Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
-----oOo-----
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT
(STEVIA REBAUDIANA)
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM
SVTH: MSSV
PHẠM TRỌNG 10261191
MAI ĐỨC DŨNG 10251691
NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10149321
TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
-----oOo-----
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT
(STEVIA REBAUDIANA)
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM
SVTH: MSSV
PHẠM TRỌNG 10261191
MAI ĐỨC DŨNG 10251691
NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10 149321
TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013

Trang i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập tại trường ĐH công nghệp Tp.HCM , chúng em
đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy, Cô, Gia đình và bạn
bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Viện Công
Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm– Trường Đại Học Công Nghệp Thành phố Hồ Chí
Minh lời cảm ơn chân thành . Với tri thức và tâm huyết của mình, các thầy, cô đã
truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại
trường.
Chúng em xin chân thành cảm ơn Ths.Nguyễn Thành Sum đã tận tâm hướng
dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo
luận về lĩnh vực trong nghiên cứu khoa học. Nếu không có những lời hướng dẫn,
dạy bảo của thầy thì đồ án của chúng em rất khó có thể hoàn thành.
Bài báo cáo này không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những
ý kiến đóng góp quý báu của Quý Thầy Cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn.

Trang
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................... i
MỤC LỤC ..............................................................................................................ii
DANH MỤC HÌNH ẢNH......................................................................................v
DANH MỤC BẢNG..............................................................................................vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... viii
PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................1
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................2
2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt...................................................................................2
2.1.1. Vị trí phân loại.....................................................................................2
2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt........................................................................2
2.1.3. Phân bố................................................................................................3
2.1.4. Đặc điểm hình thái ..............................................................................3
2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng:.........................................................................4
2.1.6. Điều kiện sinh trưởng..........................................................................5
2.2. Nhân giống cây trồng in vitro........................................................................6
2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật ..............................................6
2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật.......................6
2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật..................8
2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro .......................................................8
2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro .................................10
2.2.6. Điều kiện nuôi cấy.............................................................................12
2.2.7. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy.................................................12
2.2.8. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)................................13

Trang
iii
2.2.9. Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam
...........................................................................................................15
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................16
3.1. Vật liệu ........................................................................................................16
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................16
3.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ...................................................................16
3.1.3. Môi trường nuôi cấy..........................................................................18
3.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro................................................................18
3.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................19
3.2.1. Phương pháp khử trùng.....................................................................19
3.2.2. Phương pháp thí nghiệm ...................................................................19
3.2.3. Phân tích thống kê .............................................................................25
3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...............................................................25
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................26
4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ
sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro....................................................................26
4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản phù hợp cho sự sinh trưởng
và phát triển cây Cỏ ngọt in vitro .............................................................................27
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng
lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. ..............................................................29
4.3.1. Thí nghiệm 3a: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung Ki kết
hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro........................30
4.3.2. Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung Ki
kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro................32
4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA
kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro..................33

Trang
iv
4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA
kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro................34
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình
thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro..............................................................................35
4.4.1. Thí nghiệm 4a: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ
của cây Cỏ ngọt in vitro. .......................................................................................36
4.4.2. Thí nghiệm 4b: Khảo sát ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác
nhau đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro..............................................37
4.4.3. Thí nghiệm 4c: Khảo sát ảnh hưởng của IAA đến sự hình thành rễ
của cây Cỏ ngọt in vitro. .......................................................................................39
PHẦN 5: KẾT LUẬN .......................................................................................42
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Trang
v
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) ............................................................2
Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt.............................................................................................2
Hình 2.2 Các bộ phận của cây cỏ ngọt....................................................................4
Hình 4.1 Các dạng mẫu trong thí nghiệm khử trùng mẫu: a. mẫu sống và mọc
chồi;.......................................................................................................................27
Hình 4.2 Kết quả nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro.........29
Hình 4.3 Chiều cao và số chồi ở các nghiệm thức nhân nhanh chồi trong môi
trường có sự kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA ....................................................31
Hình 4.4 Nghiệm thức nhân nhanh chồi kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA ........33
Hình 4.5 Chiều cao và hình thái chồi trong các nghiệm thức kết hợp giữa BA và
0.2 mg/l IBA..........................................................................................................34
Hình 4.6 Hình thái cây trong các nghiệm thức nhân nhanh chồi có kết hợp giữa
BA và 0.2 mg/l NAA ............................................................................................35
Hình 4.7 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung IBA .....................................37
Hình 4.8 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung NAA. ..................................39
Hình 4.9 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bố sung IAA.....................................41

Trang
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong
nhân giống in vitro ..................................................................................................9
Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo mẫu Cỏ Ngọt in vitro sạch bệnh
...............................................................................................................................20
Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm tìm môi trường cơ bản cho cây Cỏ Ngọt in
vitro. ......................................................................................................................21
Bảng 3.3 Các nghiệm trong thí nghiệm nhân nhanh chồi thức nhân nhanh chồi .22
Bảng 3.4 các nghiệm thức trong thí nghệm tìm môi trường ra rễ cho cây Cỏ Ngọt
in vitro ...................................................................................................................24
Bảng 4.1 Kết quả nghiệm thức khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu Cỏ
ngọt bằng chất khử trùng TCCA...........................................................................26
Bảng 4.2 Kết quả của thí nghiệm tìm môi trường cơ bản tối ưu cho cây Cỏ ngọt in
vitro .......................................................................................................................28
Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có sự bổ sung kết hợp giữa Ki và
0.2 mg/l IBA..........................................................................................................30
Bảng 4.4 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2
mg/l NAA..............................................................................................................32
Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA
...............................................................................................................................33
Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA
...............................................................................................................................34
Bảng 4.7 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IBA................36
Bảng 4.8 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung NAA..............37
Bảng 4.9 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IAA ...............39

Trang
viii
CÁC TỪ VIẾT TẮT
MS : Murashige và Skoog
IBA : Indol butyric acid
NAA : Napthlacetic acid
IAA : Indol acetic acid
Ki : Kinetin
BA : Benzyl adenin
ĐC : Nghiệm thức đối chứng

Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum
Trang
1
PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thông kê gần đây, tỉ lệ mắc bệnh đái tháo đường, thường được gọi là bệnh
tiểu đường đang gia tăng nhanh tại Việt Nam. Năm 1990 tỷ lệ mắc bệnh đái tháo
đường chỉ ở mức từ 0,9%( Huế) cho đến 2,52%( thành phố Hồ Chí Minh), nhưng chỉ
sau 10 năm, năm 2001 tỷ lệ này ở các thành phố lớn đã là 4,1%, năm 2002 tăng lên
4,4%- với mức tính ở cả cộng đồng là 2,7% dân số; nếu tính ở nhóm người có yếu tố
nguy cơ mắc bệnh cao thì tỷ lệ bệnh đã tăng trên 10%-. Theo thống kê năm 2008, tỷ
lệ mắc bệnh đái tháo đường trong cả nước là trên 5% (khoảng 4,5 triệu người), tại các
thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ từ 7,0 đến 10% .
Theo dự đoán, con số người mắc bệnh tiểu đường tại Việt Nam sẽ còn tăng hơn
nữa khi kinh tế tiếp tục tăng trưởng và càng ngày càng nhiều người tại Việt Nam
chuyển sang lối sống thành thị hiện đại.
“Chúng ta sẽ chứng kiến một đại dịch thực sự tại Việt Nam trong những năm tới,”
ông Jessper Hoiland được Tờ The New York Times trích thuật.
“Ngày nay nhiều người chết vì ăn quá nhiều hơn là vì đói” ( Hoiland ).
Các con số chính thức ở Việt Nam cho thấy bệnh tiểu đường túyp 2 gia tăng với
chỉ 1% người trưởng thành trong dân số vào năm 1991, năm đầu tiên có khảo sát toàn
quốc, lên 6% vào năm ngoái, theo trích dẫn của tờ The New York Times.
Trước tình hình đó, dựa trên đường Steviozit có trong cây cỏ ngọt có công thức là
C38H60O18 có độ ngọt gấp 300 lần so với đường saccharose, ít năng lượng, ngon,
không lên men, không bị phân huỷ, bởi vậy rất có triển vọng dùng để thay đường
trong chế độ ăn kiêng và hỗ trợ trong căn bệnh tiểu đường.
Hiện nay ở nước ta, Cây cỏ ngọt là một trong những cây trong nhóm được chú ý
phát triển. Cây cỏ ngọt đã đang được nhân giống bằng phương pháp truyền thống
như giâm cành, gieo hạt nên khó đảm bảo được về chất lượng, tính đồng nhất của
giống và có thể gây thoái hóa giống. Vì vậy, chúng tôi thực hiên đề tài: “NHÂN
GIỐNG CÂY CỎ NGỌT IN VITRO (STEVIA REBAUDIANA)”. Nhằm mục đích góp
một phần nhỏ vào việc tạo nguồn cây con đồng nhất cho sản xuất.

