Aislamiento de Salmonella Tomado de: Gaviria, Blanca C., Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos, 1997, Bogotá, Colombia, Carrera de Bacteriología PUJ.

1. PRÁCTICA 10: AISLAMIENTO DE SALMONELLA
Epidemiológicamente unos pocos serotipos de Salmonella tienen huésped específico siendo la
mayoría inespecíficos, en cuanto a especie animal que potencialmente pueden afectar. Las fuentes
de contaminación son muy amplias y las especificaciones en Microbiología de Alimentos exigen
ausencia de cualquier serotipo de Salmonella en 25 o 50 g de muestra.
El aislamiento de Salmonella a partir de alimentos se hace difícil por dos factores:
La población de Salmonella frente a la flora competitiva es muy baja y porque muchos alimentos
han sido sometidos a procesos que destruyen parte de la flora microbiana, quedando los que
sobreviven muy debilitados.
La metodología para el aislamiento e identificación de Salmonella comprende 5 pasos:
Preenriquecimiento en medio no selectivo
Enriquecimiento selectivo
Siembra en medios selectivos
Pruebas bioquímicas
Pruebas serológicas
Materiales
þ Recipiente estériles, boca ancha, de 500 ml con 225 ml de Caldo BHI o Caldo Tripticase Soya
þ Incubadora a 35°C  1 °C
þ Baño de agua a 45°C
þ Pipetas estériles de 1 ml
þ Asa bacteriológica
þ Tubos serológicos 10 x 75 mm
þ Portaobjetos
þ Tubos con 10 ml de Caldo Tetrationato o Caldo Rappaport
þ Tubos con 10 ml de Caldo Selenite Cistina
þ Cajas con Agar Bilis Verde Brillante
þ Cajas con Agar Bismuto Sulfito
þ Cajas con Agar Hektoen
þ Cajas con Agar XLD
þ Tubos con Agar Hierro tres azúcares
þ Tubos con Agar Lisina hierro
þ Tubos con Caldo o Agar Urea
þ Solución salina fisiológica
þ Agar Tripticase Soya inclinado
þ Antisuero polivalente
Procedimiento
Pre enriquecimiento no selectivo:
 Pesar asépticamente 25 g ó ml de la muestra
 Agregar la muestra a 225 ml de Caldo Cerebro Corazón en un recipiente de 500 mL
 Incubar a 35 - 37°C durante 2 - 6 horas

2. Enriquecimiento:
 A partir del medio de enriquecimiento
 Pipetear 1 mL y sembrar en Caldo Selenite Cistina (incubar a 35°C por 24 h)
 Pipetear 1 mL y sembrar en Caldo Tetrationato (blanco lechoso) o Caldo Rappaport (incubar
a 43°C por 24 h)
3. Siembra en Medios Selectivos:
De cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo sembrar con asa en:
 Agar Bismuto Sulfito
 Agar Bilis Verde Brillante
 Agar Hektoen o Agar XLD
 Incubar las cajas a 35°C por 24 horas. Si en Agar Bismuto Sulfito no aparecen colonias
sospechosas, reincubar por 24 horas más
Interpretación de las colonias:
Agar Bismuto Sulfito
Colonias Microorganismos
Centro negro, precipitado negro y con Salmonella (Excepto S. paratyphi y
con brillo metálico S. pullorum)
Pequeñas con color verde a pardo Coliformes, Proteus
(Solo presentes ocasionalmente)
Agar XLD
Colonias Microorganismos
Amarillas, opacas halo de precipitado E. coli, Enterobacter, Aeromonas
Amarillas, mucosas, halo de precipitado Klebsiella
Amarillas opacas, a veces con centro negro Citrobacter
Amarillas con halo amarillo Serratia, Hafnia
Amarillas, transparentes con centro negro Proteus
Rojizas a veces con centro negro Salmonella
Anaranjadas opacas Salmonella typhi
Rojizas transparentes Shigella, Providencia

3. Agar Hektoen
Colonias Microorganismos
Verde húmeda, plana transparente Shigella, Providencia
Azul verdosa con centro negro Salmonella
Azul verdosa sin centro negro Proteus
Azulada plana borde irregular Pseudomonas
Color salmón, con halo de precipitación Coliformes
Agar Bilis Verde Brillante
Colonias Microorganismos
Rojas con halo rojo Salmonella
Proteus
Amarillas con halo amarillo E. coli, Enterobacter, Citrobacter,
Klebsiella
Pruebas Bioquímicas:
 Seleccionar 2 o más colonias sospechosas de cada uno de los medios selectivos
 Inocular cada colonia en tubos con Agar hierro tres azúcares y Agar Lisina hierro y Agar Urea,
en el fondo y en la superficie. Después de sembrar el primer tubo inocular el segundo sin
flamear el asa
 Incubar los tubos de 35°C durante 24 horas.
Los cultivos sospechosos de en Agar hierro tres azúcares muestran el fondo amarillo
(formación de ácido) y la superficie inclinada rojo. Con o sin producción de H2S
(ennegrecimiento del medio).
En Agar Lisina hierro muestran una reacción alcalina (púrpura) del medio resultante
de la descarboxilación de la lisina con o sin H2S.
En Agar Urea no se produce cambio de color en el medio.
 Si es necesario realizar las pruebas bioquímicas que se indican en la tabla.
Pruebas Serológicas:
Prueba para antígeno somático, polivalente O
 Diluir y chequear el antisuero con cultivos conocidos
 Marcar 2 secciones de 1 x 2 cm en un portaobjetos
 Colocar una asada de cultivo de 24 horas de Agar Nutritivo o Agar Hierro tres azúcares en la
sección marcada
 Agregar una gota de solución salina fisiológica a cada sección
 Mezclar con asa limpia
 Agregar una gota de antisuero polivalente o a una sección y mezclar

