 1% o más de los adultos estaban infectados por el VIH a finales de 2003. Importancia
  • 9. En México se carece de estudios poblacionales amplios, pero estimaciones basadas en datos de bancos de sangre sugieren que la seroprevalencia puede oscilar entre 0.1 y 0.4% , según la región. Importancia
  • 11. El VIH pertenece a la familia de los retrovirus , y al subgrupo de los lentivirus . Existen dos principales subespecies: el VIH-1 (más común) y el VIH-2. Estos virus infectan a una gran variedad de especies de mamíferos incluyendo al hombre. El virus
  • 12. El virus Existe evidencia convincente de que la infección por VIH-1 llegó al humano por el chimpancé ( Pan troglodytes ). El VIH-2 provino de un macaco africano ( Cercocebus atys ).
  • 13. El virus Dadas las costumbres de alimentación en las regiones del centro y sur de África, la hipótesis más plausible del inicio de esta zoonosis establece que el VIH nació a partir del VIS (o SIV, en inglés), por el consumo de carne de primates inferiores infectados.
  • 14. El virus La infección por VIS en primates inferiores ya ha llegado al equilibrio (adaptación mutua de las especies). Sin embargo, la infección por VIH en el humano no.
  • 15. El VIH-1 y el VIH-2 tienen un porcentaje de homología genética que va del 40 al 60%. El ancestro humano más antiguo del VIH-1 se originó a principio de la década de 1930, mientras que el VIH-2 emergió en la de 1940. El virus
  • 16. El virus HIV-2 SIVsm SIVcpz HIV-1 Década de 1930 Década de 1940
  • 17.
  • 19. El virus: genoma El VIH tiene sólo 9 genes (en carga diploide). Los genes gag , pol y env corresponden a las proteínas funcionales y estructurales. Los genes tat , rev , nef , vif , vpr y vpu (o vpx , para el VIH-2) corresponden a proteínas funcionales que controlan la habilidad para infectar la célula y producir nuevos viriones.
  • 20. El virus: genoma A cada lado del genoma del VIH existen regiones denominadas LTR ( Long Terminal Repeats ), que participan en el control de la replicación viral.
  • 22. Factores de riesgo Usualmente el VIH entra al humano a través de mucosas, donde se encuentra con sus células hospederas (principalmente linfocitos CD4+), para pasar posteriormente a la circulación general. También puede ocurrir que el VIH penetre directamente al torrente sanguíneo.
  • 23.
  • 24. Factores de riesgo * Estas tasas correlacionan directamente con la carga viral, es decir, a más carga viral, más probabilidad de ser infectivo. Factor Probabilidad Contacto sexual sin condón 1 / 558 (0.2%) Accidente con punzocortantes 1 / 300 (0.3%) Transmisión perinatal 23%
  • 25. El ciclo de vida del VIH El VIH tiene como células hospederas a aquellas que porten en su membrana los receptores CD4 y los receptores de quimiocinas CXCR4 y CCR5 . Células como ciertos linfocitos (los CD4+, algunos CD8+, algunos NK, etc.), macrófagos , células dendríticas y algunas epiteliales poseen estos receptores, entre otras.
  • 26. Erwin El ciclo de vida del VIH 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ NH 2 COOH 5’ 3’ 5’ 3’
  • 27.
  • 28. Sorprendentemente, el VIH tiene un mayor tropismo por linfocitos T CD4+ activados específicos (sensibilizados contra el VIH), que contra los no activados. Se cree que en unos cuantos días después de la infección la población de linfocitos T CD4+ de las mucosas se agotan importantemente. El ciclo de vida del VIH
  • 29. En cambio, la población de linfocitos T CD4+ circulantes (menos del 2% del total del cuerpo) se van agotando poco a poco con los años. El VIH se alberga con el tiempo sobretodo en el tejido linfático general, donde origina alteraciones estructurales características. Pero se encuentran nichos en SNC y tracto genito-urinario. El ciclo de vida del VIH
  • 30.
  • 31. Con el tiempo, usualmente de 5 a 10 años, la población de linfocitos T CD4+ decrece dramáticamente; momento en que aparecen enfermedades oportunistas que ponen en peligro la vida del paciente. El ciclo de vida del VIH
  • 32. Con la aparición de la terapia antirretroviral altamente activa ( HAART , por sus siglas en inglés) el curso clínico ha cambiado impresionantemente, con los siguientes beneficios: El ciclo de vida del VIH
  • 33.
