4. EXTRACCION DE ADN
ORGANICA
CHELEX
PAPEL FTA
OTRAS
Extracciones basadas en estuches
QIAamp, GeneClean, etc.
Pueden depender en
Protocolos de LAB
Tipo de muestra
5. Preparación de Muestra
Extracción de ADN Orgánica
Extracción por Chelex
Extracción de ADN utilizando papel
FTA
Estuches QIAamp para separar ADN
Equipo basados en robótica pueden
requerir otros métodos
6. EXTRACCION ORGANICA DE ADN
PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL
ALCOHOL (PCI)
PRODUCE ADN DE ALTO PESO
MOLECULAR
CONSUME MUCHO TIEMPO
QUIMICOS PELIGROSOS
MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles
errores)
7. EXTRACCION ORGANICA DE
ADN
COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO
AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K
ROMPE LAS CELULAS (SDS)
ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)
AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y
lípidos
Particiona macromoléculas basedo en propiedades
hidrofóbicas e hidrofílicas
Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol
Alcohol Isoamyl disminuye la espuma
ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA
RECUPERACION DE ADN
Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto
8. EXTRACCION POR CHELEX
1991 Laboratorios Bio-Rad
RESINA QUELANTE
REMUEVE MAGNESIO
(INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)
ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA
CELULA
UTILIZE SOLO CON PCR (cadena
sencilla)
9. EXTRACCION POR CHELEX
AÑADA MUESTRA AL TUBO
AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE
CHELEX
100°C PARA ROMPER CELULAS
DESTRUIR PROTEINAS
ADN ES DENATURADO A CADENAS
SENCILLAS
UTILIZE SOBRENADANTE
DIRECTAMENTE EN PCR
10. EXTRACCION CON PAPEL
FTA™
PAPEL ALMACENAJE A BASE DE
CELULOSA
CONTIENE QUIMICOS
PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E
INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO
ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS
UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O
SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS
11. Tecnología FTA®
Rompe cé lulas y membranas
de organelos
-Físicamente Atrapa Acidos
Nucleicos (ADN & ARN)
Preserva y Proteje Acidos
Nucleicos
-Previene Daño por radicales libres/UV
-Previene Daño Enzimático
-Inhibe crecimiento de hongos y
bacterias
Provee Seguridad al Usuario
-Inactiva Potenciales Viruses
Peligrosos
13. FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva
10 Platos = 240 muestras
Temp de almacenaje = -200
C
240 Tarjetas = 240 muestras
Temp de almacenaje = Temp
ambiente
Costo
$2,000/congelador/año
Costo
$75/gabinete de
archivo
240 Tubos = 240 muestras*
Temp de almacenaje= -200
C
Convencional versus FTA
14. Archivado a Temperatura
Ambiente
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
6 Blue Blood-B-Pro
1000
2000
3000
4000
6 Green Blood-B-Pro
500
1000
1500
6 Yellow Blood-B-Pro
500
1000
1500
2000
6 Red Blood-B-Pro
200
400
600
Perfil de STR de
sangre archivada en
1989 y analizada en
2003
• Muestras archivadas en
ambientes diferentes,
selladas en sobre de
aluminio
• Proceso normal de
colección de muestra
• 10 µL de reacciones de
Profiler™ añadido a
muestras, 24 ciclos
15. EXTRACCIÓN DE PAPEL
FTA™
Sangre o saliva seca en papel FTA
Células se ROMPEN al contacto
UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA
al TUBO
LAVE para remover HEME y otros
inhibidores de PCR
Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción
de PCR
16. EXTRACCIÓN DE PAPEL
FTA™
CUANTIFICACIÓN NO es necesaria
Cantidad de muestra consistente
Resultados consistentes
Posible AUTOMATIZACIÓN
18. CUANTIFICACIÓN DE ADN
ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR
MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE
ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS
DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA
MÉTODOS INICIALES NO MUY
SENSITIVOS O ESPECÍFICOS
ABSORBENCIA A 260 nm
TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO
Cuantificación comparada a marcador estándar
19. Cuantificación por "Slot Blot"
Procedimiento Común
Específico para primates
Ha sido modificado para utilizar
quimioluminiscencia en vez de radioactivida
Puede detectar cantidades menores que
nanogramos
Puede detectar ADN de cadena doble y
cadena sencilla
20. CUANTIFICACIÓN DE ADN
CUANTIFICACIÓN POR "SLOT
BLOT"
ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE
PRIMATE
D17Z1
RADIOACTIVO
COLORIMÉTRICO
QUIMIOLUMINISCENTE
21. CUANTIFICACIÓN DE ADN
CAPTURAR ADN GENÓMICO EN
MEMBRANA DE NILÓN
AÑADIR PRUEBA D17Z1
INTENSIDAD DE LA MUESTRA
COMPARADA A ESTÁNDARES
SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50
copias de ADN genómico
22. Slot Blot
Ventajas Desventajas
Puede ser sensitivo
Reemplaza
radioactividad
Puede detectar
cadenas sencillas y
ADN parcialmente
degradado.
Cantidad dada es
sólo de ADN
humano
Consume tiempo
Labor intensiva
25. Fluorometría
*Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o
PicoGreen
-- aumento en emisión a 458 nm cuando
enlazado a ADN de doble cadena
*Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla
o ARN
--se enlaza al surco menor, rico en A-T
*Muestra es comparada a curva estándar de ADN
cuya concentración es conocida
--utilize estándar con composición similar
para lecturas más precisas
26. Cuantificación de ADN por
espectrofotometría
Concentración de ADN puede ser determinada
midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un
espectrofotómetro utilizando una cubeta de
cuarzo
Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0.
Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a
50 µg de ADN por ml
A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml
27. Pureza de ADN: Proporción A260/A280
*Proporción indica pureza/presencia de
contaminantes que pueden absorber luz UV
(proteínas, etc.)
*ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0
--en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5
*Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN)
--imita alta pureza y producción
--aumenta el valor A260
Plates*Assumes Original Sample + 3 daughter samples
Figure 3.1 Schematic of commonly used DNA extraction processes.
Figure 3.3 Illustration of a human DNA quantitation result with the slot blot procedure. A serial dilution of a human DNA standard is run on either side of the slot blot membrane for comparison purposes. The quantity of each of the unknown samples is estimated by visual comparison to the calibration standards. For example, the sample indicated by the arrow is closest in appearance to the 2.5 ng standard.