Este documento describe la purificación y caracterización de fosfatasas ácidas presentes en la membrana plasmática de betabel (Beta vulgaris L.). Se purificó una fosfatasa de 95 kDa usando extracción con Tritón X-114 y cromatografía en columnas de DEAE-Sefarosa y CM-Sefarosa. También se purificaron fosfatasas de 82 kDa y 36 kDa usando extracción con n-octilglucósido y cromatografía en columnas de Sefacril S-300-HR y DEAE-Sefar

1. CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS
AVANZADOS DEL I.P.N. Unidad – Irapuato.
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS
FOSFATASAS ÁCIDAS DE MEMBRANA PLASMÁTICA DE
BETABEL (Beta vulgaris L.)
M. en C. Eduardo Armienta Aldana
Asesor de tesis:
Dr. Luis E. González de la Vara
Sinodales:
Dra. Marina Gavilanes Ruiz
Dr. César Ordorica Falomir
Dr. John Paul Délano Frier Depto. Biotecnología y Bioquímica
Dr. Plinio Guzmán Villate Lab. Bionergética y Biomembranas
Dr. Neftalí Ochoa Alejo

2. Receptores Segundos Cinasas dependientes Reguladores
mensajeros de segundos mensajeros hacia abajo
Membrana Plasmática
Tipo I: Canales iónicos
Ca2+ Cinasas
Ca2+-depend.
Cinasas Temperatura
Calmodulina-depend.
ABA
Tipo II: Receptores acoplados
MAP
a proteínas G
KKK Citocininas
Proteína
MAP Giberelinas
Uniendo GTP
KK
MAP Regulación Luz
K hacia Patógenos
abajo IAA
Tipo III: Cinasas receptores
Ser/Thr MAP
KKK Ser/Thr cinasas
MAP Oligogalacturonidos
KK Histidina cinasa
MAP Etileno
K
H D Citocininas
H D
Taylor y Whitelaw, 2001

3. VÍAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES
PRESENTES EN PLANTAS
Respuesta a estímulos luminosos
PHY y Fototropina son cinasas
Respuesta a hormonas
CTR1 es cinasa, ABI1 y ABI2 son fosfatasas
Regulación del ciclo celular
CDK es cinasa y cdc25 es fosfatasa
Respuesta a patógenos
Xa21 es cinasa
Interacciones célula-célula
SRK1 y CLV1 son cinasas

4. H+
5. H+-ATPasa
1. Primer
mensajero P 6. Cinasa
Evocador
4. Efector Pi H+
Fosfatasa
3. Proteína G
2. Receptor
Vera Estrella et al. 1994

5. PROCESO DE
FOSFORILACIÓN/DESFOSFORILACIÓN
ATP ADP
Proteínas
cinasas
Ser Ser
Proteína Thr Proteína Thr P
Tyr Tyr
Proteínas
fosfatasas
Pi

6. CLASIFICACIÓN DE LAS FOSFATASAS
Fosfatasas de Ser/Thr
Familia PPP PP1: Levaduras, plantas y animales
PP2A: Levaduras plantas y animales
PP2B: Levaduras, plantas(?) y animales
Nuevas: PP4, PP5, PP6, RdgC/PP7 (levaduras, plantas(?)
y animales
Familia PPM PP2C: Levaduras, animales y plantas (ej. ABI, KAPP, MP2C)
Fosfatasas de Tyr
Específicas de Tyr Parecidas a receptores: animales
Intracelulares: Levaduras, animales y plantas (ej. AtPTP1)
VH1
Especificidad dual
MKPs: Levaduras, animales y plantas (ej. AtDsPTP1)
CDC25: Levaduras, animales y plantas(?)
PTEN
Luan, 2003

7. DOMINIOS ESTRUCTURALES DE LAS
FOSFATASAS DE Ser/Thr
Familia PPP Dominio catalítico
PP1
PP2A, PP4, PP6
PP5
Motivos TPR
PP2B
Unión a CnB Unión a CaM
RdgC/PP7
Unión a Ca2+
Familia PPM Dominio catalítico
PP2C (rata)
AtPP2C
KAPP
ABI
MP2C
Luan, 2003