Trang
2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt
Tên thường gọi: Cỏ ngọt, Cỏ mật, cỏ
cúc...
Tên khoa học: Stevia rebaudiana
2.1.1. Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Bộ: Asterales
Tông: Eupatorieae
Họ: cúc Asteraceae (Compositae)
Chi: Stevia
Loài: Stevia rebaudiana
Cỏ ngọt có khoảng 240 loài có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ,
Mexico và một vài tiểu bang miền namHoa Kỳ.
Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau :
 Stevia eupatoria
 Stevia ovata
 Stevia plummerae
 Stevia rebaudiana
 Stevia salicifolia
 Stevia serrata
Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo sát trên 184 loài cỏ ngọt thì có khoảng 18
loài cho chất ngọt nhưng trong 18 loài này Stevia ribaudiana là loài cho chất ngọt
nhiều nhất.
2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt
Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ.
Vào thế kỉ 16, các thủy thủ người Tây Ban Nha đã từng đề cập đến loại thảo mộc
này rồi nhưng đến năm 1888 các nhà thực vật học người Paraguay là Mises
Santiago Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi nó là Stevia rebaudianoa
Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt
Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia
rebaudiana)

Trang
3
Bertoni. Từ ngàn năm nay thổ dân Guarani người Paraguay đã dùng loại thảo
mộc này để làm dịu ngọt các loại thức ăn, nước uống có tính đắng và cũng dùng
để trị một số bệnh béo phì, tim mạch, cao huyết áp.
2.1.3. Phân bố
Cỏ ngọt được trồng và sử dụng hầu hết các Châu lục, đặc biệt ở các nước Nhật
Bản, Inđônêxia, Braxin, Paraguay, Mỹ, Thái Lan… Ngày nay cỏ ngọt được trồng
khá phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc, Inđônêxia và một số
nước khác. Cỏ ngọt được nhập vào nước ta từ năm 1988 trồng thử nghệm. Hiện
nay cỏ ngọt đã thích ứng với nhiều vùng khí hậu khác nhau ở nước ta như, sinh
trưởng tốt tại Sông Bé, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Vĩnh
Phúc, Yên bái.
2.1.4. Đặc điểm hình thái
a. Thân, cành
Cỏ ngọt là dạng thân bụi thân tròn có nhiều lông, mọc thẳng. Chiều cao thu
hoạch là 50-60 cm, tốt đạt 80-120 cm, thân chính có đường kính đạt 2.5 –8 mm.
Cỏ ngọt phân cành nhiều, khi ra hoa mới phân cành cấp 2, 3. cành cấp 1 thường
xuất hiện từ các đốt lá cách mặt đất 10 cm. Thông thường cây cỏ ngọt cho 25– 30
cành. Tổng số cành trên cây có thể đạt 140. Thân non màu xanh, già màu tím nâu,
có hệ thân mầm phát triển mạnh.
b. Lá
Mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có từ 12-16 răng cưa. Lá hình
trứng ngược. Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm tròn tới cặp lá thứ tư mới có răng
cưa ở mép lá. Lá trưởng thành dài khoảng 50 – 70mm, rộng 17-20mm có 3 gân
song song, lá màu xanh lục,trên thân có70-90 lá.
c. Hoa
Hoa tự, nhóm họp dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4-7 hoa đơn lưỡng tính.
Mỗi hoa đơn hình ống có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh
tràng màu trắng khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4-5 dính trên tràng có

Trang
4
màu vàng sáng, cá chỉ nhị rời còn bao phấn dính mép với nhau. Bầu hạ 1 ô, 1
noãn, vòi nhụy mảnh chẻ đôi, các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả
năng tự thụ phấn thấp hoặc không có.
d. Quả và hạt
Quả và hạt của cây cỏ ngọt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu thẫm, 5
cạnh dài từ 2- 2,5mm. Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi, nhưng nội nhũ trần do vậy tỉ lệ
này mầm thấp.
e. Rễ
Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm. Hệ rễ chùm lan rộng
ở đường kính 40 cm và có độ sâu từ 20– 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều
kiện đất tơi xốp, đủ ẩm. Là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0–30 cm
tùy thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất.
Hình 2.3 Các bộ phận của cây cỏ ngọt.
2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng:
Cỏ ngọt là cây lâu năm, nó có thể sống từ 5-10 năm. Tuy nhiên, khi năng suất

Trang
5
của cỏ ngọt đã xuống thấp thì nên nhổ bỏ và trồng lại cây mới.
Là cây bán nhiệt đới ưa ẩm, ưa sáng nhưng sợ úng và chết khi ngập nước. Sinh
sản hữu tính (gieo hạt) hoặc vô tính (giâm cành).
2.1.6. Điều kiện sinh trưởng
a. Nhiệt độ
Cỏ ngọt là cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng trong điều kiện mát mẻ. Có thể sinh
trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 15-30℃, nhiệt độ thích hợp
nhất là 20-22℃. Nhiệt độ tối thích hợp cho sự nảy mầm của hạt là 20℃. Nhiệt độ
cao làm tăng hàm lượng steviozit. Từ 15-30℃ cây sinh trưởng khoẻ, cho năng
suất thu hoạch cao. Nhiệt độ > 35℃. cây sinh trưởng kém.
b. Ẩm độ
Môi trường sống tự nhiên của cây cỏ ngọt thích hợp nhất là khí hậu cận nhiệt
đới, ưa ẩm ướt, với lượng mưa trung bình hàng năm từ 1400-1600mm. Độ ẩm
thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển là 70-85%. Cỏ ngọt thường mọc tự
nhiện trên các đầm lầy.
c. Ánh sáng
Cỏ ngọt là cây tương đối mẫn cảm với độ chiếu sáng. Cường độ ánh sáng
mạnh làm tăng hàm lượng steviozit.
d. Đất và dinh dưỡng khoáng
Cỏ ngọt có thể sinh trưởng và phát triển trên nhiều loại đất khác nhau, nhưng
thích hợp nhất là đất tơi xốp, thông thoáng, nhiều mùn. Trên những đất như thế
cỏ ngọt cho thu hoạch cao, hàm lượng các chất ngọt tăng. Đất sét không thích
hơp cho sự sinh trưởng của cỏ ngọt. Cỏ ngọt là cây thu hoạch lá do vậy nó yêu
cầu chế độ dinh dưỡng cao, vì thế bón phân là biện pháp tích cực để tăng năng
suất cỏ ngọt. Cỏ ngọt ưa đất trung tính, PH trong đất khoảng từ 6,5 đến 7 là tốt
nhất.

Trang
6
2.2. Nhân giống cây trồng in vitro
2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi
cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ
vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di
truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất.
Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng
quý hiếm.
Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ
thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo
mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân
giống.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp
nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu
quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White, 1939) và rễ
(Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố
bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980,
1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có
3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu
được sử dụng trong nuôi cấy.
Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ của
các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình
hình thành chồi và rễ (Brown & Thorpe, 1986).
2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực
vật. Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 - 20 năm trở lại
đây. Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã

Trang
7
được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học
như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận
định:
Đó là tính toàn thế của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn
chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan
trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được
những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng.
Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cây đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính
sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà khoa học khai
thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt).
Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với
tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây), cây
cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,...).
Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng
trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm.
Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra
các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo.
Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen.
Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng
ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống.
Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn
chỉnh từ các protoplast lai.
Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa.
Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp
không mất tính toàn thế của tế bào.
Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu
di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật.

Trang
8
Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng
không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế.
Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới năm 2010
là: Tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực
vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995).
2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm
sau:
Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phần này giống như nhân
giống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các
loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể
không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm
hơn nhân giống qua hạt.
So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống
bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá
thể ban đầu trong thời gian ngắn.
Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu
một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm
nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một
giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao
đổi giống được dễ dàng.
2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro
Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), sự thành công của việc nhân giống in vitro
chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn:
a. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in
vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa

Trang
9
vào nuôi cấy in vitro.
Theo tài liệu của Street (1974) các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô nuôi cấy
như sau:
Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong nhân
giống in vitro
Tác nhân vô
trùng
Nồng độ
(%)
Thời gian xử
lý (phút)
Hiệu quả
Hypochlorit
Calcium
9-10 5-30 Rất tốt
Natri hypochlorit 2 5-3 Rất tốt
Hydroperoxid 10-12 5-15 Tốt
Nước brom 1 -2 2 - 10 Rất tốt
HgCl2 0,1 -1 2 - 10 TB
Chất kháng sinh 4 - 50mg/l 30 - 60 Khá tốt
Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy
vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần
thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.
b. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô
nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất
auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh
điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non,
chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá
sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh
của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi.
c. Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số
nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà

Trang
10
sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,...), các chất bổ sung khác như nước
dừa, dịch chiết nấm men,. kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.
Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích
thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát
triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô
tính.
d. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ
xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ
sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có
chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
e. Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá
trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này
trong thực tiễn sản xuất.
Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh
sáng, ẩm độ, giá thể,.) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm
cũng như ruộng sản xuất.
2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
a. Mẫu nuôi cấy
Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và
chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng
cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn
lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu.
b. Kiểu gen
Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá được sử

Trang
11
dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các
genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990)
ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi
cấy hạt phấn cà chua Lycopersycon esculentum Mill.
c. Chọn cơ quan
Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử
dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác
nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller
(1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nẩy mầm từ hạt.
d. Tuổi và sinh lý
Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho
thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều
nghiên cứu khác nhau vế ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik
(1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già.
e. Mẫu in vitro
Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có
khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn
ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al. (1991)
ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây
đồng ruộng.
f. Sức sống của mẫu
Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in
vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những
cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất
là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn
những cây bệnh được nhân lên.

Trang
12
2.2.6. Điều kiện nuôi cấy
a. Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 - 27℃. Theo Murashige (1974),
nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những
tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan.
b. Cường độ ánh sáng
Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến
khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng hình như có
liên hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng
thấp hay tối (Papachatzi et al., 1981; Miller và Murashige, 1976; Thorpe và
Murashige, 1970). Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điêu kiện ánh sáng 1000
lux (Dương Công Kiên, 2002).
c. Quang kỳ và chất lượng ánh sáng
+ Thời gian chiếu sáng
Ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng.
+ Chất lượng ánh sáng
Ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh
sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh
dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro.
+ Các chất khí
Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây in
vitro. O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều
trong môi trường nuôi cấy. Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến
quá trình làm khô mẫu nuôi cấy.
2.2.7. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết. Vì

Trang
13
mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau.
Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ
theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây
hoàn chỉnh.
Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy
hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp
cho mẫu nuôi cấy.
Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính với nguyên tắc
có sự cân bằng các yếu tố trong môi trường.
Các thành phần chính:
 Đường làm nguồn carbon.
 Các muối khoáng đa lượng.
 Các vitamin.
 Các chất điều hòa sinh trưởng.
Ngoài ra các tác giả còn cho thêm một số chất hữu cơ như: Nước dừa, nước
chiết nấm men.
2.2.8. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)
Chất ĐHSTTV hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản
phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo). Chúng có tác
dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Tuy nhiên, các
chất ĐHSTTV chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực
tiếp vào quá trình trao đổi chất. Nó không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng.
Chất ĐHSTTV gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé lên trao đổi
chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm. Trong
thành phần môi trường nuôi cấy, các chất ĐHSTTV làm việc như chiếc chìa khoá
đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt
chất. Tác dụng của chất ĐHSTTV liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng
tổng hợp enzyme trong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử DNA.