  • 35. Diagnóstico Siempre usemos los datos clínicos
  • 36. Diagnóstico Las técnicas de diagnóstico se desarrollaron poco después de la identificación del VIH como agente causal del SIDA. La detección de la infección se hace usualmente mediante análisis de una muestra de plasma o suero.
  • 37.
  • 38.
  • 39.
  • 40. ELISA La prueba conocida como ELISA es altamente sensible, pero menos específica (falsos positivos pueden llegar al 2%). Con el tiempo se han ido generando pruebas que aumentan su especificidad.
  • 41. ELISA En realidad en la actualidad el método usado es el EIA (con diversas variantes), que es un método automatizado con partículas en suspensión, no en sustrato sólido, como ocurre en el ELISA. Por tradición, se le sigue conociendo como ELISA.
  • 42. ELISA / EIA Las técnicas de EIA se usan únicamente como de escrutinio o tamizaje (detección de posibles casos) y no para confirmar la presencia de infección por VIH. Por lo tanto es necesario el uso de un análisis confirmatorio complementario.
  • 43. Western blot La confirmación de la presencia de anticuerpos anti-VIH específicos se hace con la técnica conocida como Western blot (WB). Con el WB se confirma que existen anticuerpos anti-VIH, mas no si el virus está presente en la sangre (viremia).
  • 44. Western blot El criterio usual para considerar un WB como positivo es el de la presencia de anticuerpos contra el antígeno p24 más anti- gp120/160 ó anti-gp41 más anti- gp120/160. Es decir, presencia de al menos 2 bandas positivas. Los resultados posibles son: positivo, negativo ó indeterminado.
  • 45. Western blot Un resultado indeterminado (la presencia de anticuerpos contra un solo de los 3 antígenos) obliga a repetición de la prueba en 3 a 4 meses.
  • 46. Western blot Usando ELISA ó EIA más WB, la frecuencia de falsos positivos en poblaciones de alta prevalencia es de alrededor de 0.3%. En poblaciones de baja prevalencia es de 0.001%.
  • 47. Western blot Con las nuevas técnicas de ELISA/EIA y WB el periodo de ventana se ha reducido a 2 ó 3 semanas.
  • 48. Detección del ARN Las técnicas de detección del ARN del VIH se consideran confirmatorias de la presencia de viremia. Estas técnicas pueden ser cualitativas o cuantitativas .
  • 49. Detección del ARN Las técnicas cualitativas arrojan resultados de positividad o negatividad y son más sensibles . El límite más bajo de detección de estas pruebas puede llegar a ser de 50 UI por mL de suero. Existen ensayos manuales (caseros) o automatizados.
  • 50.
  • 51. Detección del ARN La técnica más usada en México es la basada en RT-PCR. La RT-PCR puede ser cualitativa o cuantitativa .
  • 52. La RT-PCR cuantitativa nos da información sobre la carga viral , es decir, nos arroja un resultado numérico (número de copias por mL). Sin embargo, esta técnica es menos sensible que la cualitativa (el límite inferior es en general de 500 copias por mL), por lo que no debe ser usada para confirmar la infección por VIH. Detección del ARN
  • 53. Detección del ARN La determinación de la carga viral (RT-PCR cuantitativa) puede expresar si el virus está presente en la sangre (pues da un valor numérico), pero no nos informa si el virus no está presente . Por eso no debe ser usada para diagnosticar una infección.
  • 54. Detección del ARN La determinación de la carga viral se usa para valorar la respuesta al tratamiento durante y después del mismo, tomando una determinación de la carga viral basal (antes de iniciarlo). También orienta respecto al estado clínico del paciente y la probabilidad de ser infectivo.
  • 55. ¿Cómo se hace el diagnóstico de la infección por VIH?
  • 56.
  • 57. Algoritmo de diagnóstico Positivo (2 ocasiones) Negativo Nada WB Positivo PCR y carga viral Seguimiento y vigilancia (repetir a los 3-4 meses) Negativo Determinación de anti-VIH por ELISA / EIA (serología) Nada Indeterminado
  • 58. Diagnóstico Siempre usemos los datos clínicos
  • 59.