1. Molecular Biology Seminary
Maria Alejandra López Lopera
Érika Marcela Martínez Pardo
Medicine students
3° semester
U.P.B

2. A Novel PTEN/Mutant p53/
c-Myc/Bcl-XL Axis Mediates
Context-Dependent Oncogenic
Effects of PTEN with
Implications for Cancer
Prognosis and Therapy
Xiaoping Huang, Ying Zhang,
Yaqiong Tang, Napoleon Butler,
Jungeun Kim, Fadila Guessous,
David Schiff, James Mandell
and Roger Abounader.

3. INTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTIONINTRODUCTION

4. INTRODUCTIONINTRODUCTION
Gene mutationGene mutation
Altered protein expressionAltered protein expression
Disturbances in the cell
division
Disturbances in the cell
division
Reduction of
apoptosis
Reduction of
apoptosis
CANCERCANCER

5. INTRODUCTIONINTRODUCTION
GENES RESPONSIBLE FOR
CANCER
GENES RESPONSIBLE FOR
CANCER

6. INTRODUCTIONINTRODUCTION
Oncogenic effects
on glioblastoma
cells
Oncogenic effects
on glioblastoma
cells
p53 MUTATIONp53 MUTATION
PTEN
(Phosphatase and tensin homolog)
PTEN
(Phosphatase and tensin homolog)

7. INTRODUCTIONINTRODUCTION
p53p53 Tumor suppresorTumor suppresor
Stop the cell
cycle in the G1/S
checkpoint
Stop the cell
cycle in the G1/S
checkpoint
ApoptosisApoptosis

8. INTRODUCTIONINTRODUCTION

9. INTRODUCTIONINTRODUCTION

10. INTRODUCTIONINTRODUCTION

11. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS

12. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
CélulasCélulas
Células
glioblastomas
Células
glioblastomas
U373
SNB19
U87
LNZ308
293T
GBM6
Muestras de tumoresMuestras de tumores
Pacientes con glioblastomasPacientes con glioblastomas
Infectadas con p53

13. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Silenciamiento de gen
con lentivirus shRNA
Silenciamiento de gen
con lentivirus shRNA
LentivirusLentivirus
Virus con periodos
de incubación
muy altos.
Permiten el paso de ARN a ADN
integrándolo al genoma
huésped y replicándolo junto
con él.
shRNAshRNA
Horquilla corta de RNA
Inhibición estable
o transitoria del
gen diana

14. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Plásmido
Células 293T
FuGene6
Selección
con
puromicina
Traducción

15. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Adenovirus e infecciónAdenovirus e infección
AdenovirusAdenovirus
Virus que tienen
ADN como material
genético.
Se utilizan como
vehículos para
administrar genes
en el tratamiento
del cáncer
Adenovirus mut-p53 (R273H)Adenovirus mut-p53 (R273H)
MOI:10
Verificación de la expresión de
PTEN y mut-p53
Verificación de la expresión de
PTEN y mut-p53
Análisis con
inmunoblot

16. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Análisis inmunoblotAnálisis inmunoblot
Primer paso
Separación de proteínas mediante
electroforesis en gel
Segundo paso
Transferencia de proteínas a una
membrana adsorbente.
Tercer paso
Detección de la unión antígeno
anticuerpo con fluorescencia.

17. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Ensayo de proliferación celularEnsayo de proliferación celular
Con MTSCon MTS
Complejo de sal de tetrazolio, ensayo
colorimétrico, medición actividad enzimática
Cálculo de célulasCálculo de células
Con CellTiter96 AQ, kit de
proliferación celular
Hemocitómetro

18. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Ensayo de apoptosisEnsayo de apoptosis
Medición citoplasmática de
histona asociada
a fragmentos del ADN
Kit Elisa
Degradación de
internucleosomas
Detección de histonas
por anticuerpos
acoplados a enzimas
Liberación al medio de
nucleosomas por células
en apoptosis.

19. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Ensayo de invasión celularEnsayo de invasión celular
células puestas en
cámara superior con
recubierta de
membrana de colágeno
IV.
10 porciento de FBS fue
colocado en cámara
baja Incubación
toda la noche.
Células que migraron a
la parte inferior fijadas
teñidas y contadas bajo
un microscopio.

20. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Colágeno tipo
IV
Componente de la
membrana basal
Afectada en carcinomas
invasivos
Primer paso de la
invasión tumoral
Primer paso de la
invasión tumoral
Pérdida de la
membrana
basal
• Descenso de la síntesis
• Ensamblaje disminuido
de la componente.
• Aumentos de la
destrucción por
proteasas producidas
por el tumor.
Marcador
sello de la
invasión

21. Clones de la células fijados y teñidos
MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Ensayo de formación de coloniasEnsayo de formación de colonias
Sembrado de células en
10% FBS
Tres semanasTres semanas
Sln 0.5% violeta
cristal y 25% de
metanol

22. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Análisis inmunoblotAnálisis inmunoblot
Lisis celular
Determinación de la
concentración de proteínas
por el reactivo de ensayo
Coomassie Plus
Análisis inmunoblot
Manchas
seleccionadas
sometidas a
densitometría

23. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Precipitación inmunológicaPrecipitación inmunológica
Células lisadas fueron
encubadas con anticuerpo
primario seguido de
incubación con Proteína A
agarosa.
Sometidas a altas
temperaturas con tampón de
sodio duodecil sulfato
Transferencia a
nitrocelulosa
Incubación con anticuerpo
secundario HRP
Señales detectadas con
quimioluminiscencia

24. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
InmunodepresiónInmunodepresión
(Para remover molécula de una muestra)
Inmunodepresión de
proteínas con anticuerpos
anti-p53/anti-NFYA
Inmunoprecipitación de
sobrenadantes con
anticuerpo anti-
NFYA/anti-p53.
Análisis de inmunoblot con
anticuerpo anti-CBP.

25. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Detección de complejo de proteínas con
análisis Native PAGE
Detección de complejo de proteínas con
análisis Native PAGE
Células U373 infectadas con adenovirus
PTEN codificado (ad-PTEN).
2-3 días
2-3 días
Células lisadas preparadas en
una muestra tampón sin SDS
Puestas en PAGE en tampón
Tris-glicina sin SDS.
Transferencia de proteínas del PAGE
a membranas nitrocelulosa con
anticuerpo primario.
Análisis Western
blot

26. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
IP cromatinaIP cromatina
Lisis del complejo DNA/proteína y puesto
en vórtex para liberación de DNA
Corte de ADN a 37°C con mezcla de
enzimas provistas por un kit
Centrifugación de lisados
Complejo proteína-DNA recogido con
granos de proteína A o G agarosa y
entrecruzado por calentamiento a 65°C.
Una nocheUna noche
Purificación de
DNA con kit
QIAQuick
Análisis de reacción en cadena
de polimerasa con primers
específicos para la región
promotora de c-Myc

27. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Inmunohistoquimica e inmunofluorescenciaInmunohistoquimica e inmunofluorescencia
(Determina los niveles de PTEN en tejidos humanos)
Localización de mut-p53, CBP o NFYA
determinado por inmunofluorescencia.
Incubación de células
con anticuerpos relevantes.
Incubación con isotiocianato de fluoresceína
o anticuerpos secundarios conjugados.

28. MATERIALES YMATERIALES Y
MÉTODOSMÉTODOS
Secuencia de exones p53Secuencia de exones p53
Análisis de las mutaciones de p53 mediante secuencia de DNA
Extracción de ADN
Amplificación de los exones de p53 por reacción en cadena de
polimerasa.
Identificación y comparación de las secuencias resultantes con
las secuencias en wt-p53

29. RESULTADORESULTADO
SS
RESULTADORESULTADO
SS

30. Crecimiento
Invasión
Crecimiento
Invasión
R273HU373 SNB19
ApoptosisApoptosis
MEDIACION DE PTEN PORMEDIACION DE PTEN POR
mutP53mutP53
MEDIACION DE PTEN PORMEDIACION DE PTEN POR
mutP53mutP53
mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN:mut-P53 y adPTEN: Sh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-mutP53 y adPTENSh-RNASh-RNA
INVERSO

34. Mut-P53 regulaMut-P53 regula
los efectoslos efectos
oncogénicos deoncogénicos de
PTENPTEN
Mut-P53 regulaMut-P53 regula
los efectoslos efectos
oncogénicos deoncogénicos de
PTENPTEN
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

35. SNB19
U373
Ad-PTENAd-PTEN
INFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XLINFLUENCIA DE PTEN EN C-Myc y Bcl-XL
INVERSOINVERSO

36. ad-PTEN
Mut-P53Mut-P53
ad-PTEN
Sh-mutP53Sh-mutP53
ad-PTEN
Mut-P53Mut-P53
ad-PTEN
Sh-mutP53Sh-mutP53
INFLUENCIA DE mut-P53 ENINFLUENCIA DE mut-P53 EN
EFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTENEFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTEN
INFLUENCIA DE mut-P53 ENINFLUENCIA DE mut-P53 EN
EFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTENEFECTOS ONCOGÉNICOS DEL PTEN

37. INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOSINFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS
ONCOGÉNICOS DE PTENONCOGÉNICOS DE PTEN
INFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOSINFLUENCIA DE C-Myc SOBRE EFECTOS
ONCOGÉNICOS DE PTENONCOGÉNICOS DE PTEN
Ad-PTEN
Ad-cMycAd-cMycAd-cMycAd-cMyc
Sh-cMycSh-cMycSh-cMycSh-cMyc
Crecimiento
Invasión
Crecimiento
Invasión
ApoptosisApoptosis
Ad-PTEN
INVERSOINVERSO