Trang
14
Mỗi một chất ĐHSTTV đều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của
thực vật, để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường
không phải là một mà là vài chất. Tuỳ mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát
triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau. Trong phạm vi nghiên
cứu của đề tài chúng tôi sử dụng các chất thuộc nhóm auxin và cytokinin.
a. Auxin
Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự
hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng
quả. Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn
cản sự phân giải chúng. Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì
chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hoá tế bào
cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật. Auxin cùng với một số chất
điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành
cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:
Indol acetic acid (IAA)
Naphthyl acetic acid (NAA).
2,4-D Dichlorophenol acetic acid (2,4-D).
Indol butyric acid (IBA).
b. Cytokinin
Bao gồm các nhóm chất: 6-Benzylaaminopurin (BAP), Kinetin (Ki), Zeatin
(Z), Thidiazuron (TDZ).
Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng
tốc độ phân bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng
thời ức chế sự phân hoá rễ của mô cấy.

Trang
15
Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này
cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong
một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông
thường cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi. Và ngược lại, auxin cao
hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ.
Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp
DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất.
2.2.9. Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam
a. Trên thế giới
Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về việc nhân giống cây cỏ ngọt in vitro trên thế
giới. Một số kết quả nghiên cứu nhân giống cây cỏ ngọt bằng phương pháp in vitro đã
được công bố trên các tạp chí như :
MUHAMMAD RAFIQ và cộng sự thuộc Viện Công nghệ sinh học và kỹ thuật di
truyền, Đại học Sindh, Jamshoro, Pakistan được đăng trên tạp chí Pak. J. Bot., 39(7):
2467-2474 (2007). Họ tiến hành khảo sát khả năng ra rễ của cây cỏ ngọt in vitro trên
môi trường MS với các nồng độ khác nhau của hai CĐHST thực vật là IAA và NAA.
Kết quả thu được là với việc bổ sung 0.5 mg/L NAA việc hình thành rễ của cây cỏ
ngọt là tốt hơn so với các nghiệm thức còn lại.
Maria GENEVA và các cộng sự thuộc Viện Sinh lý thực vật và Di truyền học, Viện
Hàn lâm Khoa học Bulgaria, Sofia 1113, Bulgaria được đăng trên Tạp chí Sinh học
Thổ Nhĩ Kỳ (Turkish Journal of Biology) tháng 1/ 2013. Nghiên cứu cho rằng: Môi
trường MS bổ sung 1.0 mg/l BAP kết hợp với 0.1mg/l là môi trường phù hợp nhất cho
việc nhân nhanh chồi của cây cỏ ngọt in vitro. Và môi trường ½ MS bổ sung 0.1 mg/l
IBA cho kết quả tạo rễ của cây cỏ ngọt in vi tro là tối ưu nhất.
b. Tại việt nam
Cây cỏ ngọt là loại cây mới có mặt ở nước ta khoảng 20 năm nay. Việc nhân
giống cỏ ngọt chủ yếu bằng phương pháp gieo hạt, giâm cành. Việc nghiên cứu

Trang
16
về nhân giống bằng phương pháp in vitro còn ít . Một nghiên cứu quy trình nhân
giống cây cỏ ngọt bằng phương pháp in vitro mới đây của Nguyễn Thị Thu Hậu
và các cộng sự thuộc Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên và Trường Đại học
Tây Nguyên, đã được trình bày tai hội thảo quốc tế về khoa học và công nghệ
phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao của tỉnh Lâm Đồng tháng 3/ 2013.
Kết quả nghiên cứu như sau: Nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt Stevia rebaudianna
Bertoni được hình thành tốt nhất trên môi trường ½ MS có bổ sung 30 g/l đường
sucrose; 7,5 g/l agar; 0,3 mg/l kinetin. Các chồi hình thành rễ cao và chất lượng
rễ tốt nhất trên môi trường ½ MS có bổ sung 15 g/l đường sucrose; 7,5 g/l agar;
0,5 mg/l NAA.
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) 3 tháng tuổi, nhập từ Trường Đại học Nông
nghiệp Hà nội.
3.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ
a. Thiết bị
 Tủ vô trùng  Nồi hấp khử trùng

Trang
17
 Tủ sấy
 Máy đo ph
 Cân điện tử
 Tủ lạnh
 Kệ đặt bình

Trang
18
b. Dụng cụ:
 Pince
 Kéo
 Dao cấy
 Bình thuỷ tinh 400ml
 Đĩa
 Đèn cồn
 Giấy bạc
 Giây thun
 Túi nilon chịu nhiệt
3.1.3. Môi trường nuôi cấy
Các môi trường được sử dụng gồm: MS, ¾ MS, ½ MS, White .
Môi trường ½ MS, ¾ MS là môi trường có phần đa lượng và vi lượng bằng ½
và ¾ của môi trường MS.
Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được sử dụng là: BA, Ki, NAA, IBA
,IAA.
Các thành phần khác:
 Agar: 8g/l
 Đường saccharose : 30g/l
Môi trường được điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,1 (bằng KOH 1N và HCl 1N)
trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm (121℃) trong 25 phút.
3.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro
 Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày
 Nhiệt độ: 25 ± 2°c
 Độ ẩm: 75-80%
 Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux

Trang
19
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp khử trùng
Đoạn thân mang chồi ngủ của cây cỏ ngọt được sử dụng để khử trùng trước
khi cấy vào môi trường
 Bên ngoài tủ cấy:
Đoạn thân cây Cỏ ngọt cắt bỏ lá, cắt thành khúc khoảng 5cm đem rửa bằng xà
bông. Sau đó, rửa sạch xà bông bằng nước máy
Tiếp tục cho mẫu ngâm vào cồn 70° trong 30 giây. Rửa lại bằng nước cất vô
trùng.
 Trong tủ cấy vô trùng:
Ngâm mẫu vào dung dịch hóa chất TCCA (nồng độ 5000ppm- 7000ppm và
thời gian từ 10- 15 phút) cho thêm hai giọt Tween80.
Rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng
 Cấy mẫu
Mẫu cấy là những đoạn thân 1.5 cm có mang chồi nách được cấy có cực vào
môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA với hàm lượng là 0.2
mg/l
3.2.2. Phương pháp thí nghiệm
Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn
ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
a. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ
sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro.
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ chất khử trùng TCCA và thời gian
thích hợp cho việc vô trùng mẫu Cỏ Ngọt nhằm tạo nguồn mẫu sạch ban đầu cho
quá trình nhân giống tiếp theo.

Trang
20
Vật liệu: mẫu thân chứa chồi nách của cây Cỏ Ngọt.
Các nghiệm thức trong thí nghiệm
Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo mẫu Cỏ Ngọt in vitro sạch bệnh
Nghiệ
m thức
Nồng độ TCCA
(ppm)
Thời gian
(phút)
1 5000 10
2 5000 15
3 5000 20
4 6000 10
5 6000 15
6 6000 20
7 7000 10
8 7000 15
9 7000 20
Mỗi nghiệm thức cấy 50 bình, mỗi bình chứa 20ml môi trường.
Mỗi bình cấy 1 mẫu.
Tổng số mẫu là 450 mẫu
Thời gian thí nghiệm là 3 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ mẫu chết (%)
Tỉ lệ mẫu không nhiễm vi sinh vật (%)
Tỉ lệ mẫu sống và mọc chồi (%)

Trang
21
b. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản của cây Cỏ ngọt in vitro
Mục đích thí nghiệm: khảo sát môi trường cơ bản thích hợp cho việc nhân
giống Cỏ Ngọt in vitro
Vật liệu thí nghiệm: các đoạn thân mang chồi nách của cây Cỏ Ngọt đã được
vô trùng ở thí nghiệm 1.
Các nghiệm thức trong thí nghiệm:
Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm tìm môi trường cơ bản cho cây Cỏ Ngọt in
vitro.
Nghiệm
thức
Môi trường
1 White
2 ½ MS
3 ¾ MS
4 MS
Mỗi nghiệm thức cấy 5 bình.
Mỗi bình cấy 15 mẫu. tổng số mẫu: 300 .
Thời gian thí nghiệm 3 tuần.
 Chiều cao của chồi
 Số đốt thân
c. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường lên khả năng tạo chồi
cây Cỏ ngọt in vitro.
Mục đích thí nghiệm: Tìm các chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ phù hợp

Trang
22
để nhân nhanh cây Cỏ ngọt in vitro.
Vật liệu: mẫu cấy được lấy từ chồi Cỏ ngọt in vitro ở thí nghiệm 2.
Thí nghiệm gồm 20 nghiệm thức.
Bảng 3.3 Các nghiệm trong thí nghiệm nhân nhanh chồi thức nhân nhanh chồi
Nghiệm
thức
Môi
trường
Ki (mg/l) IBA (mg/l)
ĐC ½ MS 0.0 0.0
A1 ½ MS 0.1 0.2
A2 ½ MS 0.5 0.2
A3 ½ MS 1 0.2
A4 ½ MS 2 0.2
A5 ½ MS 3 0.2
Ki (mg/l) NAA (mg/l)
B1 ½ MS 0.1 0.2
B2 ½ MS 0.5 0.2
B3 ½ MS 1 0.2
B4 ½ MS 2 0.2
B5 ½ MS 3 0.2
BA (mg/l) IBA (mg/l)
C1 ½ MS 0.1 0.2
C2 ½ MS 0.5 0.2

Trang
23
C3 ½ MS 1 0.2
C4 ½ MS 2 0.2
C5 ½ MS 3 0.2
BA (mg/l) IAA (mg/l)
D1 ½ MS 0.1 0.2
D2 ½ MS 0.5 0.2
D3 ½ MS 1 0.2
D4 ½ MS 2 0.2
D5 ½ MS 3 0.2
Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình
Mỗi bình cấy 15 mẫu.
Tổng số mẫu: 900 mẫu
Thời gian thí nghiệm: 3 tuần
Số lượng chồi: Số chồi trung bình / mẫu cấy.
Hệ số nhân: Số đốt trung bình/ bình nuôi cấy.
Số đốt thân/mẫu cấy ( hệ số nhân) .
d. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình
thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro.
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ IBA , NAA và IAA thích hợp cho quá
trình tạo rễ của cây Cỏ ngọt in vitro, nhằm chuẩn bị cây con khoẻ mạnh để đưa ra
vườn ươm.
Vật liệu thí nghiệm: Mẫu được lấy từ chồi Cỏ Ngọt ở nghiệm thức tốt nhất của

Trang
24
thí nghiệm 3
Thí nghiệm gồm: 15 nghiệm thức
Bảng 3.4 các nghiệm thức trong thí nghệm tìm môi trường ra rễ cho cây Cỏ Ngọt in
vitro
Nghiệm thức Môi
trường
IBA
(mg/l)
ĐC ½ MS 0.0
E1 ½ MS 0.2
E2 ½ MS 0.5
E3 ½ MS 1.0
E4 ½ MS 3.0
E5 ½ MS 5.0
NAA
(mg/l)F1 ½ MS 0.2
F2 ½ MS 0.5
F3 ½ MS 1.0
F4 ½ MS 3.0
F5 ½ MS 5.0
IAA
(mg/l)
G1 ½ MS 0.2
G2 ½ MS 0.5
G3 ½ MS 1.0
G4 ½ MS 3.0
G5 ½ MS 5.0
Mỗi nghiệm thức cấy 4 bình
Mỗi bình cấy 10 mẫu
Tổng số mẫu: 600 mẫu Thời gian thí nghiệm: 4 tuần

Trang
25
Số rễ /cây (rễ): Đếm tất cả rễ ở mỗi cây khi 60% số cây đã ra rễ
Chiều dài rễ (cm): Đo chiều dài rễ sau 4 tuần nuôi cấy
3.2.3. Phân tích thống kê
Số liệu thu thập được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình SPSS 16.0 .
Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt
giữa các nghiệm thức (Bằng phương pháp LSD)
3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2012 - 06/2013 tại viện Công nghệ sinh học
và Thực Phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp. HCM.