8. SUBUNIDADES Y REGULACIÓN DE LA
FAMILIA PPP
PP1 PP1c R PP1c R
A
A A
PP2A PP2Ac PP2Ac PP2Ac
B
B B
+ nM Ca2+ + nM Ca2+
CnB
CnB
PP2B CnA CnA CnA CaM
- Ca2+ - Ca2+
CnB
CaM CaM
Inactiva Inactiva Activa
Luan, 2003

9. DOMINIOS ESTRUCTURALES DE LAS
FOSFATASAS DE Tyr
Dominio catalítico
Dominio SH2
Fibronectina III
Membrana Plasmática
HPTPb
PTP1B
AtPTP1 VH-1
CD45 PTPm CDC25
MKP-1
AtDsPTP1
SHPs
Parecidas a receptores Intracelulares Especificidad dual
Específicas de Tyr
Luan et al., 2001

10. N-terminal
Central a3-helix
Andersen et al Mol. Cell. Biol. 2001
PP1
PTP

11. Fosfatasas en Arabidopsis
112 fosfatasas:
PP2C (69)
PTP (1)
Ser/Thr familia PPP (23)
Fosfatasas de especificidad dual (18)
Fosfatasas de bajo peso molecular (1)
Kerk et al. 2002

12. LOCALIZACIÓN DE LAS
FOSFATASAS ÁCIDAS
Las fosfatasas ácidas se suelen encontrar en casi todos los compartimientos
subcelulares, pero principalmente en vacuolas (Mimura et al., 2003),
citoplasma y pared celular (Sano et al., 2003)
Localización Referencia
Células de tomate Stenzel et al., 2003
Raíces de Arabidopsis del Pozo et al., 1999
Semillas de lupino y secretadas de
raíces de lupino Olczak y Wątorek, 2003
Li y Tadano, 1996
Frijol colorado Grote et al., 1998

13. FUNCIÓN DE LAS FOSFATASAS ÁCIDAS
Función Referencia
Disponibilidad de P Narang et al., 2000
Stenzel et al., 2003
Estrés salino, hídrico u osmótico Knight y Knight, 2001
Zhu, 2002
González et al., 2003
Wang et al., 2003
Germinación de semillas de
Vigna sinensis Biswas y Cundiff, 1991
Almacenamiento vegetativo (VSP) Berger et al., 1995
Funciones metabólicas Turner y Plaxton, 2001
Movilización de P y metabolismo
del oxígeno (actividad de peroxidasa) del Pozo et al., 1999

14. FOSFATASAS ÁCIDAS PURPURAS (PAPs)
Tipo I
polipéptidos de aproximadamente 35 kDa
Centros binucleares Fe2+-Fe3+
Tipo II
Polipéptidos de aproximadamente 55 kDa
Centros binucleares Zn2+-Fe3+
Se han descrito 24 genes de PAPs en el genoma de Arabidopsis (Li et al., 2002)
Las fosfatasas ácidas reportadas por Olczak y Wątorek (2003) son PAPs, así como
la descrita por del Pozo et al., 1999

15. DESFOSFORILACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA
MEMBRANA PLASMÁTICA DE BETABEL
Tiempo (min)
0.5 1 5 10 20 40 60 80
116
97
67
45
29
Autorradiografía
Armienta Aldana, 1999

17. OBJETIVO GENERAL
La identificación, purificación y caracterización
bioquímica de algunas fosfatasas presentes en la
membrana plasmática de betabel (Beta vulgaris L.)

18. OBJETIVOS PARTICULARES
Purificar a homogeneidad una o varias fosfatasas presentes en
la membrana plasmática de betabel.
Estudiar la actividad enzimática y las características bioquímicas
de las fosfatasas purificadas.
Determinar el grado de asociación de las fosfatasas con la membrana
plasmática de betabel.
Determinar su posible función en la planta, mediante la medición de
la actividad de fosfatasa en membranas plasmáticas de betabeles
cultivados bajo dos regímenes de estrés (estrés salino y estrés de
fosfato).