38. RESULTADOSRESULTADOS

39. CONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
C-Myc mediaC-Myc media
parcialmente losparcialmente los
efectosefectos
oncogénicos deoncogénicos de
PTENPTEN
C-Myc mediaC-Myc media
parcialmente losparcialmente los
efectosefectos
oncogénicos deoncogénicos de
PTENPTEN

40. INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTOINFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO
ONCOGÉNICO DE PTENONCOGÉNICO DE PTEN
INFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTOINFLUENCIA DE Bcl-XL EN EL EFECTO
ONCOGÉNICO DE PTENONCOGÉNICO DE PTEN
PTEN
Ad-Bcl XLAd-Bcl XLAd-Bcl XLAd-Bcl XL
Sh-Bcl XLSh-Bcl XLSh-Bcl XLSh-Bcl XL
INVERSOINVERSO
ApoptosisApoptosis

42. Bcl-XL influyeBcl-XL influye
parcialmente enparcialmente en
los efectoslos efectos
oncogénicos deoncogénicos de
PTENPTEN
Bcl-XL influyeBcl-XL influye
parcialmente enparcialmente en
los efectoslos efectos
oncogénicos deoncogénicos de
PTENPTEN

43. C: Muestras de
control
E: Muestras
experimentales
FACTORES DE
TRANSCRIPCIÓN

44. SI HAYSI HAY
COMPLEJOCOMPLEJO
mut-mut-
P53/CBP/NFYAP53/CBP/NFYA
SI HAYSI HAY
COMPLEJOCOMPLEJO
mut-mut-
P53/CBP/NFYAP53/CBP/NFYA

45. INFLUENCIA DE PTEN EN ELINFLUENCIA DE PTEN EN EL
COMPLEJO mut-P53/CBP/NFYACOMPLEJO mut-P53/CBP/NFYA
INFLUENCIA DE PTEN EN ELINFLUENCIA DE PTEN EN EL
COMPLEJO mut-P53/CBP/NFYACOMPLEJO mut-P53/CBP/NFYA
Ad-PTENAd-PTENAd-PTENAd-PTEN Mut-P53/CBP/NFYA

46. RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DERELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE
PACIENTES CON GLIOBLASTOMA PORPACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR
mut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTENmut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTEN
RELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DERELACIÓN ENTRE LA SUPERVIVIENCIA DE
PACIENTES CON GLIOBLASTOMA PORPACIENTES CON GLIOBLASTOMA POR
mut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTENmut-P53 Y LA PRESENCIA DE PTEN
PTENPTEN
SUPERVIVENCIASUPERVIVENCIA
GLIOBLASTOMA
CON mut-P53

47. REACTIVACIÓN
DE P53PRIMA1PRIMA1PRIMA1PRIMA1
P21P21: GEN
Mdm2:Mdm2:
PROTEINA
TERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCERTERAPIA FUTURA CONTRA CÁNCER
FASE G1
REGULADO
POR P53
ESTRES
GEN
REGULADO
POR P53

48. INFLUENCIA DEL PTEN ENINFLUENCIA DEL PTEN EN
ACCIÓN DE PRIMA1ACCIÓN DE PRIMA1
INFLUENCIA DEL PTEN ENINFLUENCIA DEL PTEN EN
ACCIÓN DE PRIMA1ACCIÓN DE PRIMA1
PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1PTEN + PRIMA1 SÍ TIENEN VALOR TERAPÉUTICO

49. DISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSIONDISCUSSION

50. PERSONAPERSONA IDEAIDEA SISI NONO
Jiang Z.
Zheng X.
Rich KM.
Inhibition of Bcl-XL induces
apoptosis of glioblastoma cells
Meyer N.
Penn LZ.
Dang CV.
Nilsson JA.
Cleveland JL.
c-Myc is a key regulator of cellular
outcomes in normal cells, and its
dysregulation is associated with
cancer progression
Brosh R
Rotter V
A previous study found that gain-
of-function mut-p53 increased the
expression of c-Myc in cancer cells
Ghosh AK.
Grigorieva I.
Steele R.
Hoover RG.
Ray RB.
Although PTEN was reported to
inhibit expression of c-Myc in
tumor cells

51. CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES

52.  Cells have components that monitor its cycle and prevent the
spread of possible damage and mutations to daughter cells,
however these components may be affected and this makes
that its function is reversed, causing possible serious diseases.
 Electrophoresis techniques are very important in this type of
study because they allow us to safely show results

53. Inhiben

55. GRACIAS!!GRACIAS!!GRACIAS!!GRACIAS!!