Trang
26
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ
sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro.
Do nguồn mẫu ban đầu không sạch, lấy từ tự nhiên còn lẫn bùn, đất, không
vô trùng, dễ mang mầm bệnh, nên việc khử trùng mẫu là một bước quan trọng
để đảm bảo cho nguồn nguyên liệu sạch của quá trình nhân giống in vitro.
Bảng 4.1 Kết quả nghiệm thức khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu Cỏ ngọt
bằng chất khử trùng TCCA
Nồng độ chất
khử trùng
TCCA (ppm)
Thời
gian
Mẫu
chết
(%)
mẫu nhiễm
VSV (%)
mẫu sống
và mọc chồi (%)
5000 ppm
10
phút
4 86 10
15
phút
8 54 38
20
phút
42 20 38
6000 ppm
10
phút
8 74 18
15
phút
10 42 48
20
phút
50 16 34
7000 ppm
10
phút
10 64 26
15
phút
18 40 42

Trang
27
20
phút
58 16 26
Từ kết quả của bảng 4.1 cho thấy:
Nồng độ 5000 ppm, thời gian xử lý ở 15 phút và 20 phút có tỉ lệ mẫu sống và mọc
chồi cao nhất là 38%
Nồng độ 6000 ppm, thời gian xử lý ở 15 phút cho tỉ lệ mẫu sống và mọc chồi cao
nhất là 48%
Nồng độ 7000 ppm, thời gian xử lý ở 15 phút cho tỉ lệ mẫu sống và mọc chồi cao
nhất là 42%.
Theo chúng tôi có thể ở nồng độ 6000ppm và thời gian 15 đủ để hàm lượng Clo
trong TCCA diệt hiệu quả tế bào vi sinh vật nhưng không ảnh hưởng đến sức sống của
mẫu.
Hình 4.1 Các dạng mẫu trong thí nghiệm khử trùng mẫu: a. mẫu sống và mọc chồi;
b. mẫu nhiễm VSV; c. mẫu chết.
4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản phù hợp cho sự sinh trưởng
và phát triển cây Cỏ ngọt in vitro

Trang
28
Bảng 4.2 Kết quả của thí nghiệm tìm môi trường cơ bản tối ưu cho cây Cỏ ngọt in vitro
Nghiệm
thức
Môi
trường
Chiều cao
chồi (cm)
Số đốt
thân/mẫu
cấy
1 White 2.53a
4.57b
2 ½ MS 4.77d 5.03c
3 ¾ MS 4.57c
4.97c
4 MS 3.80b
3.93a
*Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự
khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
Nhận xét: Qua bảng 4.2 cho thấy ở nghiệm thức 2 ( ½ MS) cho chiều cao chồi và
số đốt thân trung bình là cao nhất 4.77 cm, và 5.03 chồi, cao hơn so với các nghiệm
thức còn lại.
Theo chúng tôi có thể ở nồng độ và tỷ lệ các chất khoáng đa lượng và vi lượng
trong môi trường ½ MS phù hợp hơn cho quá trình trao đổi chất trong tế bào cây cỏ
ngọt, nên sự hình thành chồi và vươn cao chồi vượt trội hơn so với các môi trường
còn lại trong thí nghiệm.

Trang
29
Hình 4.2 Kết quả nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng
lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro.
Việc nhân chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lượng lớn cây con in
vitro làm nguyên liệu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Đây là quá trình quan
trọng và cũng có thể nói đây là nhiệm vụ của nhân giống vô tính.
Thật ra, bản thân thực vật có khả năng tự tổng hợp và điều chỉnh các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật thích hợp với mỗi thời kỳ sinh trưởng, phát triển, với thời tiết khí
hậu, điều kiện sống. Vai trò của các chất sinh trưởng thể hiện ở nhiều mặt như điều
khiển vận động, điều khiển quá trình ra hoa, các hoạt động sinh lý, sinh hóa trong cơ
thể thực vật (Oparin, 1977; Marosti Mihaly, 1976; Nguyễn Văn Uyển, 1995). Đối với
mô nuôi cấy trong tình trạng dị dưỡng, khả năng tự tổng hợp và điều chỉnh các chất
điều hòa sinh trưởng là rất hạn chế, cần bổ sung những chất này vào môi trường nuôi
cấy một lượng phù hợp. Tùy vào mỗi loại mô cấy, loại cây, thời gian phát triển của
mô cấy và mục đích nuôi cấy mà chịu sự ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh
trưởng khác nhau. Tuy nhiên ở hầu hết các đối tượng thực vật, tỷ lệ hình thành chồi sẽ

Trang
30
tố hơn nếu trong môi trường nuôi cấy có bổ sung vừa Cytokinin và một lượng nhỏ
Auxin(Vũ Văn Vụ, 1999).
Trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát lượng Auxin bổ sung cùng với
Citokinin trong tạo chồi rất nhiều nồng độ khác nhau, tuy nhiên vì đồ án quá dài và
nhiều nội dung nên những kết quả không khả quan chúng tôi lượt bỏ bớt, chỉ nêu ra
những nghiệm thức khả quan.
4.3.1. Thí nghiệm 3a: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung Ki kết hợp
với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro.
Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có sự bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2
mg/l IBA
Nghiệm
thức
Ki
(mg/l)
IBA
(mg/l
)
Số chồi
(chồi)
Chiều
cao chồi
(cm)
Số đốt
thân/mẫu cấy
(hệ số nhân)
ĐC 0 0 1.93a
5.17d 8.97a
A1 0.1 0.2 2.5b
5.33d
11.33b
A2 0.5 0.2 4.03c
3.73c
11.37b
A3 1 0.2 4.6d
2.87b
16.87c
A4 2 0.2 6.66e 2.63b
16.57c
A5 3 0.2 7.17f 2.20a 23.4d
Từ kết quả của bảng 4.3 nhận thấy:
Ở nghiệm thức A5 cho hệ số chồi trung bình (7.17 chồi/ mẫu) và số đốt
thân/mẫu cấy(23.4đốt/mẫu) là cao nhất, cao hơn nghiệm thức đối chứng và các
nghiệm thức còn lại.
Theo chúng tôi có thể ở nồng độ bổ sung 3mg/l Ki và 0.2mg/l IBA vào môi

Trang
31
trường nuôi cấy là phù hợp hơn cho quá trình kích thích sự hấp thu dinh dưỡng và
sự trao đổi chất trong mẫu cấy cây cỏ ngọt, thông qua việc kích thích sinh tổng
hợp các Protein Enzyme của 2 chất là Kinetin và IBA.
Hình 4.3 Chiều cao và số chồi ở các nghiệm thức nhân nhanh chồi trong môi trường có
sự kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA

Trang
32
4.3.2. Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung Ki kết
hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro.
Bảng 4.4 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l
NAA
Nghiệm
thức
Ki
(mg/l)
NAA
(mg/l
)
Số
chồi
(chồi)
Chiều
cao chồi
(cm)
Số đốt
thân/mẫu cấy
(hệ số nhân)
ĐC 0 0 2.00b
5.17c
8.97b
B1 0.1 0.2 3.37c 3.07b 11.83c
B2 0.5 0.2 0.00a
0.00a
0.00a
B3 1 0.2 0.00a
0.00a
0.00a
B4 2 0.2 0.00a
0.00a
0.00a
B5 3 0.2 0.00a
0.00a
0.00a
Theo số liệu của bảng 4.4 cho thấy ở Nghiệm thức B1(0.1mg/lKI và
0.2mg/lNAA) cho hệ số chồi trung bình(3.37 chồi/mẫu) và số đốt thân trung
bình/ mẫu cấy cao nhất (11.83 đốt/ mẫu), cao hơn so với đối chứng và các
nghiệm thức còn lại, tuy nhiên về chiều cao chồi thì thấp hơn so với đối chứng
(5.17 cm). Nếu tính theo hệ số nhân nhanh thì nghiệm thức B1 vẫn hiệu quả hơn
nghiệm thức đối chứng(8.97 so với 11.83 đốt).
Nhìn vào hình 4.4 chúng tôi có nhận xét sơ bộ NAA khi kết hợp với Kinetin
gốc mẫu cấy có sẹo lớn và sự phát triển của chồi hầu như bị ức chế.

