1. Real Time PCR dapat digunakan untuk identifikasi kemungkinan adanya pencampuran daging lain (babi) pada produk daging sapi atau ayam. 2. Pada 10 jenis sosis yang diuji tidak terdeteksi adanya DNA babi, hanya terdeteksi pada kontrol positif daging babi. 3. Hasil uji menunjukkan bahwa produk sosis sapi yang diuji bebas kontaminasi daging babi.

1. Pembahasan
Padapraktikum kali ini kami
melakukanpengujianpencemarandagingbabipadabeberapaprodukmakananolahan.Adapunsamp
elproduk yang kami ujiadalahsosisbabidanbeberapamereksosissapiantara lain sosis 222,
sosisbesto, sosis champ, sosispedan, sosissozzis, sosissupertin, sosiskibit, sosisharmoni,
sosisessen, dansosis basis. Pengujianinidilakukandenganmenggunakansuatualat Real Time PCR (
Polimerase Chain Reaction).
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakanreaksipenggandaan DNA menggunakanmesin
thermal cycler (mesin
PCR).Prinsipkerjaalatiniadalahdenganmenaikandanmenurunkantemperaturdalamperiodewaktu
tertentuuntukmendenaturasi DNA, menempelkan primer pada DNA (annealing)
danmenggandakannya (elongasiatauekstensi). PCR sepertiinidisebut PCR konvensionalkarena
proses deteksidilakukan di akhir proses (end point) danhanyadapatmendeteksisecarakualitatif.
PCR konvensionalmembutuhkan proses post-PCR berupaelektroforesismenggunakan agar rose
dengankonsentrasitertentudandokumentasimenggunakan gel doc yang disambungkanke PC
komputer.
Tetapidalampraktikum kali ini yang digunakanbukanlahsekedar PCR, melainkanReal-Time PCR.
Real-Time PCR jumlah DNA yang
diamplifikasidapatlangsungdiamatisekeikasehinggatidakmemerlukananalisisdenganelektrofores
is gel untukmengetahuihasil PCR. Real time PCR adalah PCR kuantitatifdengancaramendeteksi
fluorescence reporter yang dihasilkanselamareaksi PCR. Peningkatan signal fluorescence
merupakanindikatoramplifikasiproduk PCR disetiapsiklus PCR (real time), semakinbanyak DNA
yang terbentuksemakintinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan. Secarasederhana, Real
Time PCR terdiridarimesin thermal cycler dandihubungkandengan software dan system
detector optik.Bahan yang digunakandalam real time PCR samadenganbahan PCR
konvensionaltetapiditambahkandenganpewarna fluorescence yang biasadisebut probe atau
reporter.
Isolasi DNAdengan DNA Purification

2. Isolasimerupakantahappertamauntukmendapatkan DNA padaselsebelumdilakukan proses
amplifikasiDNA denganmenggunakanalat PCR.Prinsipisolasi DNA adalahmemisahkan DNA
darikomponenkomponensel lain. Isolasi DNA dariorganismeeukariotdilakukanmelaluiproses
penghancuranmembransel (lisis), pemusnahan protein dan RNA, danpemanenan DNA Proses
isolasiinidenganmenggunakan Maxwell Instrument,
alatinihanyadapatdigunakanuntukisolasisampel yang mampudilisisoleh buffer danuntuk sample
darahdanjaringanhewan. Pertama – tama sampelsosismasing – masingditimbangsebanyak 50
mg dandipotongkecil – kecil.Penyiapansampel kali inidilakukandenganmenggunakan disposable
cartridge yang didalamnyaterdapatsumur – sumur yang mengandunglisis buffer, magnetic
genomic, dan wash buffer dandilengkapidengan plunger.Sampeldiletakkanpada well #1
Proses ekstraksiterdiridari 4 tahapanyaitu: Proses pemecahansel (lisis),Pengikatan DNA atau
RNA (binding), Pencucian (washing), Pelarutan (elution). Proses
ekstraksiinidilakukandenganmenggunakansuatualat Maxwell Purifikasi DNA. Pertama – tama
seldilisisdenganmenggunakanlisis buffer, lalu DNA diikatoleh magnetic genomic yang
beradadalambentuksuspensidandicucioleh wash buffer yang terdiridari isopropanol,
guanidintiosianatdanetanol, laluhasilakhirdilarutkandenganmenggunakan elution buffer (Tris
EDTA/TrisAsetat EDTA).
Amplifikasi DNA
Sebelum proses amplifikasimenggunakan Real- Time PCR,
terlebihdahuludilakukanpencampuranreaksimastermixuntukamplifikasi. Yang terdiridari primer
forward dan primer reverse, probe yang digunakansebagaipenanda, tag polymerase
yagberupaenzim, ddH2O, dan DNA template. Primer SpesifikBabi, primer adalahsepasang DNA
untaitunggalatauoligonukleotidapendek yang
menginisiasisekaligusmembatasireaksipemanjanganrantaiataupolimerisasi DNA. PCR
hanyamampumenggandakan DNA padadaerahtertentusepanjangmaksimum 1000
bpsaja.Primer dirancang agar menempelmengapitdaerahtertentu yang diinginkan.Primer
terdirisepasang, yaitu reverse dan forward.Kali ini primer yang dipakaiyaitu primer spesifikbabi,