20. PURIFICACIÓN DE LA FOSFATASA DE 95 kDa
Membranas Plasmáticas de Betabel
Extracción con Tritón X-114
Fase Superior Fase Inferior
Cromatografía Reextración con Tritón X-114
Columna de DEAE-Sefarosa
Cromatografía
Columna de CM-Sefarosa Fase Superior Fase Inferior
Armienta Aldana, 1999

21. Pasos Proteína Act. total Act. Especifica Purificación Rendimiento
(mg) (nmol mg-1 ) (nmol mg-1 min-1) (veces) (%)
Memb. Plasmáticas 15.047 74.09 4.924 1
Extracción TX-114 5.829 95.05 16.31 3 128
DEAE-Sefarosa 0.288 28.85 100.0 20 39
CM-Sefarosa 0.016 3.762 230.0 47 5.1
(empleando pNPP como sustrato)
CM
MPB F.S. DEAE 0.1 M 0.5 M
kDa
116
9 95 kDa
7
67 MPM: Marcadores de peso molecular
MPB: Membranas plasmáticas de betabel
FS: Fase superior
45 DEAE: Mezcla de fracc. de la columna de
DEAE-Sefarosa
29 0.1 M: Fracc. eluídas con 0.1 M NaCl
0.5 M: Fracc. eluídas con 0.5 M NaCl
Armienta Aldana, 1999

22. CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA
DE 95 kDa 1 2 3 4 5 6 7
Fosfatasa (nmol mg-1 min-1)
80
70
60
50 116
40 97
95 kDa
30
20 67
10
0 45
-10
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
pH 29
F.S 0.1 M 0.5 M
.
kDa
116
97
95 kDa
67
1. Fracción citosólica de Arabidopsis
45 2. Fracción microsomal de Arabidopsis
3. Gradiente de glicerol de SN
29 4. Gradiente de glicerol de FS
FS: Fase superior 5. Fracción purificada de CM-Sefarosa
0.1 M: Fracc. eluídas con 0.1 M NaCl 6. Sobrenadante
0.5 M: Fracc. eluídas con 0.5 M NaCl 7. Membrana plasmática de betabel

23. INHIBIDORES Y ACTIVADORES DE LA
FOSFATASA DE 95 kDa
(nmol mg-1 min-1) % Act.
Control 61.5 100
Molibdato 1 mM 9.5 15
Citrato 2 mM 55.4 90
ZnSO4. 7H2O 1 mM 53.9 88
Heparina 20 mg/mL 64.3 105
MnSO4 1 mM 39.3 64
DTT 1 mM 62.2 101
Control 90.0 100
Vanadato 2 mM 70.1 78
Control 480.8 100
FeSO4 3 mM (incubación) 499.3 104
Control 226.0 100
FeCl3 3 mM (incubación) 318.1 141
(Actividades medidas con pNPP a 405 nm)
Armienta Aldana, 1999

24. CONCLUSIONES I
Con TX-114 se extrajo una fosfatasa de 95 kDa, mostró un pH
óptimo de 6.0, también mostró actividad de fosfatasa en gel, no
desfosforiló fosfoproteínas, fue inhibida por molibdato y activada
por iones hierro

25. PURIFICACIÓN DE LAS FOSFATASAS
DE 82 kDa Y 36 kDa
Membranas plasmáticas de betabel
Extracción con n-octilglucósido
Centrifugación
Sobrenadante Pastilla
Cromatografía
Columna de Sefacríl S-300-HR
Cromatografía
Columna de DEAE-Sefarosa

26. 35 0.18
Act. Vol.
Proteína
1 2 3 4 5 Sefacríl 0.16
Fosfatasa (nmol mL-1 min-1)
30
0.14
25
0.12
20
mg/mL
0.10
116
15 0.08
97
0.06
82 kDa 10
0.04
67
65 kDa 5
0.02
0 0.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
45
36 kDa Fracción Act. Vol.
18 0.014
Proteína
29
* DEAE
Fosfatasa (nmol mL-1 min-1)
16
0.012
14
0.010
12
mg/mL
1. Membranas plasmáticas de betabel 10 0.008
2. Sobrenadante de la extracción con 8 0.006
n-octilglucósido 6
0.004
3. Mezcla de fracciónes de la columna de
Sefacril (S10-S11)
4
+ 0.002
2
4. Fracción de la columna de DEAE-Sefarosa 0 0.000
con actividad de fosfatasa de 82 kDa * NR A B D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8
5. Fracción de la columna de DEAE-Sefarosa
Fracción
con actividad de fosfatasa de 36 kDa +