Trang
33
Hình 4.4 Nghiệm thức nhân nhanh chồi kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA
4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết
hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro.
Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA
Nghiệm
thức
BA
(mg/l)
IBA
(mg/l
)
Số chồi
(chồi)
Chiều
cao chồi
(cm)
Số đốt
thân/mẫu cấy
(hệ số nhân)
ĐC 0.0 0.0
2.00a 5.15e 8.97e
C1 0.1 0.2
2.10a 4.43d
7.57c
C2 0.5 0.2 2.47b
2.60c
5.93b
C3 1.0 0.2
3.65c 1.77b
8.10d
C4 2.0 0.2
4.06d 1.13a
7.80cd
C5 3.0 0.2 2.39b
1.00a
4.23a

Trang
34
Nhìn vào bảng số liệu bảng 4.5 và hình 4.5 chúng ta dễ dàng nhận thấy: Ở tất
cả các nghiệm thức có chiều cao chồi và số đốt đều thấp hơn so với đối chứng.
Như vậy việc kết hợp giữa Ba và IBA là không phù hợp cho đối tượng cây Cỏ
ngọt trong nuôi cấy in vitro
Hình 4.5 Chiều cao và hình thái chồi trong các nghiệm thức kết hợp giữa BA và 0.2
mg/l IBA
4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết
hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro.
Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA
Nghiệm
thức
BA
(mg/l)
NAA
(mg/l
)
Số
chồi
(chồi)
Chiều cao
chồi (cm)
Số đốt
thân/mẫu cấy
(hệ số nhân)
ĐC 0.0 0.0
1.93b
5.17d 8.97b
D1 0.1 0.2
6.21d 2.53c 15.67c
D2 0.5 0.2 4.74c
1.60b
0.00a

Trang
35
D3 1.0 0.2
0.00a 0.00a
0.00a
D4 2.0 0.2 0.00a
0.00a
0.00a
D5 3.0 0.2 0.00a
0.00a
0.00a
Từ số liệu bảng 4.6 cho thấy: Nghiệm thức D1(0.1mg/l BA) cho số đốt trên
thân trung bình/ mẫu cấy cao nhất (15.67 đốt/mẫu cấy ), Khi tăng nồng độ BA lên
0.5mg/l hoặc cao hơn nữa thì số đốt trên thân giảm và chiều cao chồi cũng giảm
mạnh, có chồi dị dạng(hình 4.6). Theo chúng tôi, một nồng độ quá cao của
BA(đối với cây cỏ ngọt) sẽ kích thích quá mạnh sự phân chia tế bào theo hướng
tăng số lượng nhưng lại giảm sự biệt hóa của các mô để hình thành cấu trúc chồi.
Hình 4.6 Hình thái cây trong các nghiệm thức nhân nhanh chồi có kết hợp giữa BA
và 0.2 mg/l NAA
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình

Trang
36
thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro.
Rễ là một bộ phận quan trọng của cây. Nó có tác dụng hút nước, muối khoáng và
chất dinh dưỡng cung cấp cho cây sinh trưởng và phát triển. Do đó, trong việc tạo cây
in vitro hoàn chỉnh ta phải quan tâm đến bộ rễ của cây, tìm môi trường thật sự thích
hợp cho sự tạo và phát triển của rễ. Cây in vitro có bộ rễ khỏe thì mới có khả năng
sống trong điều kiện vườn ươm do khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm có sự
tác động mạnh mẽ đến cây con in vitro như: ẩm độ, ánh sáng, nhiệt độ, môi trường
thuần hóa không thích hợp,…cây rất dễ bị chết.
4.4.1. Thí nghiệm 4a: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ của
Bảng 4.7 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IBA
Nghiệm
thức
IBA
(mg/l)
Số rễ
(rễ)
Chiều
dài rễ
(cm)
ĐC 0.0 0.27a
0.33a
E1 0.2 3.83b
1.63b
E2 0.5 5.30c
2.43c
E3 1.0 6.63d
1.73b
E4 3.0 3.57b
0.47a
E5 5.0 0.17a
0.17a
Từ bảng số liệu 4.7 nhận thấy: Ở nghiệm thức E3 (1mg/l IBA) cho số rễ
trung bình cao nhất (6.63 rễ/ cây), tuy nhiên chiều dài rễ thì nghiệm thức E2

Trang
37
(0.5mg/l IBA) lại cho kết quả tốt nhất 2.43 cm/rễ. Trong 2 nghiệm thức trên mỗi
nghiệm thức có một yếu tố tốt riêng, chúng tôi đang lập lại nhiều lần để so sánh
và đưa ra kết luận chính xác nên chọn nghiệm thức nào.
Hình 4.7 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung IBA
4.4.2. Thí nghiệm 4b: Khảo sát ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau
đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro.
Bảng 4.8 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung NAA
Nghiệm
thức
NAA
(mg/l)
Số rễ
(rễ)
Chiều
dài rễ
(cm)
ĐC 0.0 0.27a
0.33a
F1 0.2 5.27c
1.30c

Trang
38
F2 0.5 10.63e
4.93e
F3 1.0 9.23d
4.47d
F4 3.0 5.13c
0.83b
F5 5.0 3.73b
0.27a
Nhìn vào bảng số liệu 4.8 và hình 4.8 dễ dàng nhận thấy: Nghiệm thức bổ
sung 0.5 mg/l NAA(NT F2) là nghiệm thức tốt nhất của môi trường tạo rễ ở thí
nghiệm này.
Có thể ở nồng độ 0.5mg/l NAA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy kết
hợp với lượng Auxin nội sinh vừa đủ để kích thích các tế bào vùng chu luân của
rễ tạo mầm rễ mới và kéo dài rễ, còn ở những nồng độ cao hơn của NAA lại kích
thích mạnh cho sự phân chia tế bào theo hướng tạo thành mô sẹo mà không biệt
hóa hình thành mầm rễ.

Trang
39
Hình 4.8 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung NAA.
4.4.3. Thí nghiệm 4c: Khảo sát ảnh hưởng của IAA đến sự hình thành rễ của
Bảng 4.9 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IAA
Nghiệm
thức
IAA
(mg/l)
Số rễ
(rễ)
Chiều
dài rễ
(cm)

Trang
40
ĐC 0.0 0.27a
0.33a
G1 0.2 2.00b
1.00b
G2 0.5 5.37d
2.27c
G3 1.0 5.87e
2.47c
G4 3.0 4.07c
0.97b
G5 5.0 1.93b
0.37a
Từ số liệu của bảng 4.9 cho thấy: Số rễ và chiều dài rễ tăng khi nồng độ IAA
được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tăng dần, số rễ và chiều dài rễ đạt tốt nhất
ở nghiệm thức G3(5.87 rễ, 2.47cm). Tuy nhiên khi tăng nồng độ IAA lên 3mg/l,
4mg/l, thì Số rễ lẫn chiều dài lại giảm mạnh, đồng thời tại gốc mẫu cấy hình
thành những khối sẹo lớn(hình 4.9), Có thể với nồng độ lớn hơn 1mg/l IAA đã
kích thích cho sự phân chia tế bào mạnh hơn tính biệt hóa các tế bào chu luân
hình thành rễ.

Trang
41
Hình 4.9 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bố sung IAA

Trang
42
PHẦN 5: KẾT LUẬN
 Nồng độ chất khử trùng TCCA là 6000ppm và thời gian khử trùng 15 phút là
phù hợp nhất để khử trùng mẫu thân cây Cỏ Ngọt.
 Môi trường cơ bản phù hợp nhất cho sự phát triển của cây Cỏ ngọt in vitro là ½
MS.
 Môi trường nhân nhanh chồi của cây Cỏ ngọt in vitro bổ sung kết hợp 3.0 mg/l
Ki và 0.2 mg/l IBA cho hệ số nhân cao nhất.
 Môi trường tạo rễ cho cây Cỏ ngọt in vitro bổ sung 0.5 mg/l NAA cho số rễ và
chiều dài rễ tốt nhất..

Trang
43
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả thí nghiệm trên chúng tôi dưa ra một số kiến nghị sau:
- Lập lại thí nghiệm tạo chồi và rễ nhiều lần để đưa ra kết luận chính xác.
- Tiếp tục khảo sát sinh trưởng và phát triển của cây con ngoài vườn ươm.

Trang
44
TÀI LIỆU THAM KHẢO.
Tài liệu trong nước
1. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. Sở khoa học công nghệ
môi trường An Giang.
2. Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia
Thành phố Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Xuân Linh, 1998. Hoa và kỹ thuật trồng hoa. NXB Nông nghiệp Hà Nội
4. Nguyễn Văn Uyển,1995-1996, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật.
Tập 1 (1995), Tập 2 (1996), Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh
5. Nguyễn Văn Uyển, 1993. Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác giống cây
trồng, nhà xuất bản nông nghiệp.
6. Vũ Văn Vụ, 1999. Sinh lý thực vật ứng dụng. Nhà xuất bản giáo dục.
Tài liệu nước ngoài
7. Brown, D. C. W., and Thorpe, T. A., 1986, Plant regeneration by organogenesis,
in: “Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,” Vol. 3, I. K. Vasil, ed.,
Academic Press, Inc., New York
8. Doerschung, M. R. and Miller, C. O. (1967) Chemical control of adventitious
organ formation in Lactuca sativa explants.
9. ECONOMOU A.S., READ P.E., 1986. Microcutting production from sequential
reculturing of hardy deciduous azalea shoot tips
10.Jaramillo J, Summers WL. 1990. Tomato anther callus production: solidifying
agent and concentration influence induction of callus.
11. Gamborg, O.L., T. Murashige, T.A. Thorpe, and I. K. Vasil, 1976. Plant tissue culture
media. In Vitro 12:473–8.
12. Morel, G. and Martin, C. 1952. Virus-free Dahlia through meristem culture. C.R. Hebd.
Seances Acad. Sci. Paris 235: 1324-1325.
13.Miller LR, Murashige T. 1976 Tissue culture propagation of tropical foliage
plants.
14.Miller L.R. & Murashige T., In Vitro, (1976)

Trang
45
15.MURASHIGE, T. 1974. Plant propagation through tissue culture. Ann. Rev. Plant
Physiol.
16.MURASHIGE T., SKOOG F., 1962. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum,
17.Nobecourt, P., 1939, Su la perennite, et l’ angmentation de volumes des cultures
de tissues vegetaux. Compte rendu de la societe de biologic
18.PAPACHATZI, M., P. ALLEN and P. HASEWAGA. In vitro propagation
of Hosta decorata`Thomas Hogg' using cultured shoot tips. HortScience 106(2).
1981.
19.Wilson, H.M. and Street, H.E. (1974). The growth, anatomy and morphogenetic
potential of callus and cell suspension cultures of Hevea brasiliensis
20.White, P. R. (1939) Potentially unlimited growth of excised plant callus in an
artificial nutrient.
21.Thorpe, T. A., 1980, Organogenesis in vitro: Structural, physiological and
biochemical aspects, Int. Rev. Cytol. (Suppl.), 11A:71–111.
22.Thorpe, T. A., 1988, Physiology of bud induction in conifers in vitro, in: “Genetic
Manipulation of Woody Plants,” J. W. Hanover and D. E. Keathley, eds., Plenum
Publishing Corporation.
Tài liệu từ Internet.
Nghiên cứu công nghệ sản xuất giống cây cỏ ngọt (STEVIA REBAUDIANA
BERTONI) IN VITRO
(http://dalat.gov.vn/web/Portals/0/2013/kyyeuNNCNCIN.pdf)
http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-quy-trinh-san-xuat-duong-an-kieng-tu-cay-co-ngot-
1825/
https://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad
=rja&ved=0CDEQFjAB&url=http%3A%2F%2Fxa.yimg.com%2Fkq%2Fgroups%2F
22729997%2F1014075913%2Fname%2FUNKNOWN_PARAMETER_VALUE&ei=
ljOUbLgHs_slAWfmoHwBg&usg=AFQjCNFy0nIR2n1l6QK6T1dPKX2NUHKq7Q