4.  Agitar el portaobjetos por 1 minuto
 Observar sobre fondo oscuro
Interpretar:
Positivo: Cuando se presenta aglutinación en la mezcla cultivo salina suero y
no aglutinación en la mezcla cultivo salina.
Negativo: Cuando no hay aglutinación en la mezcla cultivo salina suero. Estos
cultivos deben probarse con el antisuero polivalente H
Inespecífico: Cuando las dos mezclas aglutinan. En este caso se requieren pruebas
adicionales
Interpretación:
Las cepas que muestran pruebas bioquímicas típicas y dan reacciones serológicas positivas se
consideran como Salmonella especies.
1. Las cepas que muestran pruebas bioquímicas típicas pero no dan reacciones serológicas y
las cepas que no muestran reacciones bioquímicas típicas pero dan reacciones serológicas
positivas pueden ser Salmonella
2. Las cepas que no muestran reacciones bioquímicas típicas ni dan reacciones serológicas
positivas no se consideran Salmonella.
Las cepas aisladas en los casos 1 y 2 deben ser enviadas en Agar Cerebro Corazón
inclinado en tubo de tapa rosca a un Centro de referencia, adjuntando la
información pertinente.
Expresión de resultados:
Si no se aisló Salmonella en los medios de enriquecimiento y selectivos reportar:
No se aisló Salmonella en 25 g o 50 g de la muestra examinada.
Si se encuentra Salmonella a partir de uno o los 2 caldos de enriquecimiento selectivo reportar:
Se aisló Salmonella en 25 g de la muestra examinada.

5. Reacción Porcentaje de
Serotipos que
producen la Reacción
Agar Hierro tres azúcares:
glucosa, con formación de ácido + 100
glucosa, con formación de gas + 91.9
lactosa -* 99.2
sacarosa - 99.5
H2S + 91.6
Urea - 100
Lisina + 94.6
 galactosidasa -* 98.5
Indol - 98.9
* Salmonella: subgénero III (Arizona) puede presentar reacciones positivas.

6. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA SALMONELLA
MEDIOS DE CULTIVO
PRUEBA Y/O REACTIVOS SIEMBRA INTERPRETACION
Oxidasa A. Nutritivo Colocar 1 colonia sobre A los 20-60 segundos
+ Discos de Oxidasa la zona reactiva de la comparar con escala de
tira colores
Positivo: Azul o violeta
Indol Agua de Triptona Siembra ligera Agregar 0.3-0.5 mL de Reac.
+Reactivo de Kovacs Incubar 18-24 horas de Kovac
Positivo: coloración rosada
Rojo de Metilo Caldo MR VP + Siembra ligera Agregar 4-6 gotas de rojo de
Sol Rojo de Metilo Incubar 48 horas metilo
Positivo: color rojo
Voges Proskauer Caldo MR VP + Separa 1 mL del cultivo Agregar 0.6 mL de  naftol y
 naftol y KOH en caldo MRVP antes 0.2 mL de KOH. Agitar y
de hacer la prueba dejar reposar hasta 2 horas
Positivo: Coloración rojiza
Citrato Agar Citrato de Simonns Sembrar en estrías Positivo: Crecimiento en la
Incubar 24 horas superficie y cambio de color
a azul
Malonato Caldo malonato Incubar 24-48 horas Positivo: cambio de color a
azul
Fenilalanina Fenilalanina Incubar 24-48 horas
Agregar HCl 0.1N hasta
amarillo.
Agregar 3-4 gotas de
Cloruro férrico al 10%
Positivo: verde en 2-3
minutos
 Galactosidasa 0.25 mL de Solución Siembra densa + 1 gota Agregar 0.25 mL de
salina fisiológica de tolueno Reactivo de ONPG
Incubar 2-5 minutos a Positivo: coloración
37°C amarilla a los 20 minutos en
baño
Esperar hasta 3 horas
reacción lenta
Fuente:
Gaviria, Blanca C., Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos, 1997, Bogotá, Colombia,
Carrera de Bacteriología PUJ.