3. karena yang diharapkanuntukdiamplifikasidisiniyaitu DNA babi.Probe merupakan primer yang
dilabelolehpewarna (reporter) danperedampewarna (quencher).Probe padareal-time PCR
digunakansebagaipewarnapendeteksiadanyasinarfluoresen yang ditangkap.Enzim DNA
polimerase (Tag DNA polimerase), yang merupakanenzim yang berasaldari Thermos aquitus
yang stabilterhadappanas. Enzim yang digunakandisiniadalahenzim LC 480, dNTP
(DeoxynucleotideTriphosphat), yang merupakanbahanbakupenyusun DNA baru, terdiridari 4
macamsesuaidenganbasapenyusun DNA, Buffer yang merupakanbahankimiatertentu yang
berfungsiuntukmengkondisikanreaksi agar berjalan optimum danmenstabilkanenzim DNA
polymerase. Dan volume pencampuranmengacupadapenelitiansebelumnya.Selama mixing
harustetapberadapada ice box karenaharusbekerja di suhu yang rendah agar
enzimtidakrusakatautidakterdenaturasi.
Prose amplifikasi DNA dilakukandenganmenggunakan Real-Time PCR. Sehingga proses
amplifikasidapatterlihat, adapuntahapan – tahapandalamamplifikasi DNA iniadalah: Pre-
incubation, yaitu proses penyiapanalatuntukmencapaisuhudenaturasi 95oC; amplifikasi yang
terdiridariDenaturasi, yaitu proses dimanakeduauntai DNA terbukamenjadiuntaitunggal,
dandisini yang digunakanadalahsuhu 95oC; Annealing, padasaatiniterjadipenempelan primer
pada DNA yang rantainyatelahterbukadanterjadipadasuhu yang
lebihrendahdarisuhudenaturasi, yaitu 60oC; Elongasipadasuhu 720C; dan Cooling dengansuhu
40oC.

4. Padahasilanalisisujikeberadaan DNA babidengantekhnik PCR pada 10 jenissampel yang
adatidakterdeteksiadanya DNA babipadasosis– sosistersebutdantentusajaterdeteksiadanya
DNA babi primer spesifikbabi.Spesifikasi primer gen babi yang
digunakandalampraktikuminidibuktikandengandigunakannyadagingsapisegarsebagaikontrolneg
atifdandagingbabisegarsebagaikontrolpositif.
Hasilidentifikasiinidivisualisasisecarasimultanselama proses amplifikasi, karena yang
digunakanadalah Real time PCR danmenggunakan probe,
sehinggamemberikanpewarnaanflourencensejikaterjadiamplifikasi.Kenaikankurvapadareal-time
PCR menandakanterjadinyaamplifikasi DNA.Amplifikasiterjadiketikaterjadinyapenempelan
primer dan probe pada DNA template. Saatterjadipenempelan primer, DNA
polimeraseakanmemperpanjangpenempelandNTPpada DNA templatehinggabertemudengan
probe. Aktifitasnukleaseakanmemecah probe dan probe yang
terpisahakanmenyebabkansinyalfluoresenreporter tidaklagidiredam, sehinggareporter
akanmemancarkansinyalfluoresensaattereksitasilalumengemisikanfluoresendanmasukkedetekt
oruntukmemberikankurva.Dimanapadavisualisasiterlihatbahwasanyadagingsapisegartidaktera
mplifikasi, sedangkandagingbabisegarteramplifikasidenganadanyakenaikan pita pada kit
dagingbabisegar. Pada primer
babimenunjukkanterjadinyaamplifikasidenganditunjukkandenganmulaiadanyakenaikanpada CP
sekitar 14.Sedangakanpadakesepuluhsosis yang diujitidakterjadikenaikan pita.Hal
inimenunjukkanhasil yang negative DNA
babi.Padahasilnegatifpadasampelsosisinikemungkinandikarenakansampel yang
memangmurniterdiridaridagingsapi,
jugadapatdikarenakansampelprodukolahanadalahprodukdalamnegeri, bukanproduk
import.Selainitujugatidakbanyaksampel yang digunakandalampraktikumini,
danjugakemungkinankarenatahapanpreparasaisampel (isolasi DNA) yang kurangcermat,
ataupunjugakarenaterlalusedikitnyakandungan DNA yang
diinginkanuntukdiamplifikasidalamsampelsosissehinggatidakteramplifikasidalam
PCR.Namundemikianprosedur yang

5. dicobadalamidentifikasiinisudahdapatdigunakandalampengujiancampuranprodukmakanandagi
ng.
Pendeteksiancemarandagingbabidenganamplifikasi DNA
memanglebihefisiendibandingkandenganteknikimunologidankromatografi yang menggunakan
protein ataulemak.Karena protein
danaktifitasbiologilainnyaakanberhentisetelahorganismetersebutmatikecualikarakteristiknya
yang masihtersimpandidalam sel. Protein
jugamemilikisifattermolabilsehinggauntukanalisisidentifikasiorganismelebihdisarankandenganp
engujianDNAOlehkarenaitu, padapraktikuminidigunakantekhik PCR
untukidentifikasiadanyakandungandagingdalamprodukolahan.
Kesimpulan
1. Real Time PCR
dapatdigunakanuntukidentifikasikemungkinanadanyapencampurandaginglain (babi)
padaprodukdagingsapiatauayam.
2. Pada Real Time PCR proses amplifikasidapatterlihatdenganditunjukkannyaintensitas
fluorescent.
3. Berdasarkankurvaamplifikasi DNA menggunakan real-time PCR,
terbuktibahwaproduksosissapi yang diujimasihsesuaidenganbahanasal yang
digunakantanpakontaminasidagingbabi