Trang
46
&bvm=bv.48572450,d.dGI
http://www.vietnam.vn/Thongtin/Toc-Do-Do-Thi-Hoa-Lam-Tang-So-Benh-Nhan-
Tieu-Duong-O-Viet-Nam.html
http://www.phununet.com/WikiPhununet/ChiTietWiKi.aspx?m=0&StoreID=1
3037
http://www.duoclieuviet.vn/huong-dan-nuoi-trong-duoc-lieu/ky-thuat-trong-
co-ngot.html#.Uc5XJaJkODQ
http://steviaventures.com/
http://www.ykhoa.net/yhoccotruyen/baiviet/29_321.htm
http://globalstevia.vn/

Trang
47
PHỤ LỤC
Bảng môi trường MS
Thành phần môi trường
MS
Khối lượng
(mg/L)
CoCl2.6H2O 0.025
CuSO4.5H20 0.025
FeNaDTA 36.7
H3BO3 6.2
KI 0.83
MnSO4.H2O 16.9
NaMoO4.2H2O 0.25
ZnSO4.7H2O 8.6
CaCl2 332.02
KH2PO4 170
KNO3 1900
MgSO4 180.54
NH4NO4 1650
Glycine 1650
MyO-Inositol 1650
Nicotine acid 1650
Pyridoxine HCl 1650
Thiamin acid 1650

Trang
48
Bảng môi trường White
Thành phần môi trường
WHITE
Khối lượng
(mg/L)
KNO3 80
Ca(NO3).4H2O 300
KCl 65
NaH2PO4.H2O 16.8
MgSO4.7H2O 720.78
FeSO4.7H2O 3.47
MnSO4.H2O 5.31
ZnSO4.7H2O 2.67
H3BO3 1.5
FeSO4.7H2O 3.47
MnSO4.H2O 5.31
ZnSO4.7H2O 2.67
H3BO3 1.5
KI 0.75
MyO-inositol 100
Glysine 2
Pyrydoxin-HCl 0.5
Thiamin-HCl 0.1
Nicotine
0.5

Trang
49
Bảng số liệu thô của các thí nghiệm
- Bảng số liệu thí nghiệm khảo sát thời gian và nồng độ chất khử trùng TCCA.
Nồng độ
TCCA
Thời gian
Mẫu chết
(%)
mẫu nhiễm
VSV (%)
mẫu sống
và mọc chồi
(%)
5000 ppm
10 phút 4 86 10
15 phút 8 54 38
20 phút 42 20 38
6000 ppm
10 phút 8 74 18
15 phút 10 42 48
20 phút 50 16 34
7000 ppm
10 phút 10 64 26
15 phút 18 40 42
20 phút 58 16 26
- Bảng số liệu của thí nghiệm khảo sát môi trường cơ bản phù hợp với cây cỏ
ngọt in vitro.
Bảng số liệu tổng đốt thân trung bình/mẫu cấy của các nghiệm thức tìm môi trường cơ
bản cho cỏ ngọt in vitro
Số đốt thân trung bình/mẫu cấy
Nghiệm
thức
lần 1 lần 2 lần 3
1 4.5 4.7 4.5
2 5.0 5.1 5.0
3 5.2 4.9 4.8
4 4.0 3.8 4.0

Trang
50
Bảng số liệu chiều cao trung bình/chồi của các nghiệm thức tìm môi trường cơ bản
cho cỏ ngọt in vitro
Chiều cao trung bình/chồi
Nghiệm
thức
lần 1 lần 2 lần 3
1 2.6 2.5 2.5
2 4.8 4.8 4.7
3 4.6 4.4 4.7
4 3.8 3.7 3.9
- Bảng số liệu của thí nghiệm khảo sát nồng độ CĐHST phù hợp với môi trường
nhân nhanh chồi.
Số chồi
Nghiệm thức
kết quả trung bình của các lần lặp lại
kết quả lần1 kết quả lần 2 kết quả lần 3
ĐC 2 2 1.8
A1 2.3 2.7 2.5
A2 3.9 4 4.2
A3 4.71 4.5 4.6
A4 6.67 6.5 6.8
A5 7 7.1 7.4
B1 3.26 3.4 3.45
B2 0 0 0
B3 0 0 0
B4 0 0 0
B5 0 0 0

Trang
51
C1 2.1 2.2 2
C2 2.3 2.5 2.6
C3 3.64 3.5 3.8
C4 3.97 4 4.2
C5 2.56 2.2 2.4
D1 6.22 6 6.4
D2 4.71 4.8 4.7
D3 0 0 0
D4 0 0 0
D5 0 0 0
Chiều cao chồi
Nghiệm
thức
kết quả lần1
kết quả lần
2
kết quả lần
3
ĐC 5 5.3 5.2
A1 5.1 5.4 5.5
A2 3.8 3.8 3.6
A3 2.8 2.9 2.9
A4 2.5 2.6 2.8
A5 2.2 2.3 2.1
B1 3 3.3 2.9
B2 0 0 0
B3 0 0 0

Trang
52
B4 0 0 0
B5 0 0 0
C1 4.4 4.3 4.6
C2 2.5 2.8 2.5
C3 1.7 1.6 2
C4 1.2 1.1 1.1
C5 1 0.8 1.2
D1 2.6 2.5 2.5
D2 1.8 1.6 1.4
D3 0 0 0
D4 0 0 0
D5 0 0 0
Số đốt thân
Nghiệm
thức
ĐC 9.2 8.7 9
A1 11.3 11.5 11.2
A2 10.4 11.6 12.1
A3 17.1 17 16.5
A4 17.2 14.5 18
A5 24.7 22 23.5
B1 12 13 10.5

Trang
53
B2 0 0 0
B3 0 0 0
B4 0 0 0
B5 0 0 0
C1 7.5 8 7.2
C2 5.9 6 5.9
C3 7.9 8.1 8.3
C4 7.6 8 7.8
C5 4.2 4.5 4
D1 14.4 16 16.6
D2 0 0 0
D3 0 0 0
D4 0 0 0
D5 0 0 0
Bảng số liệu của thí nghiệm khảo sát nồng độ CĐHST phù hợp với môi trường tạo rễ
số rễ
Nghiệm thức
ĐC 0.3 0 0.5
E1 3.6 4.1 3.8
E2 5.1 5.2 5.6
E3 6.6 6.5 6.8
E4 3.3 3.6 3.8
E5 0 0.3 0.2

Trang
54
F1 5.5 5 5.3
F2 10.5 11 10.4
F3 9 9.5 9.2
F4 5.5 5 4.9
F5 3.5 4 3.7
G1 1.8 2.3 1.9
G2 5.4 5.2 5.5
G3 5.9 5.7 6
G4 4.1 3.9 4.2
G5 2.1 1.7 2
Nghiệm thức kết hợp giữa IBA và Ki
chiều dài rễ
Nghiệm thức
ĐC 0.5 0 0.5
E1 1.5 1.8 1.6
E2 2.2 2.6 2.5
E3 1.6 1.7 1.9
E4 0.5 0.4 0.5
E5 0 0.3 0.2
F1 1.2 1.5 1.2
F2 5 4.9 4.9
F3 4.6 4.5 4.3

Trang
55
F4 0.7 0.8 1
F5 0.4 0.2 0.2
G1 0.9 1.3 0.8
G2 2.5 2.1 2.2
G3 2.3 2.6 2.5
G4 1.1 1 0.8
G5 0.3 0.3 0.5

Trang
56
Bảng kết quả xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 16.0
ONEWAY Chieu_cao_choi BY Nghiem_thuc
/STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY
/MISSING ANALYSIS
/POSTHOC=DUNCAN LSD DUNNETT (1) ALPHA(0.05).
Oneway
Descriptives
Chieu_cao_choi
N Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
95% Confidence Interval for
Mean
Minimum MaximumLower Bound Upper Bound
White 3 2.5333 .05774 .03333 2.3899 2.6768 2.50 2.60
1/2 MS 3 4.7667 .05774 .03333 4.6232 4.9101 4.70 4.80
3/4 MS 3 4.5667 .15275 .08819 4.1872 4.9461 4.40 4.70
MS 3 3.8000 .10000 .05774 3.5516 4.0484 3.70 3.90
Total 12 3.9167 .91932 .26539 3.3326 4.5008 2.50 4.80
Test of Homogeneity of Variances
Chieu_cao_choi
Levene Statistic df1 df2 Sig.
1.333 3 8 .330

Trang
57
ANOVA
Chieu_cao_choi
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 9.217 3 3.072 307.222 .000
Within Groups .080 8 .010
Total 9.297 11
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
Dependent Variable:Chieu_cao_choi
(I)
Nghiem_t
huc
(J)
Nghiem_t
huc
Mean
Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound
LSD White 1/2 MS -2.23333*
.08165 .000 -2.4216 -2.0450
3/4 MS -2.03333*
.08165 .000 -2.2216 -1.8450
MS -1.26667*
.08165 .000 -1.4550 -1.0784
1/2 MS White 2.23333*
.08165 .000 2.0450 2.4216
3/4 MS .20000*
.08165 .040 .0117 .3883
MS .96667*
.08165 .000 .7784 1.1550
3/4 MS White 2.03333*
.08165 .000 1.8450 2.2216
1/2 MS -.20000*
.08165 .040 -.3883 -.0117
MS .76667*
.08165 .000 .5784 .9550
MS White 1.26667*
.08165 .000 1.0784 1.4550
1/2 MS -.96667*
.08165 .000 -1.1550 -.7784
3/4 MS -.76667* .08165 .000 -.9550 -.5784