27. TABLA DE PURIFICACIÓN DE
FOSFATASA DE 82 kDa
Proteina Act. Total Act. Específica Purificación Rendimiento
(mg) (nmol min-1) (nmol mg-1 min-1) (Veces) (%)
Membranas
5.51 159.5 28.9 1.0 100
Plasmáticas
Extracto de
1.96 96.7 49.4 1.7 60.7
Octilglucósido
Sefacril S300-HR 0.0499 23.5 470.2 16.2 14.7
DEAE-Sefarosa 0.0018 6.71 3726 129 4.2
(empleando pNPP como sustrato)

28. TABLA DE PURIFICACIÓN DE
FOSFATASA DE 36 kDa
Proteina Act. Total Act. Específica Purificación Rendimiento
(mg) (pmol min-1) (pmol mg-1 min-1) (Veces) (%)
Membranas
7.58 701.7 92.6 1 100
Plasmáticas
Extracto de
1.98 232.7 117.3 1.27 33.2
Octilglucósdio
Sefacril S300-HR 0.0544 83.01 1526 16.5 11.8
DEAE-Sefarosa 0.0013 9.15 6845 73.9 1.3
(empleando 32P-MBP como sustrato)

29. Actividad de fosfatasa (pmol mL-1 min-1)
14
12
10
8
6
4
2
0
B 3 4 5 6 7 8
Ext. Con TX-114 Ext. con octilglucósido Fracción
134
94 FS: Fase superior de la extracción con TX-114
S5, S6 y S7: Fracciones obtenidas de la columna
69
56 de Sefacríl provenientes de la FS
SN: Sobrenadante obtenido de la extracción con
43
n-octilglucósido
34 S5, S6 y S7: Fracciones obtenidas de la columna
24 de Sefacríl provenientes del SN
22 P: pastilla resultante de la extracción con
n-octilglucósido
FS S5 S6 S7 SN S5 S6 S7 P

30. CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA
DE 82 kDa
3500
3000
Fosfatasa (nmol mg-1 min-1)
Fosfatasa (nmol mg-1 min-1)
3000
2500
2500
2000
2000
1500
1500
1000
1000
500
500
0
0 0 2 4 6 8 10 12
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
pH Concentración pNPP (mM)

31. USO DE DIVERSOS INHIBIDORES Y
ACTIVADORES, ASÍ COMO DE
DIVERSOS SUSTRATOS
200
Inhibidor
180 Activador 82-kDa
Sustrato APasa
160 Sin efecto
140 (nmol mg-1 min-1)
% Actividad de Fosfatasa
120
p-Nitrofenil fosfato 4067 + 392
100
80 Fosfotirosina 4140 + 266
60
Fosfotreonina 3644 + 404
40
20 Fosfoserina 3757 + 215
0
ATP 4158 + 649
GTP 4172 + 927
Pirofosfato de sodio 4599 + 446
a-Naftil fosfato 3984 + 248
b-Naftil fosfato 4076 + 255

32. CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA
DE 36 kDa
2500 20
18
Fosfatasa (nmol mg-1 min-1)
Fosfatasa (nmol mg-1 min-1)
2000 16
14
1500
12
10
1000
8
6
500
4
0 2
0
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
pH
Concentración MBP (mg/mL)

33. USO DE DIVERSOS INHIBIDORES Y
ACTIVADORES
Compuesto Concentración Actividad (%)
Acido okadaico 2 nM 16.6
Acido okadaico 2 mM 0
Molibdato 1 mM 55.1
Vanadato 1 mM 99.3
NaF 5 mM 10.7
MgSO4 5 mM 31.2
MnSO4 5 mM 51.7
FeSO4 5 mM 80
KCl 150 mM 100
NaCl 150 mM 105

34. CONCLUSIONES II
Con n-octilglucósido se purificaron 2 fosfatasas de 82 y 36 kDa
La fosfatasa de 82 kDa es una fosfatasa ácida y no desfosforiló
fosfoproteínas. Mostró un pH óptimo de 5.6 y una Km de 7.7 ± 2 mM.
Fue inhibida por molibdato y activada por KCl
La fosfatasa de 36 kDa es una fosfatasa de proteínas. Mostró
un pH óptimo de 6.6 y no se alcanzó el punto de saturación con
2 mg/mL de sustrato (32P-MBP). Fue inhibida por ácido okadaico,
mostrando características de una PP2A

