1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
Técnicas em Biologia Molecular
2. Técnicas em Biologia Molecular
No final da década de 50 os cientistas aprenderam a
caracterizar, manipular e isolar os componentes moleculares
(DNA, RNA, proteínas) de células e microorganismos.
3. Técnicas em Biologia Molecular
•Clonagem
•ELISA
•PCR
•Probind and Blotting (Western blotting)
•Arrays
•Oligonucleotídeos específicos
5. ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
ELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção de
anticorpos/antígenos específicos no plasma sanguíneo. Este teste é
usado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção
de imunoglobulinas.
6. APLICAÇÕ
ES
• Doenç as infecciosas (HIV...)
• Detectar alergia a alimentos (leite, ovo...)
•Identificaç ão de antígenos (hormô nio da gravides, alergia a
drogas...)
• Doenç as auto-imunes
•Concentraç ão sé rica de anticorpos
7. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
1Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou
anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes
de cultura.
2Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de
uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de
quantidades mínimas de uma substância em particular e com
grande confiabilidade.
3Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um
substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno
incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da
concentração de Ag/Ac pesquisados.
8. Componentes
•Anticorpo ou Ag ligado
•Enzima ativa
•Substrato
•Produtos solúveis
2 Enzyme-linked Ab
Serum Ab
Antigen
9. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
1Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços
dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual
Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.
2É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.
http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
10.
11. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
1Elementos necessários para a realização:
2Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)
3Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)
4Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos
5Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado)
– nos ensaios quantitativos
6Amostras a serem testadas
7Placa de poliestireno
8Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag
ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes
9Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima
10 Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação
enzimática, produz cor
11 Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade
de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de
densidade óptica - DO)
14. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
•Vantagens
•Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades
mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na
ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.
•Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste
em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor
risco de falsos-positivos.
•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.
•Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio
em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
15. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
•Desvantagens
•Necessidade de mão de obra especializada.
•Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com
exposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas.
•Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito
susceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos de
incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.
16. PRINCIPAIS TIPOS
•INDIRETO: detecta principalmente Ac
•DIRETO: detecta principalmente Ag
•COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular
(monovalentes)
•CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a
ação do fator reumatóide)
17. 1. ELISA INDIRETO
1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços
2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços
3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os
Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags
4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos
Ags
5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs
6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre
7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela
ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
18. ELISA INDIRETO
1Interpretação dos resultados:
2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da
amostra pesquisada.
3Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doença
pesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio.
Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo os
negativos.
O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele
momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato
com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.
www.labimuno.org.br
19. ELISA INDIRETO
1Aplicações na medicina humana e veterinária:
2Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a
detecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa.
3Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da
Doença de Chagas e da SIDA/AIDS.
4Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da Linfadenite
Caseosa e da Leishmaniose.
5OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação
do fator reumatóide.
21. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE
1Interpretação dos resultados:
2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração
de Ag da amostra pesquisada.
3Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construção
de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir
da reação de padrões com concentrações conhecidas do antígeno
a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para
deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste.
22. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE
•Aplicações na medicina humana e veterinária:
•Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores
tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção
de antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina e
em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.
•Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de
detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).
•Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de
alimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nos
alimentos).
24. Gerações do ELISA
HIV
Terceira geraç ão só detectavam a presenç a de anticorpos ( IgG e IgM) trê ou
s
quatro semanas apó s o contato.
Quarta geraç ão já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV
(a proteína p24), fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela
imunoló gica, podendo chegar a apenas duas semanas.
Um resultado reagente num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado por
outros testes específicos, como é o caso do Western blot, que detecta
proteínas deste vírus, e do PCR, que detecta os seus ácidos nucleicos virais.
25. Os exames de anticorpos sã relatados como positivos ou negativos.
o
O desempenho destes exames é descrito em termos de:
■sensibilidade — a percentagem dos resultados que serão
positivos quando o HIV estiver presente.
■especificidade — a percentagem dos resultados que serão
negativos quando o HIV nã estiver presente.
o
Todos os exames de diagnó stico tê limitaç õ e, algumas vezes, o
m es,
seu uso pode produzir resultados errô neos ou questioná
veis.
■falso positivo — os resultados indicam que o HIV está presente,
quando, na verdade, nã está
o .
■falso negativo — os resultados nã identificam o HIV, que está
o
presente.
O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno . Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidos os antígenos de interesse, juntamente com um tampão de carbonato (processo conhecido como sensibilização). Depois é realizada uma lavagem com PBS . Posteriormente, é feito o bloqueio com PBS Tween com 10% de soro de cabra ou com BSA para que esta ocupe os poços livres (sítios inespecíficos que podem gerar resultados falso positivo ou negativo). Novamente é feita a lavagem. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário - sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína - específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foramEm seguida, o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse. secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse.
O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.