Trang
58
Dunnett t (2-sided)a
1/2 MS White 2.23333*
.08165 .000 1.9982 2.4685
3/4 MS White 2.03333*
.08165 .000 1.7982 2.2685
MS White 1.26667*
.08165 .000 1.0315 1.5018
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it.
Homogeneous Subsets
Chieu_cao_choi
Nghiem_t
huc N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3 4
Duncana
White 3 2.5333
MS 3 3.8000
3/4 MS 3 4.5667
1/2 MS 3 4.7667
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

Trang
59
ONEWAY So_dot_than BY Nghiem_thuc
/MISSING ANALYSIS
Oneway
Descriptives
So_dot_than
N Mean
Std.
Deviation Std. Error
Mean
White 3 4.5667 .11547 .06667 4.2798 4.8535 4.50 4.70
1/2 MS 3 5.0333 .05774 .03333 4.8899 5.1768 5.00 5.10
3/4 MS 3 4.9667 .20817 .12019 4.4496 5.4838 4.80 5.20
MS 3 3.9333 .11547 .06667 3.6465 4.2202 3.80 4.00
Total 12 4.6250 .47122 .13603 4.3256 4.9244 3.80 5.20
So_dot_than
2.429 3 8 .140
ANOVA
So_dot_than
Between Groups 2.296 3 .765 41.742 .000
Total 2.443 11

Trang
60
Post Hoc Tests
Dependent
Variable:So_dot_than
(I)
Nghiem
_thuc
(J)
Nghiem
_thuc
Mean Difference
LSD White 1/2 MS -.46667*
.11055 .003 -.7216 -.2117
3/4 MS -.40000*
.11055 .007 -.6549 -.1451
MS .63333*
.11055 .000 .3784 .8883
1/2 MS White .46667*
.11055 .003 .2117 .7216
3/4 MS .06667 .11055 .563 -.1883 .3216
MS 1.10000*
.11055 .000 .8451 1.3549
3/4 MS White .40000*
.11055 .007 .1451 .6549
1/2 MS -.06667 .11055 .563 -.3216 .1883
MS 1.03333*
.11055 .000 .7784 1.2883
MS White -.63333*
.11055 .000 -.8883 -.3784
1/2 MS -1.10000*
.11055 .000 -1.3549 -.8451
3/4 MS -1.03333*
.11055 .000 -1.2883 -.7784
Dunnett t
(2-sided)a
1/2 MS White .46667*
.11055 .007 .1483 .7850
3/4 MS White .40000*
.11055 .017 .0816 .7184
MS White -.63333*
.11055 .001 -.9517 -.3150
a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it.

Trang
61
Homogeneous Subsets
So_dot_than
Nghiem_t
huc N
1 2 3
Duncana
MS 3 3.9333
White 3 4.5667
3/4 MS 3 4.9667
1/2 MS 3 5.0333
Sig. 1.000 1.000 .563

Trang
62
ONEWAY So_Choi BY Nghiem_thuc
/MISSING ANALYSIS
Oneway
Descriptives
So_Choi
N Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
Mean
0.0 Ki + 0.0 IBA 3 1.9333 .11547 .06667 1.6465 2.2202 1.80 2.00
0.1 Ki + 0.2 IBA 3 2.5000 .20000 .11547 2.0032 2.9968 2.30 2.70
0.5 Ki + 0.2 IBA 3 4.0333 .15275 .08819 3.6539 4.4128 3.90 4.20
1.0 Ki + 0.2 IBA 3 4.6033 .10504 .06064 4.3424 4.8643 4.50 4.71
2.0 Ki + 0.2 IBA 3 6.6567 .15044 .08686 6.2829 7.0304 6.50 6.80
3.0 Ki + 0.2 IBA 3 7.1667 .20817 .12019 6.6496 7.6838 7.00 7.40
Total 18 4.4822 2.00055 .47153 3.4874 5.4771 1.80 7.40
So_Choi
.456 5 12 .802
ANOVA
So_Choi
Between Groups 67.730 5 13.546 528.911 .000
Total 68.037 17

Trang
63
Post Hoc Tests
Dependent Variable:So_Choi
(I) Nghiem_thuc (J) Nghiem_thuc
Mean
Difference
95% Confidence
Interval
Lower
Bound
Upper
Bound
LSD 0.0 Ki + 0.0 IBA 0.1 Ki + 0.2 IBA -.56667*
.13067 .001 -.8514 -.2820
0.5 Ki + 0.2 IBA -2.10000*
.13067 .000 -2.3847 -1.8153
1.0 Ki + 0.2 IBA -2.67000*
.13067 .000 -2.9547 -2.3853
2.0 Ki + 0.2 IBA -4.72333*
.13067 .000 -5.0080 -4.4386
3.0 Ki + 0.2 IBA -5.23333*
.13067 .000 -5.5180 -4.9486
0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA .56667*
.13067 .001 .2820 .8514
0.5 Ki + 0.2 IBA -1.53333*
.13067 .000 -1.8180 -1.2486
1.0 Ki + 0.2 IBA -2.10333*
.13067 .000 -2.3880 -1.8186
2.0 Ki + 0.2 IBA -4.15667*
.13067 .000 -4.4414 -3.8720
3.0 Ki + 0.2 IBA -4.66667* .13067 .000 -4.9514 -4.3820
0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.10000*
.13067 .000 1.8153 2.3847
0.1 Ki + 0.2 IBA 1.53333*
.13067 .000 1.2486 1.8180
1.0 Ki + 0.2 IBA -.57000*
.13067 .001 -.8547 -.2853
2.0 Ki + 0.2 IBA -2.62333*
.13067 .000 -2.9080 -2.3386
3.0 Ki + 0.2 IBA -3.13333*
.13067 .000 -3.4180 -2.8486
1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.67000*
.13067 .000 2.3853 2.9547
0.1 Ki + 0.2 IBA 2.10333*
.13067 .000 1.8186 2.3880
0.5 Ki + 0.2 IBA .57000*
.13067 .001 .2853 .8547
2.0 Ki + 0.2 IBA -2.05333*
.13067 .000 -2.3380 -1.7686

Trang
64
3.0 Ki + 0.2 IBA -2.56333*
.13067 .000 -2.8480 -2.2786
2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 4.72333*
.13067 .000 4.4386 5.0080
0.1 Ki + 0.2 IBA 4.15667*
.13067 .000 3.8720 4.4414
0.5 Ki + 0.2 IBA 2.62333*
.13067 .000 2.3386 2.9080
1.0 Ki + 0.2 IBA 2.05333*
.13067 .000 1.7686 2.3380
3.0 Ki + 0.2 IBA -.51000*
.13067 .002 -.7947 -.2253
3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 5.23333*
.13067 .000 4.9486 5.5180
0.1 Ki + 0.2 IBA 4.66667*
.13067 .000 4.3820 4.9514
0.5 Ki + 0.2 IBA 3.13333*
.13067 .000 2.8486 3.4180
1.0 Ki + 0.2 IBA 2.56333*
.13067 .000 2.2786 2.8480
2.0 Ki + 0.2 IBA .51000*
.13067 .002 .2253 .7947
Dunnett t
(2-sided)a
0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA .56667*
.13067 .004 .1876 .9458
0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.10000*
.13067 .000 1.7209 2.4791
1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.67000*
.13067 .000 2.2909 3.0491
2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 4.72333*
.13067 .000 4.3442 5.1024
3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 5.23333*
.13067 .000 4.8542 5.6124
a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups
against it.
Homogeneous Subsets
So_Choi
Nghiem_thuc N
1 2 3 4 5 6
Duncana
0.0 Ki + 0.0 IBA 3 1.9333
0.1 Ki + 0.2 IBA 3 2.5000

Trang
65
0.5 Ki + 0.2 IBA 3 4.0333
1.0 Ki + 0.2 IBA 3 4.6033
2.0 Ki + 0.2 IBA 3 6.6567
3.0 Ki + 0.2 IBA 3 7.1667
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Trang
66
ONEWAY Chieu_cao_choi BY Nghiem_thuc
/MISSING ANALYSIS
Oneway
[Descriptives
Chieu_cao_choi
N Mean
Std.
Mean
Minimum MaximumLower Bound
Upper
Bound
0.0 Ki + 0.0 IBA 3 5.1667 .15275 .08819 4.7872 5.5461 5.00 5.30
0.1 Ki + 0.2 IBA 3 5.3333 .20817 .12019 4.8162 5.8504 5.10 5.50
0.5 Ki + 0.2 IBA 3 3.7333 .11547 .06667 3.4465 4.0202 3.60 3.80
1.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.8667 .05774 .03333 2.7232 3.0101 2.80 2.90
2.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.6333 .15275 .08819 2.2539 3.0128 2.50 2.80
3.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.2000 .10000 .05774 1.9516 2.4484 2.10 2.30
Total 18 3.6556 1.25802 .29652 3.0300 4.2812 2.10 5.50
Chieu_cao_choi
1.247 5 12 .347
ANOVA
Chieu_cao_choi
Between Groups 26.671 5 5.334 274.331 .000

Trang
67
[Descriptives
Chieu_cao_choi
N Mean
Std.
Mean
Upper
Bound
0.0 Ki + 0.0 IBA 3 5.1667 .15275 .08819 4.7872 5.5461 5.00 5.30
0.1 Ki + 0.2 IBA 3 5.3333 .20817 .12019 4.8162 5.8504 5.10 5.50
0.5 Ki + 0.2 IBA 3 3.7333 .11547 .06667 3.4465 4.0202 3.60 3.80
1.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.8667 .05774 .03333 2.7232 3.0101 2.80 2.90
2.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.6333 .15275 .08819 2.2539 3.0128 2.50 2.80
3.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.2000 .10000 .05774 1.9516 2.4484 2.10 2.30
Total 26.904 17
Post Hoc Tests
Dependent
Variable:Chieu_cao_choi
Mean
Difference
Lower Bound
Upper
Bound
LSD 0.0 Ki + 0.0 IBA 0.1 Ki + 0.2 IBA -.16667 .11386 .169 -.4147 .0814
0.5 Ki + 0.2 IBA 1.43333*
.11386 .000 1.1853 1.6814
1.0 Ki + 0.2 IBA 2.30000*
.11386 .000 2.0519 2.5481
2.0 Ki + 0.2 IBA 2.53333*
.11386 .000 2.2853 2.7814
3.0 Ki + 0.2 IBA 2.96667*
.11386 .000 2.7186 3.2147
0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA .16667 .11386 .169 -.0814 .4147
0.5 Ki + 0.2 IBA 1.60000*
.11386 .000 1.3519 1.8481