35. ACTIVIDAD DE FOSFATASA EN VACUOLAS
1 2 3 4 5 6 7
300
116
97
Fosfatasa (nmol mg-1 min-1)
250 67
200
45
150
100 29
50
0
1 2 3 4
Fracción
1. Sobrenadante obtenido de la plasmólisis 1. Sobrenadante obtenido de la preparación de membranas
de betabeles plasmáticas
2. Pastilla obtenida de la plasmólisis de 2. Fracción de la columna de DEAE con actividad de fosfatasa
3. Fracción purificada de la columna de CM-Sefarosa de la
betabeles fosfatasa de 95 kDa
3. Sobrenadante obtenido de la centrifugación del 4. Sobrenadante obtenido de la plasmólisis de betabeles
gradiente discontinuo de dextran 5. Pastilla obtenida de la plasmólisis de betabeles
6. Sobrenadante obtenido de la centrifugación del gradiente
4. Vacuolas discontinuo de dextran
7. Vacuolas

36. CONCLUSIONES III
En preparaciones de vacuolas se observó actividad de fosfatasa y al
parecer esta actividad corresponde a fosfatasas que no
se han identificado

37. DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE FOSFATASA
DE UNA EXTRACCIÓN SECUENCIAL DE
MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE BETABEL
Membranas plasmáticas de betabel
Diluir (0.2 M Sacarosa)
Pastilla 1 Sobrenadante 1
1er Lavado (0.3 M KI)
Pastilla 2 Sobrenadante 2
Extracción (0.05% (w/v) Brij 58 P)
Pastilla 3 Sobrenadante 3
2do Lavado (0.3 M KI)
Pastilla 4 Sobrenadante 4
Extracción (15 mM CHAPS)
Pastilla 5 Sobrenadante 5
Resuspender
Berzci y Møller, 1998

38. 35 45
30 pNPP 40
35
25
nmol min-1
30
20 25
15 20
Actividad de fosfatasa 15
10
10
5 5
Fosfatasa (%)
0 0
SN 1 SN 2 SN 3 SN 4 SN 5 P5
80 30
32P-MBP
70
25
pmol min-1
60
20
50
40 15
30
10
20
5
10
0 0
SN1 SN2 SN3 SN4 SN5 P5
Fracción

39. CONCLUSIONES IV
Con la extracción secuencial a las membranas plasmáticas se
observó que en todas las fracciones obtenidas se observaba
actividad de fosfatasa
Cuando se empleó pNPP y 32P-MBP como sustratos una buena
parte de la actividad representa las proteínas solubles atrapadas en
las vesículas.
Por el otro lado, cuando se empleó 32P-MBP como sustrato, 27% de
la actividad representa las proteínas asociadas débilmente a la
membrana plasmática

40. DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE FOSFATASA
EN BETABELES CULTIVADOS BAJO
CONDICIONES DE ESTRÉS
MPB C E.F. E.S. E.S. E.F. C MPB
kDa kDa
116 134
97
67 94
69
45 56
43
29
34
24
22
Gel teñido con Inmunodetección
MPB: Membrana plasmática de betabel
azul de Coomassie con anticuerpos C: Control de invernadero
E.S.: Betabeles bajo estrés salino
E.F.: Betabeles bajo estrés de fosfato

41. - Mo
2 mM pNPP + Mo /+ 10 min
160 140
5 mM pNPP + Mo
140
120
120
100
100
nmol mg-1 min-1
nmol mg-1 min-1
80
80
60 60
40 40
20 20
0
0
E.S. E.F. C C E.S. E.F. MPB
MPB: Membrana plasmática de betabel
C: Control de invernadero
E.S.: Betabeles bajo estrés salino
E.F.: Betabeles bajo estrés de fosfato

42. CONCLUSIONES V
Se observó un aumento en la actividad de fosfatasa en las
muestras de membranas plasmáticas de betabeles bajo condiciones
de estrés salino y de fosfato.

43. CONCLUSIONES FINALES
Se purificaron 3 fosfatasas ácidas de la membrana plasmática de betabel
de 82, 36 y 95 kDa, respectivamente
La fosfatasa de 82 kDa es muy posiblemente una fosfatasa soluble
La fosfatasa de 36 kDa es una fosfatasa de proteínas y tiene
características de una PP2A (una subunidad catalítica de 36 kDa y una
subunidad regulatoria de 65 kDa)
La fosfatasa de 95 kDa es una fosfatasa inespecífica
Aproximadamente un 47% de actividad de fosfatasa representa
fosfatasas solubles atrapadas en las vesículas de
membranas plasmáticas