Trang
68
1.0 Ki + 0.2 IBA 2.46667*
.11386 .000 2.2186 2.7147
2.0 Ki + 0.2 IBA 2.70000*
.11386 .000 2.4519 2.9481
3.0 Ki + 0.2 IBA 3.13333*
.11386 .000 2.8853 3.3814
0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -1.43333*
.11386 .000 -1.6814 -1.1853
0.1 Ki + 0.2 IBA -1.60000*
.11386 .000 -1.8481 -1.3519
1.0 Ki + 0.2 IBA .86667*
.11386 .000 .6186 1.1147
2.0 Ki + 0.2 IBA 1.10000*
.11386 .000 .8519 1.3481
3.0 Ki + 0.2 IBA 1.53333*
.11386 .000 1.2853 1.7814
1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.30000*
.11386 .000 -2.5481 -2.0519
0.1 Ki + 0.2 IBA -2.46667*
.11386 .000 -2.7147 -2.2186
0.5 Ki + 0.2 IBA -.86667*
.11386 .000 -1.1147 -.6186
2.0 Ki + 0.2 IBA .23333 .11386 .063 -.0147 .4814
3.0 Ki + 0.2 IBA .66667*
.11386 .000 .4186 .9147
2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.53333*
.11386 .000 -2.7814 -2.2853
0.1 Ki + 0.2 IBA -2.70000*
.11386 .000 -2.9481 -2.4519
0.5 Ki + 0.2 IBA -1.10000*
.11386 .000 -1.3481 -.8519
1.0 Ki + 0.2 IBA -.23333 .11386 .063 -.4814 .0147
3.0 Ki + 0.2 IBA .43333*
.11386 .003 .1853 .6814
3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.96667*
.11386 .000 -3.2147 -2.7186
0.1 Ki + 0.2 IBA -3.13333*
.11386 .000 -3.3814 -2.8853
0.5 Ki + 0.2 IBA -1.53333*
.11386 .000 -1.7814 -1.2853
1.0 Ki + 0.2 IBA -.66667*
.11386 .000 -.9147 -.4186
2.0 Ki + 0.2 IBA -.43333*
.11386 .003 -.6814 -.1853
Dunnett t
(2-sided)a
0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA .16667 .11386 .480 -.1637 .4970
0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -1.43333*
.11386 .000 -1.7637 -1.1030

Trang
69
1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.30000*
.11386 .000 -2.6303 -1.9697
2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.53333*
.11386 .000 -2.8637 -2.2030
3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.96667*
.11386 .000 -3.2970 -2.6363
against it.
Homogeneous Subsets
Chieu_cao_choi
Nghiem_thuc N
1 2 3 4
Duncana
3.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.2000
2.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.6333
1.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.8667
0.5 Ki + 0.2 IBA 3 3.7333
0.0 Ki + 0.0 IBA 3 5.1667
0.1 Ki + 0.2 IBA 3 5.3333
Sig. 1.000 .063 1.000 .169

Trang
70
ONEWAY So_dot_than BY Nghiem_thuc
/MISSING ANALYSIS
Oneway
Descriptives
So_dot_than
N Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
Mean
0.0 Ki + 0.0 IBA 3 8.9667 .25166 .14530 8.3415 9.5918 8.70 9.20
0.1 Ki + 0.2 IBA 3 11.3333 .15275 .08819 10.9539 11.7128 11.20 11.50
0.5 Ki + 0.2 IBA 3 11.3667 .87369 .50442 9.1963 13.5370 10.40 12.10
1.0 Ki + 0.2 IBA 3 16.8667 .32146 .18559 16.0681 17.6652 16.50 17.10
2.0 Ki + 0.2 IBA
3 16.5667 1.83394
1.0588
3
12.0109 21.1224 14.50 18.00
3.0 Ki + 0.2 IBA 3 23.4000 1.35277 .78102 20.0395 26.7605 22.00 24.70
Total
18 14.7500 5.02819
1.1851
5
12.2495 17.2505 8.70 24.70
So_dot_than
3.735 5 12 .029

Trang
71
ANOVA
So_dot_than
Between Groups 417.512 5 83.502 81.510 .000
Within Groups 12.293 12 1.024
Total 429.805 17
Post Hoc Tests
Dependent
Variable:So_dot_than
Mean
Difference (I-J) Std. Error Sig.
LSD 0.0 Ki + 0.0 IBA 0.1 Ki + 0.2 IBA -2.36667*
.82642 .014 -4.1673 -.5661
0.5 Ki + 0.2 IBA -2.40000*
.82642 .013 -4.2006 -.5994
1.0 Ki + 0.2 IBA -7.90000*
.82642 .000 -9.7006 -6.0994
2.0 Ki + 0.2 IBA -7.60000*
.82642 .000 -9.4006 -5.7994
3.0 Ki + 0.2 IBA -14.43333*
.82642 .000 -16.2339 -12.6327
0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.36667*
.82642 .014 .5661 4.1673
0.5 Ki + 0.2 IBA -.03333 .82642 .968 -1.8339 1.7673
1.0 Ki + 0.2 IBA -5.53333*
.82642 .000 -7.3339 -3.7327
2.0 Ki + 0.2 IBA -5.23333*
.82642 .000 -7.0339 -3.4327
3.0 Ki + 0.2 IBA -12.06667*
.82642 .000 -13.8673 -10.2661

Trang
72
0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.40000*
.82642 .013 .5994 4.2006
0.1 Ki + 0.2 IBA .03333 .82642 .968 -1.7673 1.8339
1.0 Ki + 0.2 IBA -5.50000*
.82642 .000 -7.3006 -3.6994
2.0 Ki + 0.2 IBA -5.20000*
.82642 .000 -7.0006 -3.3994
3.0 Ki + 0.2 IBA -12.03333*
.82642 .000 -13.8339 -10.2327
1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 7.90000*
.82642 .000 6.0994 9.7006
0.1 Ki + 0.2 IBA 5.53333*
.82642 .000 3.7327 7.3339
0.5 Ki + 0.2 IBA 5.50000*
.82642 .000 3.6994 7.3006
2.0 Ki + 0.2 IBA .30000 .82642 .723 -1.5006 2.1006
3.0 Ki + 0.2 IBA -6.53333*
.82642 .000 -8.3339 -4.7327
2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 7.60000*
.82642 .000 5.7994 9.4006
0.1 Ki + 0.2 IBA 5.23333*
.82642 .000 3.4327 7.0339
0.5 Ki + 0.2 IBA 5.20000*
.82642 .000 3.3994 7.0006
1.0 Ki + 0.2 IBA -.30000 .82642 .723 -2.1006 1.5006
3.0 Ki + 0.2 IBA -6.83333*
.82642 .000 -8.6339 -5.0327
3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 14.43333*
.82642 .000 12.6327 16.2339
0.1 Ki + 0.2 IBA 12.06667*
.82642 .000 10.2661 13.8673
0.5 Ki + 0.2 IBA 12.03333*
.82642 .000 10.2327 13.8339
1.0 Ki + 0.2 IBA 6.53333*
.82642 .000 4.7327 8.3339
2.0 Ki + 0.2 IBA 6.83333*
.82642 .000 5.0327 8.6339
Dunnett
t (2-
sided)a
0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.36667 .82642 .053 -.0310 4.7643
0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.40000*
.82642 .050 .0024 4.7976
1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 7.90000*
.82642 .000 5.5024 10.2976
2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 7.60000*
.82642 .000 5.2024 9.9976
3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 14.43333*
.82642 .000 12.0357 16.8310

Trang
73
against it.
Homogeneous Subsets
So_dot_than
Nghiem_thuc N
1 2 3 4
Duncana
0.0 Ki + 0.0 IBA 3 8.9667
0.1 Ki + 0.2 IBA 3 11.3333
0.5 Ki + 0.2 IBA 3 11.3667
2.0 Ki + 0.2 IBA 3 16.5667
1.0 Ki + 0.2 IBA 3 16.8667
3.0 Ki + 0.2 IBA 3 23.4000
Sig. 1.000 .968 .723 1.000

Trang
74
ONEWAY So_choi BY Nghiem_thuc
/MISSING ANALYSIS
Oneway
Descriptives
So_choi
N Mean
Std.
Mean
Upper
Bound
0.0 Ki + 0.0 NAA 3 1.9333 .11547 .06667 1.6465 2.2202 1.80 2.00
0.1 Ki + 0.2 NAA 3 3.3700 .09849 .05686 3.1253 3.6147 3.26 3.45
0.5 Ki + 0.2 NAA 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00
1.0 Ki + 0.2 NAA 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00
2.0 Ki + 0.2 NAA 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00
3.0 Ki + 0.2 NAA 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00
Total 18 .8839 1.35619 .31966 .2095 1.5583 .00 3.45
So_choi
10.278 5 12 .001

Trang
75
ANOVA
So_choi
Between Groups 31.221 5 6.244 1.627E3 .000
Total 31.267 17
Post Hoc Tests
Dependent Variable:So_choi
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error Sig.
LSD 0.0 Ki + 0.0 NAA 0.1 Ki + 0.2 NAA -1.43667*
.05059 .000 -1.5469 -1.3264
0.5 Ki + 0.2 NAA 1.93333*
.05059 .000 1.8231 2.0436
1.0 Ki + 0.2 NAA 1.93333*
.05059 .000 1.8231 2.0436
2.0 Ki + 0.2 NAA 1.93333*
.05059 .000 1.8231 2.0436
3.0 Ki + 0.2 NAA 1.93333*
.05059 .000 1.8231 2.0436
0.1 Ki + 0.2 NAA 0.0 Ki + 0.0 NAA 1.43667*
.05059 .000 1.3264 1.5469
0.5 Ki + 0.2 NAA 3.37000*
.05059 .000 3.2598 3.4802
1.0 Ki + 0.2 NAA 3.37000*
.05059 .000 3.2598 3.4802
2.0 Ki + 0.2 NAA 3.37000* .05059 .000 3.2598 3.4802

Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562

Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562

Empfohlen

Empfohlen

Weitere ähnliche Inhalte

Was ist angesagt?

Was ist angesagt? (20)

Andere mochten auch

Andere mochten auch (20)

Ähnlich wie Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562

Ähnlich wie Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562 (20)

Mehr von Trần Đức Anh

Mehr von Trần Đức Anh (17)

Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562